兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.002

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8043-8047.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.002

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兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

杨俊丽¹，韩霞²，孙明启³，李云霞¹

内蒙古医科大学附属医院，¹保健所，²干细胞实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010000；³内蒙古医科大学第二附属医院创伤科，内蒙古自治区呼和浩特市 010000

收稿日期:2015-10-18 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 李云霞，教授，内蒙古医科大学附属医院保健所，内蒙古自治区呼和浩特市 010000
作者简介:杨俊丽，女，1982年生，内蒙古自治区巴彦淖尔市人，汉族，2011年内蒙古医科大学毕业，硕士，医师，主要从事干细胞的研究及应用和健康管理研究。
基金资助:
内蒙古医科大学青年创新基金(YKD2014QNCX014)

Primary culture and biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells from a rabbit

Yang Jun-li¹, Han Xia², Sun Ming-qi³, Li Yun-xia¹

1Health Centre, 2Laboratory of Stem Cells, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3Department of Traumatic Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2015-10-18 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Li Yun-xia, Professor, Health Centre, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Yang Jun-li, Master, Physician, Health Centre, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
Mesenchymal Stem Cells; Cell Separation; Cell Culture Techniques; Tissue Engineering
Funding: the Youth Innovation Fund of Inner Mongolia Medical University, No. YKD2014QNCX014

摘要/Abstract

摘要：

背景：兔来源的骨髓间充质干细胞是具有较强的体外增殖和多系统分化潜能的成体干细胞，在组织工程及生物治疗领域蕴藏着巨大的潜能。
目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞，观察骨髓间充质干细胞的生物学特征。
方法：无菌条件下抽取兔骨髓，分别运用全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞，利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。在显微镜下观察细胞形态特征及生长规律，流式细胞技术检测细胞表面抗原标记物的表达。
结果与结论：兔骨髓间充质干细胞贴壁时间短，增殖快，经过细胞传代后能够获得进一步纯化的细胞，杂质细胞减少。原代细胞形态即呈现三角形、长梭形、纺锤形的贴壁细胞特征。第 5代骨髓间充质干细胞呈典型的极性漩涡状生长，形态单一均匀，不具有表达造血前体细胞表面标志抗原CD34和白细胞表面标志抗原CD45的表面标记物功能，但是具有能够表达出整合素家族的成员 CD29 及黏附分子CD44的特点。说明经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性，经流式细胞分析鉴定为兔骨髓间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 细胞培养, 原代培养, 生物学特征, 表面标志物, 兔

Abstract:

BACKGROUND: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells as a kind of adult stem cells with strong proliferation and multilineage differentiation potential exhibit a tremendous application potential in tissue engineering and biological therapy.
OBJECTIVE: To in vitro culture, proliferate and identify rabbit bone marrow mesenchymal stem cells and to observe cell biological characteristics.
MEHTODS: Bone marrow of rabbits was extracted under sterile conditions to separate bone marrow mesenchymal stem cells using the whole bone marrow adherence method and Percoll density gradient centrifugation method. Afterwards, the cells were purified and proliferated using differential adherence method. Morphology and growth pattern of cells were observed under microscope, and expression of cell surface antigen markers was detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells presented with short adherent time and fast growth. After passage and purification, impurities cell counts were decreased. Primary cells presented with triangular, fusiform and spindly shapes. Passage 5 cells with single shape showed the typical polar swirling growth, and could not express CD34 and CD45, but expressed CD29 and CD44. These findings indicate that the cells cultured using the whole bone marrow adherence method and Percoll density gradient
centrifugation method possess stem cell characteristics in morphology, surface markers and multilineage differentiation, which have been identified as bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry.

中图分类号:

R394.2

杨俊丽，韩霞，孙明启，李云霞. 兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8043-8047.

图/表（结果） 3

2.1 实验技术路线实验流程技术路线图见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态原代细胞在培养孵育2 d或3 d后，可见少量单个核细胞贴壁生长，多为零散的短柱性、三角形或多角形细胞。第4或5天全量换液后，可见有大量的分散的骨髓间充质干细胞集落，细胞逐渐转变为长梭形，细胞核为圆形或椭圆形，细胞胞浆内偶可见较多的颗粒。在细胞生长的第6-9天时，细胞生长明显加快迅速，细胞小集落逐渐出现相互融合，可见3-5个细胞集落相互融合成为一个较大的细胞群，形成细胞大集落。细胞直接密集排列，也可呈车轮样辐射状生长。在细胞生长的第10-14天，少见或者不见较小的散在细胞集落，细胞群之间大部分融合，几乎铺满整个培养瓶瓶底，细胞形态规则，均匀，为大小形态均一致的长梭形，细胞之间紧密排列，呈旋涡状或菊花状(图2)。经传代后，特别是第3代细胞后，在显微镜下观察，细胞形态均一，呈长梭形贴壁生长，外形呈现鱼肉状生长[8]。经Percoll密度梯度离心法和全骨髓贴壁法两种方法获得的细胞在细胞形态及生长特征上无明显差异。
细胞传代培养后，增殖速度明显加快，24 h时可见部分细胞贴壁，细胞形态更为均一，多为三角形或长梭形，细胞之间可形成较小的细胞集落，细胞排列更加整齐。细胞培养三四天后，可见较小的细胞集落相互融合成片状，细胞融合至80%以上。培养第6-8天时，细胞多呈长梭形，细胞群偶见呈流水旋涡状，细胞融合至90%以上，细胞排列整齐有序，少见杂质细胞，多次传代后细胞呈更均匀有序的分布。

