神经干细胞与血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元变化的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管性痴呆患者存在额叶皮质及海马胆碱能神经元受损，可能是导致患者认知功能受损的形态学基础。
目的：探讨神经干细胞与血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元变化的相关性。
方法：纳入90只SD大鼠，随机均分为3组，其中假手术组仅分离颈总动脉，模型组和神经干细胞移植组采用两血管结扎法建立血管性痴呆动物模型，神经干细胞移植组在建立血管性痴呆动物模型之后向大鼠海马CA1区注射5 μL神经干细胞，另外两组按照同样的操作注射相同剂量的生理盐水。移植后第3，7，14，30，60天，分别处死各组6只大鼠，采用S-P免疫组化法检测各组脑实质BrdU阳性细胞和ChAT阳性细胞分布情况，利用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力。
结果与结论：BrdU阳性细胞主要分布在大脑皮质区以及海马区，尤其是血管周围。在基底核和丘脑以及室管膜区，可观察到少量BrdU阳性细胞存在。随着时间的推移，BrdU阳性细胞数目不断下降，到移植后60 d，仅存在少量BrdU阳性细胞存活。移植后不同时间模型组和神经干细胞移植组的ChAT阳性细胞数均显著大于假手术组(P < 0.05)；模型组ChAT阳性细胞数显著低于神经干细胞移植组(P < 0.05)。模型组寻找平台时间显著长于假手术组，穿越平台次数显著少于假手术组(P < 0.05)；神经干细胞移植组的寻找平台时间显著短于模型组，穿越平台次数显著大于模型组(P < 0.05)。结果表明神经干细胞可以在大鼠脑内存活并发生迁移，显著改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，相关机制可能与海马胆碱能神经元分化和生长有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 痴呆, 血管性, 海马胆碱能神经元, 神经干细胞, 干细胞移植, 胆碱乙酰转移酶, 学习记忆能力, 乙酰胆碱, SD大鼠

Abstract:

BACKGROUND: The damage of cholinergic neurons in the frontal cortex and hippocampus in patients with vascular dementia may be the morphological basis of the impairment of cognitive function.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between neural stem cell transplantation and the changes of cholinergic neurons in the hippocampus of rats with vascular dementia.
METHODS: Ninety Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups, 30 rats in model group, 30 in neural stem cell transplantation group and 30 in sham operated group. Vascular dementia models were established by ligation of the common carotid artery in the model and neural stem cell transplantation groups. The common carotid artery was only separated but not ligated in the sham operated group. After modeling, the neural stem cell transplantation group was injected with 5 μL neural stem cells in the hippocampus CA1 area, while the other two groups were injected the same dose of normal saline. At 3, 7, 14, 30, 60 days after treatment, six rats of each group were sacrificed, respectively. Distributions of BrdU positive cells and ChAT positive cells were detected by S-P immunohistochemical method. The learning and memory abilities of rats were detected by Morris water maze system.
RESULTS AND CONCLUSION: BrdU positive cells were mainly distributed in the cortex and hippocampus, especially around the blood vessels, and there was the presence of focal aggregation. A small amount of BrdU positive cells were observed in the basal ganglia and thalamus as well as in the ependyma. BrdU positive cells were counted at different time after operation. The number of BrdU positive cells decreased with time, and only a small number of BrdU positive cells were observed at 60 days after transplantation. The number of ChAT positive cells at different time after transplantation was ranked as follows: neural stem cell transplantation group > model group > sham operated group (P < 0.05). Compared with the model group, the time for searching the platform was significantly lower in the neural stem transplantation group and sham operated group, but the number of crossing the platform was significantly higher in the neural stem cell transplantation group and sham operated group (P < 0.05). The results show that neural stem cells could be transplanted into the rats with vascular dementia, and the cells could survive and migrate in the brain of rats and significantly improve the learning and memory ability. This mechanism may be related to the differentiation and growth of cholinergic neurons in the hippocampus.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析所有实验动物均进入最终的结果分析，未出现中途死亡或者脱落现象。
2.2 新生大鼠神经干细胞形态原代细胞培养第3天，镜下观察可见单个圆形细胞，呈悬浮状，折光性强，边界清晰。培养两三天之后，部分细胞出现死亡，单个细胞数量下降。细胞大多发生分裂，单个细胞增殖形成小细胞球。随着时间的推移，细胞球数量和大小均不断增加(图1)。

2.3 新生大鼠神经干细胞鉴定对新生大鼠神经干细胞球进行Nestin抗体免疫荧光染色，可见细胞球中大多数细胞均呈现Nestin阳性表达，提示实验获得的细胞为神经干细胞(图2)。

2.4 脑实质BrdU阳性细胞分布情况分析在大鼠脑实质中，BrdU阳性细胞主要分布在大脑皮质区以及海马区，尤其是血管周围，并存在聚集情况。在基底核和丘脑以及室管膜区，可观察到少量BrdU阳性细胞存在(图3)。细胞移植后不同时间进行BrdU阳性细胞计数，可见随着时间的推移，BrdU阳性细胞数不断下降，到细胞移植后60 d时，仅存在少量BrdU阳性细胞存活(表1)。

