自体骨髓干细胞移植联合当归活血汤治疗糖尿病足

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，糖尿病足的发病率急剧增高，常常导致足部溃疡、截肢和死亡。
目的：研究自体骨髓干细胞移植与当归活血汤合用治疗糖尿病足的疗效。
方法：选择60例伴有慢性下肢缺血的糖尿病足患者，分为3组，每组20例，其中常规治疗组38条患肢，自体骨髓干细胞移植治疗组36条患肢，自体骨髓干细胞移植与当归活血汤合用治疗组39条患肢。治疗12周，检测肢体冷感、疼痛、皮肤温度、间歇性跛行、踝臂指数等指标，同时随访观察有无相关的并发症或不良反应。
结果与结论：常规治疗组治疗前后各项指标比较差异无显著性意义(P > 0.05)。自体骨髓干细胞组和联合治疗组治疗后各项指标均有明显改善(P < 0.05)。治疗后的联合治疗组与自体骨髓干细胞组相比，各项指标也均明显好转(P < 0.05)，且自体骨髓干细胞移植后无不良反应。试验结果说明自体骨髓干细胞移植与中药当归活血汤合用可以有效治疗糖尿病足。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 糖尿病, 糖尿病足, 自体, 骨髓干细胞移植, 当归活血汤

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the incidence of diabetic foot is sharply increasing, which tends to cause foot ulcers, amputation and death.
OBJECTIVE: To investigate the clinical therapeutic effect of autologous bone marrow stem cell transplantation combined with danggui huoxue tang on diabetic foot.
METHODS: Sixty patients with diabetic foot accompanied by chronic lower limb ischemia were randomly divided into conventional treatment group including 20 cases with 38 affected limbs, and autologous bone marrow stem cell transplantation group (cell transplantation group) including 20 cases with 36 affected limbs, and combined group (autologous bone marrow stem cell transplantation combined with danggui huoxue tang) including 20 cases with 39 affected limbs. After 12 weeks of treatment, indicators such as limb cold-feeling, pain, skin temperature, claudication distance and ankle brachial index were measured, and meanwhile, complications and adverse reactions were observed in the follow-up visit.
RESULTS AND CONCLUSION: In the conventional treatment group, there was no significant change before and after treatment (P > 0.05). However, these indicators were significantly improved in the other two groups after treatment (P < 0.05) as well as compared with the conventional treatment group (P < 0.05). In addition, there was no adverse reaction in the cell transplantation group. These findings indicate that the combination of autologous bone marrow stem cell transplantation and danggui huoxue tang has effective effects on diabetic foot.

中图分类号:

R394.2

马海涛，周涛，邱文淼，刘平. 自体骨髓干细胞移植联合当归活血汤治疗糖尿病足[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8139-8143.

Ma Hai-tao, Zhou Tao, Qiu Wen-miao, Liu Ping . Combination of autologous bone marrow stem cell transplantation and danggui huoxue tang for treatment of diabetic foot[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8139-8143.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析所有大鼠均进入结果分析，无脱失。实验技术路线图，见图1。

2.2 治疗前后大鼠症状和体征的变化模型组大鼠精神萎糜，毛色灰暗，生长停滞或体质量负增长，出现明显的腹部膨隆，皮下有波动感，穿刺可见澄清淡黄色液体。骨髓间充质干细胞治疗后，大鼠精神状态明显好转，毛色开始变得顺滑，体质量亦有一定的增长，腹部膨隆有所减小，提示腹水已部分吸收。
2.3 治疗前后大鼠肝脏的超微结构改变正常大鼠肝细胞呈多面体，细胞核为圆形或椭圆形，核膜清晰，胞质内细胞器完整，偶见小脂滴，肝窦壁主要由肝窦内皮细胞胞质形成的细长片状薄层所覆盖，其上有直径约0.1 μm的窗孔，聚集成串，窦壁外侧无基底膜结构，核为长梭形，表面平坦，无突起(图2A)；模型组大鼠肝细胞缺氧严重，许多线粒体破坏，嵴消失，外膜破裂，线粒体基质外溢，同时肝细胞体积变小，肝细胞内空泡样结构常见，部分肝细胞已崩解，释出胞质成分，并可见白细胞浸润，此时可见大量凋亡细胞，核固缩变小或异染色质聚集，但细胞膜性结构完整，没有溶酶体内容物释放，随后细胞膜出现深的皱褶，细胞分裂成若干独立的小体，形成“凋亡小体”，细胞器随着凋亡小体的形成而分布至各凋亡小体内，肝窦内皮细胞核体积增大，变得不规则，异染色质突出，细胞核外观呈现皱褶状态(图2B)，周边出现增生活跃的枯否氏细胞。狄氏间隙可见明显束状排列的胶原纤维，窦周隙扩大，肝窦内皮细胞窗孔消失，并伴有基底膜形成，提示肝窦已转化成毛细血管。治疗组肝细胞胞核形态基本正常，肝细胞缺氧有所缓解，但仍可见到线粒体轻度或中度肿胀(图2C)，嵴模糊消失，粗面内质网脱颗粒现象仍较严重，细胞核常染色质凝集成块状(图2D)，核膜孔部分可见，但双层膜间隙增宽；肝窦中可见有阻塞物，主要为红细胞、单个核细胞、细胞碎片及糖原颗粒等。

