骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞可异常影响骨髓瘤细胞株的趋化功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8037-8042.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.001

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骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞可异常影响骨髓瘤细胞株的趋化功能

费小明¹，李俊霞²，汤郁¹，雷芳¹，陆化²

¹江苏大学附属医院血液科，江苏省镇江市 212001；²南京医科大学第一附属医院，江苏省南京市 210029

收稿日期:2015-11-09 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 陆化，主任医师、教授，南京医科大学第一附属医院，江苏省南京市 210029
作者简介:费小明，男，1973年生，江苏省镇江市人，汉族，2007年南京医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事骨髓瘤、骨髓微环境等研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81202358，81571582)；江苏省卫生计生科研项目(Z201512)

Bone marrow mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients aberrantly affect chemotactic function of myeloma cell lines

Fei Xiao-ming¹, Li Jun-xia², Tang Yu¹, Lei Fang¹, Lu Hua²

¹Department of Hematology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; ²First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2015-11-09 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Lu Hua, Chief physician, Professor, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Fei Xiao-ming, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Supported by:
Multiple Myeloma; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Chemotaxis; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81202358, 81571582; Jiangsu Province Health Research Fund, No. Z201512

摘要/Abstract

摘要：

背景：多发性骨髓瘤患者骨髓微环境中间充质干细胞有多种异常，但异常的间充质干细胞对骨髓瘤细胞的趋化功能影响目前仍不清楚。
目的：比较正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞在体外对骨髓瘤细胞株趋化迁移的影响。
方法：体外培养的正常人骨髓间充质干细胞或初诊骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞，在有或无硼替佐米条件下，分别与骨髓瘤细胞株U266细胞直接共培养，比较U266细胞的Transwell迁移率、定量PCR检测mRNA的表达水平。同时还检测U266细胞对正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养液上清的Transwell迁移情况。
结果与结论：正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞与U266细胞直接共培养后，两组骨髓瘤细胞的趋化特性有区别，表现为骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞组的U266细胞基础Transwell迁移率高、CCR1的表达水平高(P均 < 0.05)。硼替佐米处理U266细胞后并不能消除两组的的区别。然而，U266细胞对正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养液上清的Transwell迁移并没有明显区别。结果提示骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞本身存在一些内在缺陷，在与骨髓瘤细胞株U266相互作用过程中，可以影响U266的体外趋化功能，并且这一影响主要是通过骨髓间充质干细胞与骨髓瘤细胞直接相互作用引起的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 多发性骨髓瘤, 骨髓间充质干细胞, 趋化, 穿孔, 硼替佐米, U266, CCR1, 共培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although bone marrow mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients present a variety of abnormalities, it is unclear how these abnormal mesenchymal stem cells influence the chemotactic function of myeloma cell lines.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro effects of bone marrow mesenchymal stem cells from normal donors versus multiple myeloma patients on the chemotactic capacity of myeloma cell lines.
METHODS: In vitro cultured bone marrow mesenchymal stem cells derived from either normal donors (N-MSCs group) or newly-diagnosed multiple myeloma patients (MN-MSCs group) were directly co-cultured with U266 cells, in the presence or absence of bortezomib; and then harvested U266 cells were assayed for Transwell migration
and mRAN expression of chemotaxis-related genes. U266 Transwell migration to conditioned medium derived from either N-MSCs or MN-MSCs was also tested.
RESULTS AND CONCLUSION: After co-cultured with N-MSCs or MN-MSCs, U266 cells harvested from MN-MSCs group showed increased spontaneous Transwell migration and up-regulated CCR1 mRNA level than those from N-MSCs group (P < 0.05), whatever bortezomib was present or not. However, there was no evident difference between U266 cell Transwell migration to conditioned medium derived from either MM-MSCs group or N-MSCs group. Our study implies that there may be some intrinsic aberrance in bone marrow mesenchymal stem cells derived from multiple myeloma patients, which can modulate the chemotactic migration of myeloma cell lines when they directly interact with each other.

