let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.003

中国组织工程研究

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响

李明哲，龚哲，王静，王以文，姚要兵，侯晓灿，焦淑洁，滕军放，贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052

收稿日期:2015-11-08 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 贾延劼，博士，郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052
作者简介:李明哲，女，1990年生，河南省宝丰县人，汉族，硕士，主要从事microRNA Lin28/let-7研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目：骨髓间质干细胞神经命运决定中的自噬现象及其mTOR 信号通路的作用(81071114)；Lin28/Let-7 调控的骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究(81371385)

let-7f effects on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

Li Ming-zhe, Gong Zhe, Wang Jing, Wang Yi-wen, Yao Yao-bing, Hou Xiao-can, Jiao Shu-jie, Teng Jun-fang, Jia Yan-jie

Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Received:2015-11-08 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Jia Yan-jie, M.D., Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Li Ming-zhe, Master, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Interleukin-6; Cell Proliferation; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81071114, 81371385

摘要/Abstract

摘要：

背景：microRNA let-7f和炎性因子白细胞介素6对骨髓间充质干细胞的具体作用及两者之间是否存在联系尚不可知。
目的：分析let-7f及白细胞介素6表达水平对骨髓间充质干细胞增殖的影响及两者的关系。
方法：①构建let-7f过表达及抑制慢病毒载体，分别转染SD大鼠骨髓间充质干细胞，实验分为4个组：转染上调组(转染LV-rno-let-7f-up)、转染下调组(转染LV-rno-let-7f-down)、阴性转染组(转染空病毒)、未转染组(不进行病毒转染)。 qRT-PCR检测各组细胞let-7f表达水平。MTT法、流式细胞术和ELISA等方法检测不同let-7f表达水平下细胞增殖情况及白细胞介素6表达水平，qRT-PCR及Western blot检测各组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平。②预测let-7f潜在的靶基因，构建野生型/突变型白细胞介素6 3’UTR报告基因载体，分别与let-7f/let-7f inhibitor共转染293T细胞系，测定荧光素酶活性。
结果与结论：let-7f转染上调组较未转染组及阴性转染组细胞增殖能力及克隆能力明显增强，G1期细胞数明显减少，S期明显增多，凋亡减少(P < 0.05)；转染下调组结果与其相反。let-7f转染上调组细胞培养液中的白细胞介素6表达水平低于未转染组及阴性转染组(P < 0.05)；转染下调组细胞培养液中的白细胞介素6则明显升高(P < 0.05)；Western blot、定量PCR显示let-7f转染上调组Cyclin D1蛋白及mRNA表达上调(P < 0.05)；转染下调组表达均下调(P < 0.05)；未转染组与阴性转染组所有结果无明显差异(P > 0.05)。野生型白细胞介素6 3’UTR报告基因载体与let-7f共转染细胞的荧光素酶活性显著减低(P < 0.05)。结果表明上调let-7f表达水平可显著促进骨髓间充质干细胞增殖活性及克隆形成能力，减少凋亡，而下调let-7f表达水平则出现抑制作用。白细胞介素6过表达可抑制骨髓间充质干细胞增殖，考虑白细胞介素6是let-7f的靶基因，let-7f可能通过抑制白细胞介素6表达而促进细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞增殖, let-7f, 骨髓间充质干细胞, 慢病毒, 白细胞介素6, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There is no clear understanding about the effect of let-7f and interleukin-6 (IL-6) on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and their relationship.
OBJECTIVE: To explore the effects of expression levels of let-7f and IL-6 on the proliferation of bone
marrow mesenchymal stem cells and their relationship.
METHODS: (1) LV-rno-let-7f-up and LV-rno-let-7f-down were constructed and transfected into bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats, respectively. Then, there were four groups in the study: transfection upregulation group transfected with LV-rno-let-7f-up), transfection inhibition group (transfected with LV-rno-let-7f-down), negative control group (transfected with FU-RNAi-NC-LV), and untransfected group. The expression level of let-7f in each group was detected by qRT-PCR. The proliferation ability of cells and expression levels of IL-6 when let-7f expression was at different levels were detected by MTT, flow cytometry and ELISA. The expression of Cyclin D1 at mRNA and protein levels was detected by qRT-PCR and western blot, respectively. (2) To predict the potential target gene of let-7f, the wild-type/mutant IL-6 3’UTR reporter gene vectors were constructed, and cotransfected with let-7f/let-7f inhibitor respectively into the 293T cells to measure the luciferase.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the negative control group, the proliferative and cloning capacities of cells in the transfection upregulation group were higher; the number of cells was significantly decreased at G1 stage and increased at S stage, and the apoptotic cells were reduced in number (P < 0.05). However, the transfection inhibition group had opposite results. The expression level of IL-6 in the transfection upregulation group was lower than that in the untransfected group and negative control group (P < 0.05); while in the transfection inhibition group, the expression level of IL-6 was significantly increased (P < 0.05). The expression of Cyclin D1 at mRNA and protein levels was up-regulated in transfection upregulation group (P < 0.05) and down-regulated in the transfection inhibition group (P < 0.05), but there was no significant difference between the negative control group and untransfected group (P > 0.05). Luciferase activity of cells transfected with wide-type IL-6 3’UTR and let-7f was significantly reduced (P < 0.05). These findings indicate that up-regulation of let-7f can promote the proliferative and cloning capacities of bone marrow mesenchymal stem cells and reduce cell apoptosis, but downrelation of let-7f exhibits an inhibitory effect. Overexpression of IL-6 can suppress the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, which is considered to be a target gene of let-7f, and let-7f may suppress the expression of IL-6 to promote the cell proliferation.