2.4 肝窦体视学各参数的变化模型组肝窦数目明显减少，而肝窦总面积及平均直径明显增大，与治疗组及正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但各组间肝窦总周长差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.5 肝功能指标的变化与模型组比较，治疗组肝功能明显改善，白蛋白显著升高，谷丙转氨酶及直接胆红素显著下降(P < 0.05)，但谷草转氨酶变化不明显((P > 0.05)，见表2。

参考文献

[1] Guariguata L, Whiting DR, Hambleton I, et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 2014;103(2):137-149.

[2] Patel M, McCormick K. Managing Diabetes in People with Foot Complications[M]. Management of Diabetic Foot Complications: Springer; 2015:39-49.

[3] 国际糖尿病足工作组编.许樟榕译.糖尿病足国际临床指南[M].北京: 人民军医出版社, 2004.

[4] Asahara T, Murohara T, Sullivan A,et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997; 275(5302):964-967.

[5] Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 2002;360(9331): 427-435.

[6] 阮园,余江毅,顾建平,等. 介入治疗糖尿病足近期疗效观察[J]. 中国临床研究,2014,27(11):1318-1321.

[7] 陈军,范兆阳. 3联药物治疗糖尿病足溃疡的治疗体会[J].中国伤残医学, 2014;22(4):151-152.

[8] 甘宇,李铁男,于黎丽,等.自体骨髓干细胞移植与通脉化瘀汤合用治疗糖尿病足溃疡的研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志, 2009,8(1):5-7.

[9] 杜冬,庄永青,傅小宽,等. 糖尿病足的显微外科治疗[J].中华显微外科杂志, 2006,29(6):429-431.

[10] 邓利娟,罗华山,吴豫梅,等.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的效果观察[J].中国当代医药,2014,21(20):33-34.

[11] 高赟,冉兴无.糖尿病足病治疗进展[J].实用医院临床杂志,2014, 11(1):10-13.

[12] Yamaguchi Y, Yoshida S, Sumikawa Y, et al. Rapid healing of intractable diabetic foot ulcers with exposed bones following a novel therapy of exposing bone marrow cells and then grafting epidermal sheets. Br J Dermatol. 2004;151(5): 1019-1028.

[13] Dubský M, Jirkovská A, Bem R, et al. Comparison of the effect of stem cell therapy and percutaneous transluminal angioplasty on diabetic foot disease in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 2014;16(12):1733-1738.

[14] Hernigou P, Guissou I, Homma Y, et al. Percutaneous injection of bone marrow mesenchymal stem cells for ankle non-unions decreases complications in patients with diabetes. Int Orthop. 2015;39(8):1639-1643.

[15] 宋丽丽,董焕生,崔月英,等. 成体干细胞在 1 型糖尿病中的应用研究及展望[J].中国细胞生物学学报, 2014,36(5):698-702.

[16] 王秀霞,郭芙莲,王玉中.药足浴与穴位注射治疗 2 级糖尿病足 35 例临床观察[J].时珍国医国药,2014,25(5):1172-1173.

[17] 陈剑飞,李强.中药熏洗辅助治疗 0~Ⅰ级糖尿病足29例疗效观察[J].新中医, 2015,47(6):92-94.