中图分类号:

R394.2

费小明，李俊霞，汤郁，雷芳，陆化. 骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞可异常影响骨髓瘤细胞株的趋化功能[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8037-8042.

Fei Xiao-ming, Li Jun-xia, Tang Yu, Lei Fang, Lu Hua. Bone marrow mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients aberrantly affect chemotactic function of myeloma cell lines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8037-8042.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞体外培养的形态学观察 10例骨髓瘤患者和7例正常人的骨髓间充质干细胞均能在体外生长、传代，细胞贴壁生长，呈梭形，大小均一。显微镜下观察正常人与骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的形态、生长方式等无明显差别，与既往观察结果类似^[12-13] 。
2.2 骨髓间充质干细胞与U266直接共培养后对骨髓瘤细胞株迁移的影响前期MTT和流式细胞术检测发现(图1，2)，在1-50 nmol/L的范围内，硼替佐米对U266细胞生长抑制率和凋亡率均随着浓度的升高而增加。但在不超过2.5 nmol/L浓度时，硼替佐米对U266细胞的抑制率和凋亡率与对照组无明显差异。根据上述结果，选取2.5 nmol/L浓度进行随后的实验。

首先，比较骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞分别与U266细胞直接共培养后，对骨髓瘤细胞株Transwell迁移的影响。U266细胞在与骨髓间充质干细胞共培养48 h后，虽然对基质细胞衍生因子1的迁移率没有明显变化，但与骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞共培养后U266细胞在RPMI-1640的基础迁移率高于与正常人骨髓间充质干细胞共培养的U266细胞(图3；随机样本t 检验，P < 0.05)。其次，2.5 nmol/L硼替佐米加入共培养体系后，结果发现U266细胞与骨髓间充质干细胞共培养48 h后，各组U266细胞RPMI-1640的基础迁移率和基质细胞衍生因子1的迁移率均下降。此外，与骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞共培养后的U266细胞在RPMI-1640的基础迁移率，仍高于与正常人骨髓间充质干细胞共培养的U266细胞(图3；随机样本t 检验，P < 0.05)。

2.3 骨髓间充质干细胞培养液上清对U266细胞迁移的影响在用基质细胞衍生因子1、骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养液上清和正常人骨髓间充质干细胞培养液上清作为U266细胞的趋化刺激物时，结果提示骨髓瘤患者和正常人骨髓间充质干细胞培养液上清均为较强的趋化刺激剂，细胞的Transwell迁移率要高于基质细胞衍生因子1(图4；配对样本t 检验，P < 0.05)。如果经2.5 nmol/L硼替佐米处理48 h后，U266细胞对基质细胞衍生因子1、骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养上清和正常人骨髓间充质干细胞培养上清的迁移能力均比未处理组明显降低(图4；随机样本t 检验，P < 0.01)。
但是，不论有无硼替佐米处理，U266对骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞上清的Transwell迁移无明显区别(随机样本t 检验，P > 0.05)。