中图分类号:

R394.2

李明哲，龚哲，王静，王以文，姚要兵，侯晓灿，焦淑洁，滕军放，贾延劼. let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.003.

图/表（结果） 9

2.1 实验流程见图1。
2.2 let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响
2.2.1 let-7f 过表达和抑制慢病毒载体的构建　GV159载体经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示载体中位于两酶切位点间的原有片段被分离，载体被切割成线性，挑选阳性克隆送测序，结果证明大鼠let-7f过表达和抑制慢病毒载体构建成功。孔稀释法病毒滴度测定示let-7f过表达慢病毒载体滴度为1.5×109 TU/L，let-7f抑制慢病毒载体滴度为1×109 TU/L，空白病毒滴度为8×1011 TU/L。

2.2.2 慢病毒转染骨髓间充质干细胞采用含有绿色荧光报告基因(EGFP)标记的病毒载体观察、评估转染效率。观察发现转染3 d后，倒置显微镜观察及荧光显微镜 480 nm激发光可见接近80%以上细胞均有绿色荧光(图2)，3组之间无明显差异。

2.2.3 各组细胞中let-7f相对表达量收集干预后5 d细胞，采用qRT-PCR方法检测let-7f相对表达量(图3)。经统计学分析显示：未转染组细胞let-7f的表达水平与阴性转染组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；而转染下调组细胞let-7f的表达水平与其他3组比较显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；转染上调组细胞let-7f的表达水平与其他3组比较显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。说明转染上调组细胞中 let-7f表达水平为上调，而转染下调组细胞中let-7f表达水平为下调，符合实验设计要求。

2.2.4 MTT检测各组细胞增殖活力在预设干预条件下，各组吸光度值均随时间延长而增高，但增幅不同，在第3天增长幅度最大。经统计得出：第2，3，4天，与未转染组相比，let-7f对细胞增殖活力有明显促进作用 (P < 0.05)，而抑制let-7f对细胞增殖活力有明显抑制作用(P < 0.05)，空病毒对细胞增殖无明显影响(P > 0.05)。在第0，1天，4组吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.2.5 流式细胞术检测细胞周期未转染组与阴性转染组在G1期、S期和G2期细胞所占比例差异无显著性意义 (P > 0.05)；转染上调组G1期细胞所占比例小于未转染组 (P < 0.05)，S期细胞所占比例大于未转染组(P < 0.05)；转染下调组G1期细胞所占比例大于未转染组(P < 0.05)，S期细胞所占比例小于未转染组(P < 0.05)。4组G2期所占比例无明显差异。结果表明上调let-7f能明显促进细胞进入S期，反之能将细胞阻滞在G1期(图5，表2)。