2.3 骨髓间充质干细胞的生长经全骨髓贴壁法获得的细胞，在原代细胞培养2 d内处于生长潜伏期，细胞整体生长比较缓慢，第3-5天时进入对数增长期，第6-8天为平台期，细胞仍然快速生长，细胞生长的第10-14天细胞铺满瓶底，增殖缓慢。经换液后,显微镜下观察，可见非贴壁细胞逐渐减少，贴壁细胞逐渐呈克隆样生长，呈放射样、爆花样或漩涡样(图3)。
经密度梯度离心法获得的原代骨髓间充质干细胞2 d或 3 d首次换液后，可见少量单个核细胞贴壁生长。4 d或5 d可见分散的骨髓间充质干细胞小集落。6-9 d时细胞迅速生长，2-5个小的细胞集落逐渐相互融合，行成细胞大集落，细胞密集，占瓶底70%左右，10-14 d细胞大部分融合。2种方法培养的细胞经传代培养后，细胞生长增殖速度明显加快，24 h时细胞已经贴壁。细胞形态更为均一，多为长梭形或多角形，细胞排列更加密集、整齐。第3代细胞增殖速度明显加快，三四天细胞便开始融合成片，贴壁细胞铺满瓶底最多达80%以上，6-8 d贴壁的细胞可融合达90%以上，10 d细胞铺满瓶底(图4)。

2.4 骨髓间充质干细胞的表面标志物流式细胞术结果显示，原代细胞表面标志物的阳性比例为CD29 62.4%，CD44 60.3%，CD45 2.79%，CD34 2.79%；第5代细胞表面标志物的阳性比例为CD29 98.4%，CD44 99.0%，不表达 CD45、CD34。所获得的细胞骨髓来源符合间充质干细胞常用标准[9]。
2.5 骨髓间充质干细胞冻存及复苏经冻存的第5-9代细胞进行细胞复苏，复苏4 h后贴壁率约60%，细胞增长活跃。细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。冻存传代骨髓间充质干细胞，复苏后生长活跃、繁殖迅速，可继续传代培养。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学研究。
1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年6月在内蒙古医科大学基础医学院微生物与免疫实验中心及内蒙古医科大学附属医院干细胞实验室完成。
1.3 材料

