电针刺激对神经干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠后肢功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：单纯的神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复作用并不理想，为了进一步提高移植细胞在体内的存活、增殖及定向分化为神经元的比例，必须进一步改善脊髓损伤区的微环境。
目的：观察神经干细胞移植联合电针刺激对脊髓损伤大鼠后肢功能及电生理的影响。
方法：将脊髓损伤模型SD大鼠72只按随机数字表法分为4组：对照组尾静脉注入培养液，神经干细胞组经尾静脉注入等体积神经干细胞悬液，电针刺激组自模型完成6 h起采用督脉加体穴电针1周，联合组尾静脉注射神经干细胞后，同时采用督脉加体穴电针1周。分别于造模前、造模后1，3 d、1-4 周通过BBB评分、斜板试验进行运动功能评定。造模后4周取材行病理切片苏木精-伊红染色，荧光显微镜观测CM-Dil 标记的神经干细胞存活及分布情况，辣根过氧化物酶示踪观察神经纤维再生情况，运动诱发电位和体感诱发电位观察大鼠神经电生理恢复情况。
结果与结论：造模后2-4周大鼠下肢运动功能评价联合组优于神经干细胞组及电针刺激组，神经干细胞组和电针刺激组优于对照组。造模后4周，神经干细胞组和电针刺激组损伤区可见少量神经轴索样结构，脊髓空洞较小，联合组可见较多神经轴索样结构，未见脊髓空洞。造模后4周，CM-Dil 阳性细胞和辣根过氧化物酶阳性神经纤维数：联合组>神经干细胞组与电针刺激组>对照组，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。运动诱发电位和体感诱发电位的潜伏期：联合组<神经干细胞组与电针刺激组<对照组，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)；运动诱发电位和体感诱发电位的波幅：联合组>神经干细胞组与电针刺激组>对照组，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。结果提示神经干细胞移植的同时联合电针刺激能够促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生，改善其大鼠肢体运动功能及电生理功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 电针刺激, 大鼠, 脊髓损伤, 移植, 电生理, 运动功能

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cell transplantation alone has achieved unsatisfactory outcomes in the repair of damaged spinal cord tissues. To promote the survival, proliferation and neuronal differentiation of transplanted cells in vivo, it is necessary to further improve the micro-environment of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of neural stem cell transplantation plus electroacupuncture on the hindlimb function and electrophysiological changes of rats with spinal cord injury.
METHODS: Animal models of spinal cord injury were made in 72 Sprague-Dawley rats and randomized into four groups: control group with injection of culture medium via the tail vein; neural stem cell group with injection of neural stem cell suspension via the tail vein; electroacupuncture group given 1-week electroacupuncture at Du
meridian and body points starting from 6 hours after modeling; combined group given injection of neural stem cell suspension via the tail vein+1-week electroacupuncture at Du meridian and body points starting from 6 hours after modeling. Motor functional recovery in rats was assessed by Basso-Beattie-Bresnahan score and inclined plane test before and at 1, 3 days and 1-4 weeks after modeling. At 4 weeks after modeling, hematoxylin-eosin staining was performed for pathological observation; fluorescence microscope was used to observe the survival and distribution of CM-Dil-labeled neural stem cells; horseradish peroxidase tracer was used to observe nerve fiber regeneration; rat neurophysiological recovery was assessed by determining motor evoked potentials and somatosensory evoked potentials.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2-4 weeks after modeling, the hindlimb function was better in the combined group than the neural stem cell group and electroacupuncture group; while it was better in the neural stem cell group and electroacupuncture group than the control group. At 4 weeks after modeling, there were few nerve axon-like structures and small voids in the spinal cord of the neural stem cell group and electroacupuncture group; however, in the combined group, there were more nerve axon-like structures and no void in the spinal cord. At 4 weeks after modeling, the number of nerve fibers positive for CD-Dil and horseradish peroxidase was ranked as follows: combined group > neural stem cell group and electroacupuncture group > control group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). The latencies of motor and somatosensory evoked potentials were significantly lower in the combined group than the neural stem cell group and electroaucpuncture group followed by the control group (P < 0.05), whereas the amplitudes of motor and somatosensory evoked potentials were significantly higher in the combined group than the neural stem cell group and electroacupuncture group followed by the control group (P < 0.05). In conclusion, these findings indicate that neural stem cell transplantation combined with electroacupuncture can promote synaptic regeneration and improve the motor and electrophysiological functions of rats.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 7