2.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率未转染组与阴性转染组凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；转染上调组凋亡率小于未转染组(P < 0.05)；转染下调组凋亡率大于未转染组(P < 0.01)，见图6，表2，表明上调let-7f能有效抑制细胞凋亡。

2.2.7 各组细胞Cyclin D1蛋白表达差异 Western blot 结果显示，干预3 d后，未转染组、阴性转染组、转染上调组和转染下调组蛋白相对表达量分别为0.70±0.07、0.71± 0.05、0.95±0.16和0.52±0.06，上调let-7f能促进Cyclin D1蛋白表达(P < 0.05)，而抑制let-7f则下调Cyclin D1表达 (P < 0.05)，阴性转染组与未转染组比较差异均无显著性意义 (P > 0.05)，见图7，表明干预let-7f表达能调节细胞周期素蛋白表达。

2.2.8 各组细胞 cyclin D1 mRNA表达差异 qRT-PCR检测各组 cyclin D1 mRNA表达情况与 Western blot结果相符，阴性转染组、转染上调组和转染下调组cyclin D1的 mRNA表达量分别为未转染组的(0.98±0.02)倍、(2.05± 0.14)倍和(0.61±0.03)倍，阴性转染组与未转染组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。结果说明上调let-7f能正性调节cyclin D1 mRNA表达。

2.3 let-7f与白细胞介素6的关系
2.3.1 各组细胞白细胞介素6表达水平差异 ELISA检测分析结果显示：阴性转染组与未转染组白细胞介素6表达水平无明显差异，转染上调组白细胞介素6表达水平较未转染组下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，转染下调组白细胞介素6表达水平较未转染组升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

2.3.2 let-7f靶基因预测及能否特异性结合白细胞介素6 3’UTR 通过TargetScan、miRanda、DIANA-microT等靶基因软件预测let-7f的靶基因，发现白细胞介素6是let-7f潜在的靶基因，且分析预测let-7f与白细胞介素6基因结合调控区(图10A)。
为进一步明确let-7f是否能靶向结合白细胞介素6 3'UTR，在293T细胞中将不同组合的let-7f mimics、NC mimics、let-7f inhibitor、NC inhibitor、IL6-Mt及 IL6-Mut 进行共转染。转染 48 h后检测荧光素酶活性发现，过表达let-7f与对照细胞相比明显抑制野生型白细胞介素6载体的荧光素酶活性(P < 0.05)，然而抑制let-7f表达则抵消这种作用，并且过表达let-7f不能抑制突变型白细胞介素6载体的荧光素酶活性(图10B)。以上结果说明let-7f可特异性地结合白细胞介素6 3’UTR。