2.5 脑实质ChAT阳性细胞分布细胞移植后不同时间3组大鼠脑实质均存在ChAT阳性细胞。模型组和神经干细胞移植组的ChAT阳性细胞数均显著大于假手术组(P < 0.05)；模型组ChAT阳性细胞数显著低于神经干细胞移植组(P < 0.05)，见表2，图4。

2.6 大鼠学习记忆能力检测结果对3组动物进行学习记忆能力检测，经比较可得模型组的寻找平台时间显著长于假手术组，穿越平台次数显著少于假手术组(P < 0.05)；神经干细胞移植组的寻找平台时间显著短于模型组，穿越平台次数显著大于模型组(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2015年4至7月在河南大学淮河医院完成。
1.3 实验动物和材料 90只成年雌性SD大鼠，体质量180-220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，使用许可证号：scxk(沪)2015-0015。5只新生1-3 d SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.4 实验方法
1.4.1 动物分组与血管性痴呆大鼠模型制作将90只成年SD大鼠随机分为3组，其中模型组30只，神经干细胞移植组30只，假手术组30只。模型组和神经干细胞移植组均采用两血管结扎法建立血管性痴呆动物模型。大鼠常规禁食 12 h、禁水4 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，于颈前部皮肤正中做切口，钝性分离双侧颈总动脉，利用“1”号线对两侧颈总动脉进行结扎，结扎后常规消毒，缝合皮肤。假手术组实施相同的分离操作，仅分离双侧颈总动脉，不结扎。
1.4.2 神经干细胞分离培养取5只新生SD大鼠处死后分离大脑半球，剪碎脑组织，胰蛋白酶消化后置于37 ℃细胞培养箱中消化10 min，移液枪轻轻吹打混匀细胞至不见组织碎片，经200目筛网过滤形成单细胞悬液，以600 r/min离心5 min后弃上清液，加入2 mL无血清培养基(含DMEM/ F12、2%B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素)再次离心，弃去上清，添加无血清培养基进行细胞重悬和计数，以108 L-1接种于培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养，每3 d半量换液1次，约7 d传代1次。培养两三天后，逐渐有细胞球形成，呈悬浮生长，7 d后，600 r/min离心5 min后吸弃旧培养基，加入新鲜培养基，用吸管轻柔吹打细胞球成为小细胞球和单细胞悬液，按量将细胞悬液分别接种到新培养瓶中，1×105/瓶，每7 d传代1次，每3 d离心更换半量培养基1次，培养条件不变。对新生大鼠神经干细胞球进行Nestin抗体免疫荧光染色，进行细胞鉴定。
取第5代细胞接种于DMEM+体积分数为20%胎牛血清培养液中，添加终浓度为10 μmol/L的BrdU，培养48 h，离心收集细胞，添加DMEM+体积分数为20%胎牛血清培养液重悬细胞(终浓度3×1010 L-1)，作为移植细胞备用。
1.4.3 神经干细胞移植造模后30 d，取神经干细胞移植组大鼠，选择右侧海马CA1区为注射点，利用立体定向仪进行准确定位之后，使用微量注射器向大鼠海马CA1区(以前囟为0点，注射点为4 mm，-2 mm，进针深度为4 mm)缓慢注射移植细胞5 μL，注射5 min，留针5 min，以保证移植细胞的弥散。另外两组按照同样的操作注射相同剂量的生理盐水，术后常规进行消毒，并对头皮进行缝合。
1.4.4 免疫组织化学染色观察于移植后第3，7，14，30，60天，各组分别处死6只大鼠，断头取脑，石蜡包埋，以海马CA1区为中心，前后3 mm连续冠状6 μm切片，每隔5片取1片，行免疫组织化学染色，观察BrdU阳性细胞分布情况，体积分数为3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶， 2 mol/L盐酸孵育30 min，小鼠抗BrdU抗体4℃孵育过夜，PBS洗涤之后按照二抗试剂盒操作说明添加二抗进行孵育，DAB显色，中性树胶封固。利用图像分析仪对每张切片进行随机观察，计算10个非重叠视野的BrdU阳性细胞数所占比例。
采用S-P免疫组化法检测移植区域周围ChAT阳性细胞数，体积分数为3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，兔抗鼠ChAT抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗涤之后按照二抗试剂盒操作说明添加二抗进行孵育，DAB显色，中性树胶封固。利用图像分析仪对每张切片进行随机观察，计算10个非重叠视野的ChAT阳性细胞数所占比例。