2.1 神经干细胞体外培养、鉴定及标记培养1 d后神经干细胞增多、较小、形状不规则，小部分细胞团贴壁；5 d后神经干细胞增多，为较大、形状规则的球形(图1A)。免疫组化染色显示，神经干细胞球呈Nestin强阳性表达(图1B)。CM-Dil标记的神经干细胞在荧光显微镜下呈红色荧光，CM-DiI标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好(图1C)。

2.2 实验动物数量分析参加实验数量80只，造模及实验过程中失败5只，死亡3只，进入结果分析数量72只。实验流程见图2。

2.3 下肢运动功能评价结果造模前所有大鼠的BBB评分、斜板试验评分差异均无显著性意义(P > 0.05)。经相关治疗后，神经干细胞组、电针刺激组、联合组BBB评分、斜板试验评分在造模后2-4周较对照组都明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。联合组BBB评分、斜板试验评分在造模后2-4周较神经干细胞组、电针刺激组高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 苏木精-伊红染色结果造模后4周，对照组脊髓挫伤区可见脊髓组织断裂，为瘢痕连接，有明显空洞形成(图3A)。电针刺激组及神经干细胞组脊髓组织空洞较联合组大，较对照组小(图3B，C)。联合组损伤处脊髓组织空洞几乎消失(图3D)。

2.5 荧光显微镜观察结果对照组和电针刺激组荧光显微镜下未见CM-DIL染色阳性的红色荧光细胞(图4A，B)，神经干细胞组及联合组荧光显微镜下均可见散在的CM-DIL染色阳性的红色荧光(图4C，D)：神经干细胞组(23.42±5.87)个/高倍视野，联合组(38.59±6.74)个/高倍视野，神经干细胞组及联合组之间差异有非常显著性意义 (P < 0.01)，神经干细胞组和及联合组与对照组和电针刺激组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

2.6 体感诱发电位和运动诱发电位的检测结果造模后4周，对照组体感诱发电位和运动诱发电位少量恢复，联合组感诱发电位和运动诱发电位明显恢复，波幅增高，见表2，3。神经干细胞组、电针刺激组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。联合组与对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。联合组与神经干细胞组、电针刺激组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，表明联合组电信号从后肢到头皮传导时间比其他组都短，传导通路已经畅通，恢复较好。

2.7 辣根过氧化物酶逆行神经示踪辣根过氧化物酶经DAB呈色反应后，在注射部位出现一中心部位深染其周围逐渐变浅的区域。对照组大鼠经腰膨大处注入辣根过氧化物酶后2 d，辣根过氧化物酶逆行运输，至T8以上节段可见较少的辣根过氧化物酶阳性颗粒标记的神经纤维，见图5A。神经干细胞组、电针刺激组可见有辣根过氧化物酶阳性神经纤维，但数目较联合组少，较对照组多，见图5B，C。联合组脊髓可见到较多辣根过氧化物酶阳性颗粒标记的神经纤维，见图5D。造模后4周联合组与对照组辣根过氧化物酶阳性神经纤维数比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2013年3月至2015年2月在河北医科大学动物实验室完成。
1.3 实验动物及材料胎龄为14-16 d的SD胎鼠10只；健康清洁级雌性SD大鼠80只，10周龄，体质量240-280 g，购自河北医科大学动物实验室，动物许可证号：SCXK(冀) 20070005。