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引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是干细胞家族的重要成员，具有多向分化潜能，在特定的诱导条件下可在体内或体外分化为骨、软骨、韧带、肌腱、肌肉、脂肪、肝、心肌、内皮、神经等多种组织细胞[1-6]。由于具有取材广泛、易于分离培养、易于扩增、低免疫原性、体外培养仍能保持多向分化潜能等优点而被认为是最适合用于神经系统的种子细胞。
骨髓间充质干细胞的增殖受细胞微环境多种因素的影响。miRNA(microRNA)是一类短小的非编码单链小分子RNA，通过转录后对基因表达发挥着重要调控作用^[7]。多项研究表明，miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、分泌、迁移、恶性转化等方面具有重要调控功能^[8-10]，在生物体的生长发育、信号转导通路、组织器官分化、疾病的发生发展等复杂的生物学过程中亦扮演着重要角色。Lin28/let-7调节环被认为是经典的发育调节分子，主要调控干细胞增殖、分化、衰老及细胞重编程等多个环节^[11-12] 。
微环境中炎性反应对骨髓间充质干细胞的增殖分化也有很大影响，炎性细胞释放大量反应性氧化自由基及蛋白酶，从而导致周围组织损伤^[13]。炎症反应多由促炎因子调节，包括肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6等^[14-15]，其中白细胞介素6可增强其他促炎因子的作用^[16-17]。Tan等^[18]通过动物实验证实骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤时，利用抗鼠白细胞介素6受体分子抗体阻断白细胞介素6信号通路可有效提高骨髓间充质干细胞的存活率，部分细胞能分化为神经元细胞及星形胶质细胞，考虑白细胞介素6与移植后骨髓间充质干细胞凋亡程序的启动有关。
本研究旨探究let-7f及白细胞介素6表达水平对骨髓间充质干细胞增殖的影响及两者之间的关系。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2015年3至9月在郑州大学第一附属医院重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄SD大鼠2只，体质量100- 120 g，雌雄不限，购自郑州大学实验动物中心，许可证编号：SCXK(Henan)2005-0001。研究中所有动物的使用均经过郑州大学动物保护委员会同意。
1.3.2 主要试剂 Age Ⅰ、EcoR Ⅰ和T4 DNA ligase购自NEB公司；病毒包装三质粒：GV重组载体系列(同时可表达绿色荧光蛋白)和pHelper 1.0和pHelper 2.0均购自上海吉凯基因化学有限公司；DMEM液体培养基和胎牛血清购自Gibco公司；RNA反转录试剂盒、Gotaq qPCR Master Mix购自美国Promega公司；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度定量试剂购自上海碧云天公司；cyclin D1抗体、兔抗多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；DEPC、miRNA提取试剂盒、噻唑蓝(MTT)购自康为世纪生物科技有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯，所用引物由广州锐博技术有限公司根据设计合成(表1)。

