骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合修复关节软骨损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：创伤等导致的关节软骨缺损是国内外骨科界面临的难题，组织工程学技术为软骨缺损的修复提供了新方法。
目的：探讨壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料修复兔膝关节软骨缺损的可行性。
方法：将培养的兔骨髓间充质干细胞种植到壳聚糖支架上体外构建壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料，移植到兔关节软骨缺损处为实验组，不予以特殊处理为对照组。术后6，12周，大体观察以及甲苯胺蓝染色评定两组软骨组织修复情况。
结果与结论：术后6周，对照组仅有纤维组织增生，实验组关节软骨缺损处有软骨样组织生成。术后12周，对照组软骨缺损边缘可观察到少量类透明软骨组织，实验组缺损区完全覆盖有光滑、透明软骨组织。术后12 周，对照组甲苯胺蓝染色较淡，有少量软骨组织生成，实验组甲苯胺蓝染色较明显，缺损完全被透明软骨组织所覆盖，软骨细胞较多。结果表明兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架复合材料能更好的引导软骨组织的生成，促进软骨缺损修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 软骨缺损, 关节软骨, 软骨修复, 组织工程学, 壳聚糖, 细胞支架, 骨髓间充质干细胞, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Trauma easily leads to the emergence of articular cartilage defects, which is a difficult problem in the orthopedics field. Tissue engineering technology provides a new method for cartilage repair.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of combining chitosan and bone marrow mesenchymal stem cells to repair injured articular cartilage in rabbits.

METHODS: Cultured rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto chitosan scaffold, and then the composite material was implanted into the defect as experimental group. Rabbits with no treatment served as control group. Gross observation and toluidine blue staining were carried out at 6 and 12 weeks after operation.

RESULTS AND CONCLUSION: At 6 weeks after operation, the control group had only fibrous tissue hyperplasia, and in the experimental group, cartilage-like tissues were generated at the defect site. At 12 weeks after operation, a small amount of hyaline cartilage-like tissues were observed in the control group, and the defects in the experimental group were covered with smooth and hyaline cartilage tissues. After 12 weeks, the toluidine blue staining was light in the control group with a small amount of cartilage tissues; in the experimental group, the toluidine blue staining was remarkable, and the defects were completely covered with hyaline cartilage tissues, and cartilage cells were increased in number. The findings indicate that chitosan-bone marrow mesenchymal stem cells composite material is better to induce cartilage tissue formation and promote cartilage defect repair.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Chitosan, Cartilage, Articular, Tissue Engineering

陈路，夏先学，蒋科. 骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合修复关节软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7254-7258.

Chen Lu, Xia Xian-xue, Jiang Ke. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with chitosan for articular cartilage injuries[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7254-7258.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析入组的20只动物均顺利完成实验，未出现脱落。2.2 兔骨髓间充质干细胞培养结果原代兔骨髓间充质干细胞生长状态良好，出现生长晕，立体性强。连续培养 7 d，在细胞生长达到100%融合时，呈现出平行或者漩涡状分布。经传代培养并置于相差显微镜下观察，可见骨髓间充质干细胞呈现出均一形态，为小梭形细胞，并存在少量大而扁的细胞(图1)。

2.3 兔骨髓间充质干细胞表型检测结果利用流式细胞仪检测第6代兔骨髓间充质干细胞表面分子标志，细胞不表达CD90(0.04%)、CD34(0.3%)、CD45(0.6%)和CD14 (0.4%)，而表达CD44(60%)、CD29(62%)，提示所获得的细胞为实验所需骨髓间充质干细胞，见图2。