[18] 张颖.中药紫金膏治疗糖尿病足临床体会[J].亚太传统医药,2015, 11(15):72-73.

[19] 丁毅,赵京霞,徐旭英,等.辨证应用中药溻渍Ⅰ号, Ⅱ号方对糖尿病足疮面 MMPs-2, MMPs-9 酶活性的影响[J].北京中医药, 2015,34(2):136-138.

[20] 何文静,王爱民,华筱娟.中药足浴疗法治疗初级糖尿病足的护理进展[J].解放军护理杂志,2014,31(8):37-38.

[21] 李友山,杨博华.“蚓黄散” 干预糖尿病足溃疡愈合过程中 AGEs 与促愈合因子相关性研究[J].世界科学技术-中医药现代化, 2015,17(2):350-355.

[22] 曹柏龙,苗桂珍,朱学敏,等.中药油膏剂治疗糖尿病足溃疡临床研究[J].世中国中医药现代远程教育,2014,12(15):11-13.

[23] 籍胤玺,金文波,徐娜.糖尿病足 Wagner 诊断分级法临床治疗实例[J].医学美学美容: 中旬刊,2014,22(2):76-7.

[24] 郭连瑞,谷涌泉,张建,等. 自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足 13 例报告[J].中华糖尿病杂志,2004,12(5):313-316.

[25] Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 2010;87(1):4-14.

[26] Gale EA.The rise of childhood type 1 diabetes in the 20th century. Diabetes. 2002;51(12):3353-3361.

[27] 榻文婷,尹镇钊.糖尿病足患者下肢血管病变分析[J].中国当代医药,2013,20(11):58-59.

[28] 李菊英,聂晶晶.糖尿病足预防的护理进展[J].实用临床医学, 2012, 13(8):124-126.

[29] 凌孔兰.糖尿病足护理体会[J].基层医学论坛,2012,16(3):400- 401.

[30] 邓利娟,罗华山,吴豫梅,等.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的效果观察[J].中国当代医药,2014,21(20):33-34,37.

[31] 张美华,张艳萍,盖凌,等.内皮祖细胞临床应用的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志, 2012,32(4):356-360.

[32] 乔威,冉峰,刘长建.人外周血内皮祖细胞的分离, 培养及鉴定[J].中国组织工程研究, 2013,17(36):6508-6514.

[33] Kawamoto A, Asahara T, Losordo DW. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovasc Radiat Med. 20023(3-4):221-225.

[34] 赵绘萍,肖大为.低场 MRI 在糖尿病足自体干细胞移植疗效监测的意义[J].中国现代医学杂志,2014,24(36):74-76.

[35] 李晓玲,朱旅云,宋光耀,等. 脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变[J].中国组织工程研究,2014,18(23):3670-3675.

引言

近年来，糖尿病患病率急剧增加，2013年全球糖尿病患者已超过3.82亿人，预计到2035年将增至5.92亿^[1]。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症之一，世界卫生组织将其定义为发生于糖尿病患者的与下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变相关的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏^[2]。中国糖尿病足的患病率已达到0.9%-14.5%，并呈现逐年增加的趋势，而且患者5年内死亡率高达39%-68%^[3-5]。此外，糖尿病足溃疡已被证实是截肢中最常见的独立预测因子之一，目前85%的非创伤性下肢截肢均由糖尿病足溃疡引起，是非创伤截肢的一个最重要原因^[6]。
应用药物对糖尿病足进行治疗，其疗程长，花费大，并且治疗效果也不显著^[7-8]。采用单一的介入手术或血管搭桥手术治疗糖尿病足，虽然能暂时改善和缓解糖尿病足的表面症状，但是并不能完全解决患者的弥漫性血管狭窄、闭塞以及神经、组织破溃等病症，治疗效果也并不十分理想^[9]。近几年来，随着生物技术的快速发展，干细胞移植已经成为一种新的治疗糖尿病足的生物学方法。
自体干细胞移植是一种新的治疗性血管生成技术，其操作简单，并无绝对的禁忌证，广泛适用于治疗糖尿病性周围血管病变及其他各种慢性下肢缺血性疾病，尤其是对那些远端流出道差甚至于无流出道的患者^[10-11]。自体干细胞移植治疗这些疾病的原理是干细胞及内皮祖细胞可以分化为血管内皮细胞，形成新生血管，从根本上解决下肢缺血的问题，尤其因严重下肢动脉血管缺血引起的足部疼痛、溃烂、坏疽等患者，能够降低其截肢平面或免除其截肢痛苦^[12-14]。成体干细胞是从机体中分离出来的多能干细胞，具有多向分化、高度增殖和自我更新的能力，可分化成血管内皮细胞、成纤维细胞和角质化细胞等多种细胞^[15]。造血干细胞主要来源于骨髓、脐血和外周血，目前多采用血管内或肌肉内注射的方式移植干细胞。此外，采用中药口服、足浴、穴位注射、熏洗等方式治疗糖尿病足的研究已被广泛报道，并取得了良好的治疗效果^[16-22]。当归活血汤是全国名老中医崔公让教授的经验方，用于治疗糖尿病足，并取得了良好的效果。本研究采用自体骨髓干细胞移植联合中药当归活血汤治疗糖尿病所引起的伴有慢性下肢缺血的足部病变，旨在探索治疗糖尿病足的有效途径。