1.4 实验方法
1.4.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养取6-8周龄100-120 g SD大鼠2只，麻醉后断颈处死，严格无菌条件下分离股骨、胫骨，空针抽取5 mL DMEM培养液刺入骨骺端，反复冲洗骨髓腔。收集冲洗液于离心管中300×g离心5 min，弃上清加入细胞培养液，重悬细胞移入培养瓶，置入37 ℃，体积分数为5%CO2孵箱中培养。2 d及4 d后通过半换液及全换液移去未贴壁的细胞。使用倒置显微镜(日本Olympus公司)观察细胞的生长状况，当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶+ 0.04%EDTA消化，将细胞传代培养至3-5代备用。
1.4.2 MicroRNA let-7f过表达和抑制慢病毒载体构建及慢病毒颗粒包装根据miRBase数据库获得rno-let-7f过表达和抑制的序列，PCR方法合成双链DNA oligo。将GV159载体经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下与双链DNA oligo于22 ℃连接3 h转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆PCR鉴定，将构建后的pGC-LV载体与慢病毒包装质粒载体pHelper1.0、pHelper 2.0通过Lipofectamine 2000共转染至293T包装细胞，收集细胞上清液离心浓缩，孔稀释法进行病毒滴度测定，最后将制备好的慢病毒载体放至-80 ℃冰箱冻存备用。
1.4.3 骨髓间充质干细胞的microRNA转染及转染效果鉴定当细胞融合度达70%-80%时，取LV-rno-let-7f-up、LV-rno-let-7f-down、阴性慢病毒以最适转染复数30转染大鼠骨髓间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱内孵育，根据转染情况将同时点的骨髓间充质干细胞分为4组：转染上调组(转染LV-rno-let-7f-up)、转染下调组(转染LV-rno-let-7f-down)、阴性转染组(转染空病毒)、未转染组(不进行病毒转染)。在倒置显微镜下观察荧光表达情况，评价细胞转染效率。
1.4.4 qRT-PCR方法检测各组细胞中let-7f及周期蛋白Cyclin D1 mRNA的表达水平采用康为试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。按照The Reverse Transcription System (Promega)试剂盒操作说明对所提取RNA进行反转录，反转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，总反应体系为20 µL。参照Gotaq qPCR Master Mix (Promega)操作说明对cDNA进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共40个循环。每个扩增反应体系为20 µL，每组样本重复检测3次。以5 S为内参，应用1.5 LightCycler RT-PCR系统(Roche)进行实时定量PCR检测。采用2-??Ct的方法计算mRNA相对表达量(relative quantity，RQ)。
1.4.5 Westen blotting检测骨髓间充质干细胞周期蛋白Cyclin D1的表达水平分别收取各组细胞，PBS漂洗1遍，按106加入100 µL含有PMSF的裂解液(使PMSF终浓度为 1 mmol/L)充分裂解细胞，4 ℃，14 000×g离心10 min，收集上清液，取4 µL蛋白以BCA法测定蛋白浓度，剩余的蛋白按照比例加入上样缓冲液，混匀后煮沸5-10 min，置于-80 ℃保存备用。SDS-PAGE采用5%浓缩胶，8%分离胶，上样量为50 µg，恒压80 V电泳30 min，电泳至分离胶与浓缩胶分界处时，调整电压为100 V，电泳90 min，取出凝胶转移至同等大小醋酸纤维素膜上，转膜后置于封闭液中 2 h，加入兔抗Cyclin D1(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST漂洗 5 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记抗兔IgG(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST漂洗5 min×3次，ECL显色后置放于凝胶成像系统拍摄保存实验结果。应用Quantity One软件来分析各条带的灰度值，用待测蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值来代表此蛋白的相对表达水平。
1.4.6 MTT法检测细胞增殖活力取5个96孔板，每板分成4组，每组7孔，以2.0×103/孔加入各组细胞，于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中继续培养。为避免培养液对吸光值产生干扰，增设调零组(加入培养液，不加细胞)。于0，1，2，3，4 d分别取1个96孔板，每个孔中加入20 µL (5 g/L) MTT溶液，37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育4 h。吸净培养液，每孔加入二甲基亚砜200 µL，振荡10 min。酶标仪检测570 nm波长处各组吸光度值，以时间(d)为横坐标，吸光度值为纵坐标描绘骨髓间充质干细胞增殖曲线。实验重复3次。
1.4.7 流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡率取对数生长期各组细胞，体积分数为70%乙醇固定后重悬，采用碘化丙啶染色，RNase A消化，尼龙网过滤后，流式细胞仪检测细胞周期分布，结果用ModFit软件分析，实验重复3次。再次取各组细胞，Annexin V-FITC染色后上机检测，CellQuest软件分析细胞凋亡率，实验重复3次。
1.4.8 细胞培养液中白细胞介素6水平检测取处于对数生长期的各组细胞的细胞培养液，按照白细胞介素6水平ELISA检测盒说明书进行操作，于450 nm处检测各组吸光度值。
1.4.9 潜在的靶基因预测使用网上在线分析软件miRanda，TargetScan 和DIANA-microT分析预测let-7f与IL-6基因结合调控区(seed region)，进行靶基因预测。
1.4.10 双荧光素酶活性检测采用overlap PCR方法，以大鼠基因组DNA为模本扩增出野生型/突变型IL-6基因3’UTR区，并克隆至psiCHECK-2载体中，构建野生型/突变型报告基因载体。分别与let-7f/let-7f inhibitor共转染293T细胞系。转染48 h后测定荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性=萤火虫荧光值/海肾荧光值。
1.5 主要观察指标 ①慢病毒转染骨髓间充质干细胞的效率。②各组白细胞介素6的表达水平。③转染后细胞生长状态、细胞周期与凋亡率及细胞周期蛋白表达。④双荧光素酶活性。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。定量资料用x(_)±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