2.4 骨髓间充质干细胞对U266趋化因子受体mRNA表达的影响在骨髓间充质干细胞与U266细胞株共培养48 h后，与作为对照的单独培养组比较，CCR1、CCR2、CCR6 mRNA的相对表达量不论是在骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞还是正常人骨髓间充质干细胞均明显升高(表2，配对t 检验，P < 0.05)，c-Met的相对表达量在共培养前后无明显变化(表2，配对t 检验，P > 0.05)。
但是，骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞对U266细胞的CCR3、CXCR4 mRNA相对表达量的影响不一致，骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞共培养组U266细胞的CXCR4相对表达量较单独培养组减低(表2，配对t 检验；P < 0.05)，而CCR3的相对表达量则较单独培养组上升(表2，配对t 检验；P < 0.05)；正常人骨髓间充质干细胞共培养组U266细胞的CCR3和CXCR4 mRNA相对表达量则与单独培养组无明显变化(表2，配对t 检验；P > 0.05)。
在骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞共培养组间比较中，除了CCR1 mRNA相对表达量在骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞组有明显增高外(表2，随机样本t 检验；P < 0.05)，其他检测基因mRNA表达水平在两组间均无明显差异(表2，随机样本t 检验；P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外对照观察。
1.2 时间及地点于2011年3月至2015年11月在江苏省人民医院和江苏大学附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 标本来源骨髓分别来源于初诊的骨髓瘤患者和正常人，采集前均经其书面同意，并由伦理委员会审核通过。骨髓瘤患者10例，其中男6例，女4例，年龄38-73岁(中位年龄56岁)。正常人7人，其中男4人，女3人，年龄31-75岁(中位年龄58岁)。
1.3.2 主要仪器和试剂实时定量PCR扩增仪(Mx3000P，Stratagene公司)、核酸蛋白检测仪(Eppendorf公司)、光学显微镜(BX50，Olympus公司)、四色流式细胞仪(BD公司)）、96孔板和培养皿(Corning公司)、低糖DMEM及RPMI 1640培养液(Hyclone公司)、胎牛血清与胰酶(Gibco公司)、人淋巴细胞分离液(天津灏洋公司)、Trizol试剂(Invitorgen公司)、反转录试剂盒(Fermentas公司)、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)、MTT试剂盒(Trevigen公司)、硼替佐米(Millenuim Pharniaceuticals公司)、Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒(BestBio公司)、孔径8 μm Transwell培养板(Corning公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞的分离、培养分离和培养骨髓间充质干细胞方法同课题组既往报道^[12-13]。收集第3-5代骨髓间充质干细胞用于实验。部分正常人骨髓间充质干细胞(N-MSC)或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞(MM-MSC)的培养液上清收集后于-40 ℃冻存后备用。U266购买于博慧斯(无锡)生物医药科技有限公司，于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养传代。
1.4.2 骨髓间充质干细胞与U266细胞直接共培养取第2-4代骨髓间充质干细胞作为共培养细胞，待细胞生长至60%-70%融合时，每皿分别加入2×106 U266细胞，培养液为含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，含或不含2.5 nmol/L硼替佐米。将上述细胞置于体积分数为5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中继续培养48 h后，小心吸取培养皿中的培养液至干净离心管中，1 000 r/min离心 5 min后，收集U266细胞用于后续实验。
1.4.3 实时定量 RT-PCR 引物设计参照GenBank提供的mRNA完整序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计CCR1、CCR2、CCR3、CXCR4、CCR6、c-Met及GAPDH基因上下游引物，由上海生物工程技术公司合成(表1)。按Trizol试剂操作说明提取收集的U266细胞总RNA。按M-MLV反转录酶反转录试剂盒说明书合成cDNA，65 ℃反应5 min，42 ℃放置1 h。实时定量PCR反应采用20 μL反应体系，包括2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，cDNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL，灭菌ddH2O 8 μL。PCR循环参数为：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，72 ℃ 2 min后检测荧光。每个样本重复测定2次。实时定量PCR扩增后的Ct值分别代入标准曲线方程进行计算，以目的基因/GAPDH比值代表相应基因的相对表达水平。

1.4.4 骨髓瘤细胞株Transwell迁移实验参照既往报道的方法^[14-15]，将不同处理后的U266细胞收集离心后，用无血清1640培养液重悬，调整细胞浓度为10×109 L-1。取Transwell板，在下室中加入600 μL基质细胞衍生因子1趋化液(100 μg/L)，在小室上层加入200 μL细胞悬液，使细胞密度为2×106/孔，置于体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中。12 h后取出小室，显微镜下计数由上室进入下室的细胞。细胞相对迁移率(%)=(下室细胞数/2×106)×100%。
1.5 主要观察指标 ①各种处理条件下骨髓瘤细胞株的Transwell趋化能力。②各种处理条件下下骨髓瘤细胞株的趋化相关基因mRNA表达水平。
1.6 统计学分析结果以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0统计软件包处理。组间比较用配对或随机样本的t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