实验动物：选取普通级健康日本大耳白兔3只，雌雄不限，兔龄(10±2)个月，体质量为(2 500±100) g。实验用动物由经内蒙古医科大学伦理委员会批准的内蒙古医科大学实验动物中心提供，动物许可证号为：SCXK(蒙)2015- 0001。动物实验过程符合2006年科技部《关于善待实验动物的规定》^[4]。
1.4 方法
1.4.1 兔骨髓的抽取碘酒乙醇浸泡大耳白兔双耳消毒后，于耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，采取仰卧位将兔四肢及头部固定于兔台上，行髂前上棘骨髓穿刺，抽取5 mL骨髓液，5 g/L肝素抗凝。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离与培养
密度梯度离心法[5]：将抽取的骨髓加入等量PBS溶液混匀，室温1 000 r/min离心6 min，弃骨髓混合溶液的上层脂肪组织及上清液，进行Percoll密度梯度离心法：加入等量Percoll分离液(调节分离液密度为1.073 g/mL)，4 ℃ 2 500 r/min离心20 min。离心后可以使细胞分层，呈云雾状白膜层的的细胞层即为实验所需的单核细胞层，轻轻用吸头吸取单核细胞层的单个核细胞。将分离的单核细胞置于新的离心管中，加入PBS再次离心5 min，吸弃上清液后加入α-MEM培养基(含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素及链霉素)悬浮，充分混匀，放置于37 ℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养。
全骨髓贴壁法[6]：将骨髓液注入等体积的Hanks液离心管中，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清液，Hanks液洗，充分混匀，吸取少量细胞液，用0.4%锥虫蓝染色，计数活细胞比例> 95%。将全部细胞液移入到含有体积分数20%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素的L-DMEM培养液中，调整细胞液浓度为1×106/cm2接种， 37 ℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度培养。
培养两三天后半量换液，根据观察细胞生长状态给予每3 d或4 d全量换液。培养10-14 d时，细胞逐渐融合，融合80%以上，进行细胞传代：弃去培养液后，用0.25%胰蛋白酶进行消化1.0-2.0 min后，按1∶2比例传代培养。每2 d或3 d更换培养液1次。每日在倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化。
1.4.3 骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制取原代及第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入L-DMEM培养液中，调节细胞浓度为1×108 L-1，接种于24孔板中，1 mL/孔。37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养。每天取3孔细胞，用0.25%胰酶消化，细胞计数板计数，结果取平均值，绘制细胞生长曲线。
1.4.4 骨髓间充质干细胞的细胞表面标志物鉴定^[7] 取原代细胞及第5代细胞，0.25%胰蛋白酶消化1.0-2.0 min后，PBS终止消化，调整细胞浓度至(5-10)×108 L-1，各管分别加入抗兔CD29，CD44，CD45，CD34一抗，37 ℃孵育20 min，按照说明书依次加入二抗，37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度孵育20 min，PBS洗3次，0.5 mL的PBS重悬，将离心管置于冰上备用，流式细胞仪分析。
1.4.5 骨髓间充质干细胞的冻存采用慢速冻存法冻存细胞：先将第5-9代细胞放置于细胞冻存管中，置于4 ℃冰箱中存放1 h，然后-30 ℃冻存2 h，-70 ℃过夜，最后将细胞转移到液氮中保存。
1.4.6 骨髓间充质干细胞的复苏将传代后冻存的细胞进行细胞复苏，复苏第5-9代冻存的兔骨髓间充质干细胞，将细胞悬液置于α-MEM培养基(内含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)。每3 d或4 d换细胞培养液1次。
1.5 主要观察指标原代及传代细胞的形态及增殖变化和细胞表面标记物的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行数据分析，对全骨髓贴壁法及Percoll密度梯度法培养的细胞进行细胞计数，数据采用平均值表示，两组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法原代培养获得的兔骨髓间充质干细胞生长状态良好，有生长晕，立体感强^[10]。细胞生长表现为平行或漩涡状分布，在相差显微镜下为形态较为均一的小梭形细胞。大而扁的细胞很少。经过反复贴壁培养多次传代后，细胞纯度增高，细胞均一性明显。本实验发现采用全骨髓贴壁法分离的骨髓间充质干细胞，第一次换液时已经出现了超过50%以上的贴壁细胞，此后同一时期观察发现贴壁细胞比例略多于Percoll密度梯度离心法，但差异无显著性意义。Percoll密度梯度离心法原代培养所获得的贴壁细胞数量相对较少，细胞生长缓慢，活性较低，但2种方法获得的细胞传代后无明显差异，原代细胞首次融合仅需10 d左右，细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。
虽然目前国内外关于骨髓间充质干细胞鉴定仍然存在一些质疑和争议，骨髓间充质干细胞的鉴定没有统一的标准，但是采用流式细胞分析检测技术还是目前最有鉴定价值的检测手段。通过本实验流式细胞术显示原代细胞与第5代细胞的表面标志物有所不同，可能是原代细胞通过密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养后，还存在一些其他的杂细胞在骨髓中仍然并存生长，而经过多次传代后，杂细胞的数量和种类逐渐减少，最终显现出来的就是第5代细胞可以高表达CD29和CD44，不表达CD45和CD34。经大量扩增后如何保持骨髓间充质干细胞的生物学特征性及其分化潜能是否有变化的问题仍需进一步研究。
有研究发现存放细胞并不是无限期的。即使在液氮中保存细胞，随着保存年数的增加，细胞存活率会下降，5年细胞存活率仅为40%-55%，所以建议每5年将种子细胞
复苏后扩增再冻存，这样可以确保种子细胞的存活率^[11]。有报道称，除增殖和分化潜能外，骨髓间充质干细胞表面只表达主要组织相容性复合体Ⅰ类分子，具有低免疫原性，可明显减少同种异体的移植排斥反应，在干细胞移植和治疗领域是非常理想的干细胞来源^[12]。应用于组织工程的种子细胞有多种，如胚胎干细胞、脐血间充质干细胞和骨髓间充质细胞等。骨髓间充质干细胞是成骨细胞的前体细胞，具有自我更新能力和向多种种组织、器官分化的潜能，也是临床、科研方面骨再生工程最理想的种子细胞，具有重要的临床应用前景^[13]，同时对人类临床医学的细胞治疗提供方法借鉴^[14]。也为本课题的下一部分实验即干细胞的移植治疗打下了坚实的理论和实验基础。
总之，在本次实验中进行了细胞的体外分离、培养，观察细胞形态学及生长增殖变化规律，并通过流式细胞术进行鉴定细胞表面抗原表达，为获得纯化的骨髓间充质干细胞并进而为研究其作为种子细胞治疗多种临床中棘手的难治性疾病提供了实验基础和依据，而且为骨髓间充质干细胞在细胞学研究领域的应用提供了进一步的实验技术支持。虽然关于骨髓间充质干细胞鉴定仍然存在一些质疑，实验的最终目的即是在通过全骨髓贴壁法和密度梯度离心法两种方法进行体外分离培养骨髓间充质干细胞，以此获取大量细胞，可为今后细胞实验奠定实验技术基础，也为作者所在课题组的下一部分实验的顺利进行做足种子细胞的准备。

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