影响骨髓间充质干细胞增殖能力的因素很多，其中细胞衰老^[19-20]、低氧浓度^[21]、氧化应激^[16-17]、特殊细胞因子等是影响骨髓间充质干细胞增殖的重要因素^[22-24]。在体外培养随着传代次数的增多，一些分子的改变如端粒酶的缩短也可以导致骨髓间充质干细胞衰老^[25]。Li等^[21]研究发现低氧体积分数(1% O2)对骨髓间充质干细胞增殖具有时间依赖性的促进作用，可能与apelin/APJ/自噬体这一信号通路有关。Wei等^[26]发现活性氧可诱导骨髓间充质干细胞的衰老及凋亡，阻碍其增殖能力，与AKT、p53、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信号分子有关。
MicroRNA在肿瘤发生、增殖作用、造血作用、代谢作用、炎症反应、胚胎生成及神经退行性疾病中起重要作用，其中let-7f在肿瘤发生^[27-28]、炎症反应^[29]、代谢性疾病中的表达具有特异性改变而备受关注^[30]。本实验利用携带EGFP基因的let-7f慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞，并通过qRT-PCR证实其转染效果。通过MTT及流式细胞仪检测显示转染上调组可有效增强骨髓间充质干细胞增殖能力及克隆形成能力，减少凋亡，抑制骨髓间充质干细胞let-7f表达后，细胞数量减少，并通过MTT及流式细胞方法证实其增殖能力及克隆形成能力减弱，凋亡增强。从对细胞周期影响来看，转染上调组与未转染组比较，S期细胞比例升高说明let-7f可促进细胞从G1向S过渡，而转染下调组G1期细胞比例升高，则说明细胞被阻滞在了G1期。在细胞周期调控的多种因子中，cyclin D作为细胞周期的启动因子，作用于G1期，其中cyclin D1是一个最为敏感的指标，cyclin D1与它的分子伴侣CDK4结合成复合物进入细胞核中，从而启动细胞DNA复制，对促进细胞通过G1/S转换点中起着重要作用。因此cyclin D1对细胞周期调控至关重要，在细胞增殖中发挥着重要作用。结果显示，转染上调组Cyclin D1蛋白及mRNA表达水平均较未转染组高。因此认为let-7f可通过调控细胞周期进程参与骨髓间充质干细胞增殖。
Tan等^[18]通过动物实验证实骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤时，利用抗鼠白细胞介素6受体分子抗体阻断白细胞介素6信号通路后可有效提高骨髓间充质干细胞的存活率，并允许部分细胞分化为神经元细胞及星形胶质细胞，考虑白细胞介素6与移植后骨髓间充质干细胞凋亡程序的启动有关，且阻断白细胞介素6信号通路后可有效增加Akt和ERK1/2的表达。本研究中let-7f转染上调组细胞培养液中的白细胞介素6表达水平低于未转染组及阴性转染组；转染下调组细胞培养液中的白细胞介素6则明显升高；未转染组与阴性转染组所有结果无明显差异。印证了Tan等的实验，白细胞介素6对骨髓间充质干细胞的增殖有抑制作用。
关于let-7f是通过何种机制来调控骨髓间充质干细胞的增殖过程，目前并不十分清楚。本研究通过miRanda，TargetScan和DIANA-microT分析预测let-7f与白细胞介素6基因结合调控区，进行靶基因预测，并发现与骨髓间充质干细胞增殖有关的白细胞介素6是其潜在靶基因。将野生型白细胞介素6 3’UTR及let-7f结合位点突变的3’UTR克隆入荧光素酶报告载体中，与let7-fmimics或 inhibitor共转染293T细胞。结果表明let-7f能特异性与IL-6 3’UTR结合抑制荧光素酶活性。但由于在某些状态下靶基因3’UTR序列中的结合位点可被mRNA的构象改变而掩盖，导致该miRNA无法调控靶基因。因此通过ELISA法验证let-7f对白细胞介素6表达的影响，结果显示let-7f能抑制其表达，故考虑白细胞介素6可能是let-7f的靶基因。
本研究初步找到了一个新的调控骨髓间充质干细胞增殖的重要靶点，但还欠缺通过体内实验来验证体外实验的结论，未明确其抑制作用的分子通路，尚需进一步深入研究。

let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响

let-7f effects on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

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