多发性骨髓瘤细胞在病程的大多数时间内定植于个体的骨髓内，这提示骨髓微环境一方面为多发性骨髓瘤提供必要的生存环境^[14-15]，另外骨髓中也存在复杂的调控机制，通过趋化、穿血管壁、归巢等过程来确保多发性骨髓瘤细胞定植于骨髓中^[16-17]。多发性骨髓瘤患者的骨髓微环境中存在多种细胞(生长)因子、血管生成、成骨和破骨等多种失衡，并被认为与多发性骨髓瘤发生、发展密切相关^{[3-6，18-19]}。所以，骨髓微环境的研究是近年来多发性骨髓瘤研究一个重要方向。
既往多项研究提示，多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞即使经分离、体外传代培养后也仍然表现各种异常^[9-12]。课题组既往研究还发现，骨髓瘤细胞与正常人骨髓间充质干细胞相互作用后，也会诱导骨髓间充质干细胞表现为多种基因表达的改变^[13]。但是正常人或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞与骨髓瘤细胞相互作用后，对骨髓瘤细胞趋化迁移的影响，目前尚不清楚。本实验提示，骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞与正常人骨髓间充质干细胞与U266细胞共培养后，U266细胞的基础Transwell迁移率，趋化相关因子表达谱在两组间均有区别。这些检测的趋化相关基因，多数与多发性骨髓瘤细胞的恶性行为相关^[20-24]。例如CCR1与多发性骨髓瘤细胞的生长和诱导骨骼破坏有关^[23-24]。本研究结果提示，骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞明显上调U266细胞的CCR1表达。
有意思的是，U266细胞对骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞或正常人骨髓间充质干细胞培养液上清Transwell迁移率，在这两组间并没有明显区别。这提示骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞对骨髓瘤细胞趋化迁移的影响也许主要是通过细胞间直接接触，而不是通过可溶性因子来传递的。因为多发性骨髓瘤细胞与周围微环境的相互作用，有时是通过可溶性因子来完成^[13，25-26]，另一些情况下则通过细胞直接接触来进行^[27-28]。
硼替佐米在体内外均对骨髓瘤细胞有明显的抑制、杀伤作用^[29]。但有研究提示骨髓微环境中的骨髓间充质干细胞，可以减弱硼替佐米对骨髓瘤细胞的抑制作用^[30-31]。本研究结果提示，硼替佐米可以抑制骨髓间充质干细胞对U266细胞迁移、多种趋化相关因子mRNA表达，但并不能消除骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞与正常人骨髓间充质干细胞间对骨髓瘤影响的区别，这提示硼替佐米在治疗时，虽然可以显著杀伤骨髓瘤细胞，但是对异常的骨髓微环境作用也许有限。因为硼替佐米主要通过抑制NF-κB通路等机制来杀伤骨髓瘤细胞^[29]。骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞异常涉及许多不同方面^[9-12]，这其中许多异常不受或不完全受硼替佐米的调节。另外，有些间充质干细胞的生物学功能如成骨细胞分化，虽然受NF-κB通路影响，但这些功能并不参与调节周围其他细胞的迁移趋化^[32]。
综上所述，相对正常人的骨髓间充质干细胞而言，骨髓瘤患者的间充质干细胞可以更加明显促进骨髓瘤细胞株U226的Transwell趋化能力，以及上调CCR1等mRNA水平的表达。此外，硼替佐米并不能完全消除骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞对骨髓瘤细胞趋化功能的异常影响，这提示对于骨髓瘤这一存在明显骨髓微环境异常的疾病，当前治疗方法并不能消除骨髓微环境的异常，因此非常需要加强如何纠正异常肿瘤微环境的研究，从而进一步提高治疗效果。

骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞可异常影响骨髓瘤细胞株的趋化功能

Bone marrow mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients aberrantly affect chemotactic function of myeloma cell lines

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