1.4.5 大鼠学习记忆能力检测移植后第60天，对3组大鼠进行Morris水迷宫系统检测，观察不同大鼠寻找平台所耗费的时间以及穿越平台的次数，并进行记录。
1.5 主要观察指标 ①脑实质BrdU阳性细胞分布情况。②脑实质ChAT阳性细胞分布情况。③学习记忆能力。
1.6 统计学分析实验相关数据均利用统计学软件SPSS 19.0进行处理分析。计量资料予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑血管疾病的病变会累及到皮质或皮质下，引发脑细胞缺血缺氧以及颅内高压，严重影响到人体健康^[8-9]，病因通常与相关脑区的脑创伤、脑出血、脑梗死等相关，同时糖尿病等代谢性疾病引发的血糖、血压、血脂偏高，也容易诱发血管性痴呆^[10-12]。
受到疾病的影响，患者基底前脑和半卵圆中心的相关血管会出现不同程度的低灌注或者是缺血现象，导致患者的胆碱能神经元出现坏死^[13-17]。为此，临床对血管性痴呆患者进行治疗时，要注意采取有效措施对胆碱能神经元进行保护，减少其坏死，以改善患者的临床症状，达到治疗疾病的目的^[18-21]。胆碱乙酰转移酶是中枢神经系统合成的一种特殊的限速酶，可以在胆碱能神经元胞体中合成，是一种重要的胆碱能神经元标志物^[22-25]。随着干细胞理论和相关研究的不断发展，神经干细胞移植修复神经损伤相关问题逐渐引起人们的关注。在鉴定神经干细胞过程中，Nestin蛋白是一种常用的特异性标志抗原。Nestin蛋白即为巢蛋白，属于一种神经元中间丝蛋白，是在中枢神经系统干细胞中发现的^[26-28]。Nestin蛋白的表达开始于神经胚形成时，被认为是神经干细胞的重要阳性标志物^[29]。本实验结果显示，新生大鼠神经干细胞球中大多数细胞均呈现出Nestin阳性表达，提示实验获得的细胞为神经干细胞。
细胞存活、迁移、分化是细胞移植研究的重点。Chu等^[30]采用静脉移植神经干细胞治疗短暂性前脑缺血，结果发现所移植的神经干细胞可以发生迁徙，逐渐到达大鼠的缺血侧海马，并通过增殖、分化，形成成熟的神经元以及星形胶质细胞。相应的神经元可以和大鼠的神经细胞发生整合，并构成嵌合体，替代缺失神经元。研究表明，可以借助相应的标志物对神经干细胞生物学特性进行研究^[31-35]。BrdU属于胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞周期的S期，与细胞一起孵育的BrdU能掺入DNA分子中^[36-37]，BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞^[38]。本实验发现，在大鼠脑实质中，BrdU阳性细胞主要分布在大脑皮质区以及海马区，尤其是血管周围，并存在聚集情况。在基底核和丘脑以及室管膜区，可观察到少量BrdU阳性细胞存在，且得随着时间的推移，BrdU阳性细胞数目不断下降，到细胞移植后60 d，仅存在少量BrdU阳性细胞存活。
实验采用免疫组化染色观察ChAT阳性细胞的分布情况，经检测和观察发现，3组大鼠脑实质均存在ChAT阳性细胞。模型组和神经干细胞移植组的ChAT阳性细胞数均显著大于假手术组(P < 0.05)；模型组ChAT阳性细胞数显著低于神经干细胞移植组(P < 0.05)。上述结果表明神经干细胞移植可以促进血管性痴呆模型动物脑内胆碱能神经细胞数量显著增加。出现这一结果的原因，是因为神经干细胞在移植区域内发生了增殖和分化，并对内源性神经干细胞的分化产生了积极的促进作用。对3组大鼠进行学习记忆能力检测，经比较可得模型组的寻找平台时间显著长于假手术组，穿越平台次数显著少于假手术组(P < 0.05)；神经干细胞移植组的寻找平台时间显著短于模型组，穿越平台次数显著大于模型组(P < 0.05)。这一结果表明，神经干细胞可以在大鼠脑内存活并发生迁移，显著改善其学习记忆能力，分析其相关机制，可能是因为神经干细胞移植可以增加血管性痴呆模型大鼠脑内胆碱能神经细胞，外源性神经干细胞在移植区增殖、分化，并可能促进了内源性神经干细胞的分化，改善了大鼠脑内局部的微环境，使胆碱乙酰转移酶阳性细胞增多，从而有效促进胆碱能神经元分化及生长，乙酰胆碱生成增多，使大鼠海马区神经功能恢复，并促进大鼠学习记忆能力的有效改善。同时，海马区微环境及胆碱能细胞与之相互作用，共同发挥改善动物学习和记忆能力等作用^[39-40]。本研究受到研究时间以及实际条件等因素的影响，相应的观察指标等也较少，所获得的相关结果以及结论等均有可能存在一定的不足之处。
综上，神经干细胞可以在大鼠脑内存活并发生迁移，显著改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，相关机制可能与海马胆碱能神经元分化和生长之间存在一定的关系。