材料方法

1.1 设计细胞生物学体内试验。
1.2 时间及地点于2013年3月至2015年8月在河南中医学院第一附属医院周围血管科完成。
1.3 对象选择2013年3月至2014年8月在河南中医学院第一附属医院住院确诊的伴有慢性下肢缺血的糖尿病足患者60例(男37例，女23例)，年龄51-83岁，平均73.4岁；糖尿病病程8-17年，按照Wagner分级法对60例患者的糖尿病足病变程度进行分级[23]，见表1。试验共分为3组，每组20例，将病变级别一致的患者随机分配到3个组中，以保证各组的病情严重程度类似。常规治疗组38条患肢，自体骨髓干细胞移植治疗组36条患肢，自体骨髓干细胞移植与当归活血汤联合使用治疗组39条患肢。

纳入标准：①患肢均有不同程度的静息痛或间歇跛行，静息状态下踝臂指数为0-0.6。②CT血管造影或彩超已经证实了周围动脉出现不同程度的狭窄或闭塞，远端流出道差。③对治疗过程完全知情同意。
排除标准：①过去5年内有恶性疾病的患者。②血中肿瘤标记水平明显较高者。③并发严重的脑、心、肝、肺等脏器功能不全或一般状况很差，不能耐受干细胞移植手术者。
脱落(退出)标准：对已被选入本临床研究，属于以下情况之一者，作为脱落病例。①受试者依从性差，不能按时按量用药。②使用其他影响耐受性判断的药物。③受试者不愿意继续进行临床试验，向主管医生提出退出者。
1.4 药物、试剂及仪器当归活血汤的配方是全国名老中医崔公让教授的经验方，其方剂如下：当归15 g，丹参20 g，鸡血藤20 g，牛膝15 g，红花15 g，地龙15 g，黄芪30 g，葛根20 g，陈皮10 g，甘草6 g，每剂水煎成300 mL。
肝素(美国Sigma公司)；CD34-PE(美国Biolegend公司)；粒细胞集落刺激因子、利多卡因(益健药业)；S.SW-CJ净化工作台(上海恒宇医疗器械厂)；多普勒血流探测仪(日本电气公司)；红外线皮温仪(意大利TECNIMED公司)。
1.5 方法
1.5.1 治疗方案常规治疗组使用胰岛素、辛伐他汀、阿司匹林等常规药物控制血糖、血脂、血压，对足部溃疡进行定期清创换药；自体骨髓干细胞组患者行自体骨髓干细胞移植以及常规治疗；联合治疗组患者行自体骨髓干细胞移植，当归活血汤加减口服(100 mL/次，2次/d)以及常规治疗。
1.5.2 自体骨髓干细胞的动员与采集手术前1 d，查血常规后，经皮下注射粒细胞集落刺激因子400 μg，此外为了防止因高白细胞血症引发心脑血管意外以及血栓的形成，在注射粒细胞集落刺激因子的同时，也经皮下注射低分子肝素钠5 000 U，2次/d。干细胞动员的第2天，查血常规，外周血白细胞总数为(17.1-32.1)×109 L-1。然后用1%的利多卡因对患者进行局部麻醉，严格执行无菌操作，在患者双侧髂后上棘穿刺，每例患者采集骨髓血100-300 mL，并应用羟乙基淀粉和Ficoll液对骨髓干细胞进行分离，然后配置干细胞混悬液50 mL，单个核细胞计数为(1.19- 8.96)×108，CD34+细胞(19-212)×106 L-1。
1.5.3 自体骨髓干细胞移植于手术室进行干细胞移植，对患者先进行椎管内麻醉，麻醉成功后，沿患肢的缺血动脉走行，于下肢肌肉和足部从上向下顺序注射自体骨髓干细胞混悬液，下肢按3 cm×3 cm间距施行肌肉注射，足部则按1 cm×1 cm间距进行注射，注射的深度为1.5-2.0 cm，每个位点的注射量为0.5-1.0 mL，手术完成后，对注射部位进行乙醇消毒，并采用无菌纱布进行包扎。
1.5.4 随访术后随访3个月-1年，主要随访自体骨髓干细胞移植患者的身体状况，是否有并发症和不良反应发生。
1.6 主要观察指标分别于治疗前以及治疗后12周，对患者的跛行距离、肢体疼痛和肢体冷感状况进行评估，用多普勒血流探测仪和踝臂指数检查套件测定踝臂指数，红外线皮温仪检测治疗前后的皮温变化，采用动脉造影评估治疗前后的血管变化。糖尿病足跛行距离、肢体疼痛和肢体冷感的评分标准，参考有关文献^[8]，具体见表2。