1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的培养和鉴定取孕14-16 d的SD大鼠1只，引颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡消毒，剖腹取出胎鼠(10只)。取胎鼠大脑，去除脑膜和血管，浸泡在DMEM/F12培养液中，用吸管反复吹打成悬液，过100目孔筛网，接种培养瓶中，添加表皮生长因子10 mg/L，碱性成纤维细胞生长因子10 mg/L，N2添加剂，置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵育箱中培养。神经干细胞纯度鉴定：神经上皮干细胞蛋白≥70%、神经胶质酸性蛋白≤10%、神经丝微管蛋白≤10%，可以进行下一步实验。
1.4.2 CM-Dil 标记神经干细胞避光吸取5 µL的CM-Dil液(用稀释液C稀释)，加入1.5 mL EP管中，再加入1 mL的完全培养液(含体积分数为5%胎牛血清)，混匀后，即得CM-Dil标记液。取贴壁且融合达80%的神经干细胞，吸弃培养液后，PBS洗涤3次，加入上述标记液40 µL/cm2，饱和湿度的恒温培养箱孵育20 min(37℃、体积分数为5%CO2)，吸弃标记液，加入5 mL 37 ℃的完全培养液(含体积分数为5%胎牛血清)，孵育10 min吸弃后，再加入完全培养液(含体积分数为5%胎牛血清)洗涤3次。荧光显微镜下观察培养24 h后CM-Dil标记效果和神经干细胞形态。传代时取适量的神经干细胞由流式细胞仪检测CM-Dil的标记率。
1.4.3 动物模型的建立选择雌性SD大鼠80只，实验室饲养2周后，10%水合氯醛按350 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位将大鼠固定在实验平台上，腰背部备皮满意后，以T8-9棘突为切口中心，自大鼠背部正中逐层切开，充分显露T7-10的棘突和椎板，咬除T8-9棘突和部分椎板，暴露硬膜保持完整，作为损伤区。按照改良的Allen法打击，将10 g重物由2.5 cm高度处自由落下，撞击大鼠硬膜及脊髓组织(造模后大鼠尾巴痉挛摆动且双下肢瘫痪表明成功)。用双氧水冲洗伤口，逐层缝合背部切口。
造模后每日挤尿两三次，直至大鼠恢复排尿反射，造模及实验过程中失败5只，死亡3只。
1.4.4 动物分组按随机数字表法将剩余72只大鼠分为4组，每组18只。建模后6 h通过1 mL注射器经尾静脉注入不同移植液：对照组注射1 mL培养液；神经干细胞组注射1 mL神经干细胞悬液(3×106个)；电针刺激组大鼠自模型完成6 h起采用督脉加体穴电针：选1寸毫针，于损伤部位(T10)上、下取“大椎”“命门”穴，深达硬膜外并固定针刺位置。采用G-6805-1型电子针疗仪，疏密波，频率4 Hz，调节刺激强度以目测大鼠后肢微微颤动为度，强度范围为 0.3-0.6 mA。体穴：三阴交穴-后肢内踝尖直上10 mm左右，直刺4.0-5.0 mm；环跳穴-后肢髋关节后上缘，直刺6 mm；后三里穴-膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处，直刺 6 mm；跟端穴-后肢外踝与跟腱之间的凹陷中，直刺3 mm，1次/d，每次30 min，连续7 d。联合组：在尾静脉注射1 mL神经干细胞悬液(3×106个)的同时予以电针刺激，连续7 d。
1.4.5 下肢运动功能评价所有大鼠均在造模前及造模后1，3 d，1-4周对4组大鼠进行运动功能评定。评定项目包括BBB评分，斜板试验。评定时间均统一为上午8：00开始。评分均为两人合评。采取双盲法对4组大鼠进行评分，共检测6次，取均值。
1.4.6 苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察造模后4周，4组各取5只大鼠，10%水合氯醛350 mg/kg麻醉满意后剖胸，充分显露大鼠心脏，通过升主动脉插管，剪开右心耳后先用生理盐水冲洗，再以40 g/L多聚甲醛固定后，完整地取出损伤区脊髓组织，梯度乙醇脱水后行脊髓纵行冰冻切片，厚度为20 μm。苏木精-伊红染色：苏木精染色5 min后，经自来水冲洗，盐酸乙醇分化10 s，再次自来水冲洗10 min，伊红染色7 min，自来水洗后，以梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。各组脊髓损伤处组织行常规冰冻切片后，荧光显微镜观察，随机取10个视野，于高倍镜下(×200)观察，计算各个视野阳性细胞数，取均值作为各组CM-Dil阳性细胞数。
1.4.7 体感诱发电位和运动诱发电位的检测造模后第4周，4组各取5只大鼠，采用KEYPOINT 4诱发电位仪测定体感诱发电位和运动诱发电位。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将其平放在水平面上，后肢固定刺激电极。记录电极安放于冠状缝和矢状缝愈合线的相交处头皮下(即后肢皮质感觉区)，参考电极置于其后方0.5 cm处。给予直流方波电脉冲刺激，以后肢轻微抽动为宜，电流强度为5-15 mA，波宽0.2 ms，频率3 Hz，叠加次数50-60次，记录体感诱发电位潜伏期及波幅的变化，观察神经电生理恢复情况。运动诱发电位检测：麻醉后将针状刺激电极置于顶冠状缝前2 mm、矢状缝旁2 mm处头皮下(即大脑皮质运动区)，刺激强度40 mA，刺激波宽0.1 ms，刺激频率1 Hz，叠加次数300-500次，扫描速度5 ms/D，灵敏度5 μV/D，观察记录运动诱发电位潜伏期及波幅的变化。
1.4.8 辣根过氧化物酶逆行神经示踪造模后4周，以生理盐水溶解辣根过氧化物酶。各组随机取5只大鼠，麻醉后手术暴露脊髓。在T12背正中静脉左、右侧1 mm处进针，进针深度为1.5 mm。以0.1 μL/10 min的速度注射50%辣根过氧化物酶1 μL，注射完毕后留针15 min，饲养3 d。水合氯醛麻醉下，40 g/L多聚甲醛心脏灌注，并取出脊髓(T3-T11)，浸入30%的蔗糖溶液(4 ℃)20 h后制作成5 μm的冰冻切片，DAB加强染色。在光镜下计数脊髓横切面上辣根过氧化物酶阳性神经纤维束数目，各组各时点随机抽取10张切片进行阳性纤维束计数。
1.5 主要观察指标 ①下肢运动功能。②脊髓组织病理形态。③体感诱发电位和运动诱发电位。④辣根过氧化物酶阳性神经纤维数。
1.6 统计学分析以x(_)±s表示数据，用SPSS 17.0软件分析，多组均数比较用单因素方差分析(LSD法)，两组均数比较用t 检验。