2.4 兔骨髓间充质干细胞与壳聚糖支架复合物扫描电镜观察结果兔骨髓间充质干细胞附着于壳聚糖支架上，生长情况良好(图3)。

2.5 术后不同时间两组大体观察结果模型建立之后，实验兔出现右下肢跛行、弹腿等情况，2周后上述症状逐步消失。所有动物均未出现切口感染、化脓、红肿等情况。术后6周，所有动物壳聚糖均全部吸收，其中对照组软骨缺损区可以观察到覆盖有褐色纤维组织样物质，缺损深度较前扩大(图4A)，实验组软骨缺损变浅，覆盖有光滑、乳白色组织，并与周围透明软骨组织十分接近(图4B)。术后12周，对照组软骨缺损出现纤维性修复，在缺损边缘可观察到类透明软骨组织，但数量较少，且中央缺损仍十分明显(图5A)；实验组缺损区完全覆盖有光滑、透明组织，且与周围透明软骨组织十分接近(图5B)。

2.6 术后12周两组关节组织甲苯胺蓝染色结果术后12 周，对照组缺损区主要呈现出纤维组织修复，在缺损边缘存在软骨组织，但数量较少，软骨基质少(图6A)，实验组缺损完全被透明软骨组织所覆盖，修复效果良好，且结构与正常软骨十分接近(图6B)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照组动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至7月在川北医学院附属医院骨科实验室完成。

1.3 实验动物及材料

实验动物：21只健康新西兰大白兔，普通级，1月龄，体质量(1.0±0.25) kg，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SYXK(京)2011-0039。实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法等均符合伦理要求。

骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合修复关节软骨损伤实验所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
磷酸盐缓冲液	上海博升生物科技有限公司
胰蛋白酶	北京嘉康源科技发展有限公司
DMEM 培养基	潍坊海之源生物制品有限公司
壳聚糖	苏州市莱顿科学仪器有限公司
多聚甲醛	上海天美科学仪器有限公司
戊二醛	江苏舜星科技有限公司
二甲胂酸钠缓冲液	复纳科学仪器(上海)有限公司
乙醇	日立医疗器械(北京)有限公司
扫描电镜	潍坊威森格化工有限公司
甲苯胺蓝	北京索莱宝科技有限公司
相差显微镜	临沂市泰尔化工科技有限公司
培养箱	金骏升科技国际有限公司
流式细胞仪	湖北泰康医疗设备有限公司

1.4 实验方法
1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的体外培养取1只新西兰大白兔，分离双侧股骨及胫骨，抽取骨髓4.0-5.0 mL，立即用等量磷酸盐缓冲液洗涤，离心后弃去上清液。重复操作2 次，接种于50 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和温度培养箱中进行培养。连续培养3 d后换液，去除悬浮细胞。待原代培养细胞生长达到瓶底面积 80%-90%时，添加0.25%胰蛋白酶消化两三分钟，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化。离心，弃上清液，并按照1∶3比例进行传代接种。采用流式细胞仪检测第6代骨髓间充质干细胞表面分子标志。
1.4.2 兔骨髓间充质干细胞和壳聚糖的复合培养将壳聚糖置于6孔板中，利用无菌注射器向各孔添加兔骨髓间充质干细胞悬液，细胞浓度为2×10¹⁰ L^-¹，每孔15 mL，然后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于 37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度培养箱中进行培养。培养2 d之后，取部分复合材料进行多聚甲醛、戊二醛、二甲胂酸钠缓冲液固定，乙醇脱水，冻干复合物标本用扫描电镜观察。
1.4.3 兔关节软骨缺损模型构建和分组干预取剩余20只新西兰大白兔，构建兔膝关节软骨缺损模型。经耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉，常规消毒铺巾，于膝关节内侧面做切口，依次切开皮肤、皮下、关节囊及滑膜腔，暴露股骨关节软骨面，用5 mm钻头于股骨内侧髁负重区髌骨沟手动缓慢钻深为3 mm的全层关节软骨缺损。术后分笼饲养，使其自由活动，连续3 d肌注青霉素以抗感染。
将20只实验兔随机分为2组，每组10只，对照组不予以特殊处理，实验组予以壳聚糖复合骨髓间充质干细胞材料修复软骨缺损。
1.4.4 软骨组织修复情况观察术后6，12周，分别用空气栓塞法处死5只动物，取出手术膝关节，剔除周围软组织，行大体病理观察，将股骨远端软骨缺损修复部分用体积分数为10%甲醛固定24 h，15%中性乙二胺四乙酸脱钙，清水冲洗后PBS浸泡24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片，采用甲苯胺蓝染色观察软骨组织修复效果。
1.5 主要观察指标两组新西兰兔关节软骨组织修复情况。