1.7 统计学分析采用GraphPad Prism 5软件，计量资料用x(_)±s表示。统计方法采用配对t 检验，One-way单因素方差分析，q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着2型糖尿病的流行和1型糖尿病发病率越来越高，糖尿病足已成为全球的负担^[25-26]。根据发病原因的不同，目前主要分为缺血性、神经性和混合性3类[27]。大多数糖尿病足溃疡是属于混合类型的，同时伴有周围神经和血管病变^[28]。糖尿病足是导致糖尿病患者残疾和死亡的最重要的并发症之一，同时也使糖尿病患者的生活质量严重下降，给患者的身体和精神都带来了极大的痛苦。目前糖尿病足引发的截肢已成为很多国家截肢的首要原因。研究报道，在欧美国家，35%-50%的非创伤截肢为糖尿病足所致^[29]。糖尿病足的传统治疗主要是药物治疗和血流重建，常规的药物治疗并没有显著的疗效，本研究结果也证实了这点。血流重建则主要是进行血管搭桥手术，虽然它可以使部分患者保全肢体或者降低截肢平面，但是该手术的执行需要一定的条件，即患者远端有较好的流出道，并且能够耐受搭桥手术的刺激。事实上，很多糖尿病足患者的远端流出道差，而且大多年老体弱，伴有一些其他疾病，不能耐受搭桥手术的刺激^[30]。这类患者只能采取保守的药物治疗，但是面临着很高的截肢风险，因此急需找到新的医治手段，来提高糖尿病足的治疗效果。
干细胞移植能够促进血管的再生，近年来受到了广泛的关注，为糖尿病足患者提供了新的救肢方法。研究发现，内皮祖细胞存在于外周血、胎肝和骨髓中，是形成血管的关键细胞，早期该细胞表达CD34、CD133和血管内皮生长因子受体^[31-32]。动物实验已经证实了骨髓干细胞植入缺血肢体后可促进局部血管的形成，而且植入的血管内皮祖细胞参与了新的毛细血管的生成^[33]。成年人体内也存在由干细胞分化成内皮细胞，进而形成新生血管的过程^[4]。2002年Tateishi-Yuyama等^[5]首次采用自体骨髓干细胞移植来治疗缺血性下肢血管病，获得了满意的疗效，并且未发现明显的不良反应。很多研究也已经证实了采用自体骨髓干细胞移植对糖尿病足治疗具有较高的可行性和安全性，和本研究相一致^[10，34-35]。
本研究联合使用自体骨髓干细胞和中药当归活血汤对糖尿病足进行治疗，取得了较好的疗效，各项指标相比于单独的骨髓干细胞移植，均有显著改善，这可能主要与当归活血汤具有活血通络、能够促进干细胞移植后血管新生及建立侧支循环的作用有关，但是确切的机制还有待进一步研究。