讨论

脊髓损伤的神经不能再生、修复，是导致患者死亡率及致残率居高不下的根本原因，一直是神经外科亟待解决的热门课题之一^[10-15]。急性脊髓损伤后继发于初级创伤的一系列神经生化、微循环失调形成的恶性病理连锁反应，可造成永久性神经损害^[16-20]。
目前临床上主要是利用药物营养神经及康复理疗方法的治疗脊髓损伤，恢复受损脊髓的缺血缺氧，挽救缺血半暗带中濒临坏死的神经元，促进修复损伤的神经元功能，但脊髓神经元不具有自我修复的能力，因此达不到预想的临床治疗效果^[21-22]。随着组织工程脊髓损伤研究的不断深入，神经干细胞移植已成为人们探索治疗神经系统损伤的新途径^[23-25]，神经干细胞移植后分化成神经元及神经胶质，修复受损的神经元，可以作为理想的神经元移植供体，成为一种更有效治疗脊髓损伤的新方法。移植的神经干细胞在宿主体内受损伤脊髓部位存活，产生并释放趋化因子向损伤区域迁移、聚集，分泌多种生长因子，抑制炎症因子的表达，诱导损伤区域微血管的再生，减轻局部的继发性炎症反应，分化成神经元和胶质细胞，达到保护并促进神经元再生重构、治疗脊髓损伤的目的[26-28]，神经干细胞移植给脊髓损伤的治疗带来了新的希望，有人认为将神经干细胞在体外培养成神经前体细胞再移植入相应的损伤部区域有利于其成活及形成相应功能的细胞，但是单纯的神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复作用并不理想，需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。为了进一步提高移植细胞在体内的存活、增殖及定向分化为神经元的比例，必须进一步改善脊髓损伤区的微环境^[29-30]。本研究在神经干细胞移植的同时联合电针刺激促进大鼠脊髓损伤的修复。结果显示，下肢运动功能评价联合组优于其他3组，神经干细胞移植组和电针刺激组优于对照组，CM-Dil阳性细胞和辣根过氧化物酶阳性神经纤维数：联合组最多，神经干细胞移植组和电针刺激组次之，对照组最少。联合组体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期小于其他3组，波幅大于其他3组，各组之间差异有显著性意义。综上所述，电针刺激联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤，可促进神经突触的再生，改善下肢运动功能和电生理功能。