讨论

人体关节内存在软骨，覆盖在关节骨头的末端，具有良好的弹性，可以发挥出重要的保护作用。但是，受到疾病等因素的影响，会出现软骨退变甚至消失的情况^[2-3]。失去软骨的保护，关节便会与骨之间发生碰撞和摩擦等，导致出现关节疼痛等一系列不良后果，严重影响到患者的正常生活。受关节软骨受损后自我修复能力较差等因素的影响，临床采用常规方法进行软骨缺损修复，大多无法获得理想的效果^[4-5]。

组织工程学及相关技术的发展和应用，为临床关节软骨修复提供新思路。种子细胞和支架材料是构建组织工程软骨的最基本要素^[6-8]，其中可以应用的种子细胞有很多，包括脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞等。本实验选择骨髓间充质干细胞作为种子细胞，其具有极强的自我更新能力，在体外条件下，可以诱导分化为成各种细胞，包括神经元细胞、软骨细胞、骨细胞以及心肌细胞和脂肪细胞等^[9-13]。骨髓间充质干细胞进入磨损的膝关节腔内，可以不断增殖分化出无数个软骨细胞，修复受损的关节软骨面。骨髓间充质干细胞还具有良好的黏附性，可以与多种支架材料相互黏附。骨髓间充质干细胞具有一定的免疫学特征，可以避免发生免疫排斥反应。Bartholomew等^[14]在同种异体皮肤移植过程中，使用间充质干细胞可以有效延长同种异体皮肤移植的存活时间，达到良好的移植修复效果。本实验体外培养和鉴定兔骨髓间充质干细胞，通过流式细胞仪检测第6代兔骨髓间充质干细胞表面分子标志，可得细胞不表达CD90、CD34、CD45和CD14，而表达CD44、CD29，表明所获得的细胞为实验所需的兔骨髓间充质干细胞，为之后的实验奠定了一定的基础。

在支架材料方面，选用的材料需要具备良好的生物相容性和可降解性等，并具有良好的孔隙结构等，从而为不同种子细胞的附着和长入等提供良好的环境，本实验选择壳聚糖作为支架材料。壳聚糖是一种甲壳素衍生物，具有与纤维素相似的高分子线性特征，具备良好的可降解特性和生物相容性^[15-18]，可以作为支架材料与不同的种子细胞复合培养^[19-20]。Nettles等^[21]利用壳聚糖制作多孔海绵支架材料，并作为重要的载体应用于各种软骨组织修复。Lahiji等^[22]也通过研究发现，壳聚糖可以促进软骨细胞分化以及增殖，且能有效促进蛋白多糖和胶原等合成和分泌^[23-25]。

本实验构建骨髓间充质干细胞与壳聚糖复合材料，扫描电镜观察发现兔骨髓间充质干细胞附着于壳聚糖支架上，生长情况良好^[26]。用壳聚糖-骨髓间充质干细胞复合材料对膝关节软骨缺损进行修复，经大体观察和甲苯胺蓝染色发现，实验组缺损完全被透明软骨组织所覆盖，修复效果良好，且结构与正常软骨十分接近，修复效果显著优于对照组。

综上所述，壳聚糖的三维结构为骨髓间充质干细胞的新陈代谢以及增殖和分化提供了所需的空间。兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架复合材料能更好的引导软骨组织的生成，具有一定的临床应用前景，值得在今后的研究中予以进一步分析。
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