组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.006

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (45): 7249-7253.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.006

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组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择

贾佳¹，靳利梅¹，赵翊¹，晏丽²，路娟¹，王秋萍¹，赵静苗¹，胡继宏¹

Jia Jia¹, Jin Li-mei¹, Zhao Yi¹, Yan Li², Lu Juan¹, Wang Qiu-ping¹, Zhao Jing-miao¹, Hu Ji-hong¹

收稿日期:2015-09-18 出版日期:2015-11-05 发布日期:2015-11-05
通讯作者: 胡继宏，博士，副教授，硕士生导师，甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000
作者简介:贾佳，女，1988年生，汉族，甘肃中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗心血管疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81260597)；甘肃省高校基本科研业务费项目(2012-3)

Kallikrein 1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells: selection of the multiplicity of infection

1甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000；2兰州市卫生学校，甘肃省兰州市 730000

1School of Basic Medical Science, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Lanzhou Health School, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2015-09-18 Online:2015-11-05 Published:2015-11-05
Contact: Hu Ji-hong, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, School of Basic Medical Science, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Jia Jia, Studying for master’s degree, School of Basic Medical Science, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Lanzhou Health School, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260597; the Fundamental Research Project for Colleges in Gansu Province, No. 2012-3

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管舒缓素即组织激肽释放酶1，是组织激肽释放酶-激肽系统重要组成部分之一。有研究表明血管舒缓素通过促进血管新生，抑制心肌炎症产生等发挥其对心血管系统的保护作用，但并未从干细胞诱导分化方面进行探讨。
目的：实验利用已构建的腺病毒载体，将其携带的血管舒缓素基因转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，观察其是否成功转染及转染率如何。
方法：以腺病毒作为载体，将目的基因血管舒缓素转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，并采用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐法和流式细胞技术观察病毒对细胞的转染效果，以确定最佳的病毒感染复数。
结果与结论：荧光显微镜下观察到腺病毒携带的血管舒缓素目的基因成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上；流式细胞仪结果显示转染率跟病毒感染复数值的大小有关系，当病毒感染复数为150时，转染率为80.8%；四甲基偶氮唑盐法结果提示，病毒感染复数为200时，细胞生长受到明显的抑制。结果证实，腺病毒介导的血管舒缓素能成功转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，且最佳的病毒感染复数为150。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 血管舒缓素, 基因转染, 骨髓间充质干细胞, 病毒感染复数, 组织激肽释放酶1, 心脏疾病, 心肌样细胞, 腺病毒, 流式细胞仪, 四甲基偶氮唑盐法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Kallikrein 1 is an important component of the kallikrein-kinin system. Studies have shown that kallikrein can protect the cardiovascular system by promoting angiogenesis and inhibiting myocardial inflammation, but there is no report on its effect on inducing differentiation of stem cells.
OBJECTIVE: To determine the transfection efficiency of kallikrein 1 adenoviral vector in rat bone mesenchymal stem cells.
METHODS: Using adenovirus as a vector, the target gene kallikrein 1 was transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells. Fluorescence microscopy, MTT method and flow cytometry were used to investigate the effect of transfection and determine the optimal multiplicity of infection.
RESULTS AND CONCLUSION: Adenovirus carrying kallikrein 1 was successfully transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells. Results from flow cytometry showed that the transfection efficiency was associated with the multiplicity of infection. When the multiplicity of infection was 150, the transfection efficiency was 80.8%. MTT results showed that when the multiplicity of infection was 200, the cell growth was inhibited remarkably. These findings indicate that adenovirus-mediated kallikrein 1 can be successfully transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells with the optimal multiplicity of infection=150.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Transfection, Green Fluorescent Proteins

贾佳，靳利梅，赵翊，晏丽，路娟，王秋萍，赵静苗，胡继宏. 组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞的病毒感染复数选择[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7249-7253.

Jia Jia, Jin Li-mei, Zhao Yi, Yan Li, Lu Juan, Wang Qiu-ping, Zhao Jing-miao, Hu Ji-hong. Kallikrein 1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells: selection of the multiplicity of infection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7249-7253.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

心脏疾患已成为威胁人类健康的严重疾病之一，现主要治疗手段包括药物治疗、手术治疗及介入治疗，均未从根本上解决问题。细胞移植已成为治疗器质性疾病的新疗法，在某些领域已做出巨大贡献，并成功的使用于临床^[1-2]。基因治疗亦是近几年来国内外研究的热点，目前基因治疗的靶细胞主要为体细胞，即将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的^[3]。基因治疗与细胞治疗的联合具有针对性强、靶向性高、等优势，代表了未来临床应用前景^[4-5]。

骨髓间充质干细胞是具有多向分化潜能的中胚层成体干细胞，可以向心肌细胞、成骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞等分化。组织激肽释放酶1(Kallikrein1，KLK1)，即血管舒缓素，是组织激肽释放酶系统的重要组成物质，存在于多种组织及体液中，具有促进血管新生，抑制炎症以及改善心功能的作用，与心脏疾病有着密切的关系^[6]。

目前有关组织激肽释放酶1关于心脏方面的实验研究在国内外均无报道，实验研究的最终目的为将携带有组织激肽释放酶1的腺病毒载体利用基因转染的方式到骨髓间充质干细胞上，观察组织激肽释放酶1是否具有促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用。而组织激肽释放酶1的成功转染是骨髓间充质干细胞诱导分化的基础和前提，故实验采用携带有组织激肽释放酶1基因的腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞进行转染，观察其是否转染成功以及转染成功后的最佳病毒感染复数值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年1月在甘肃兰州军区总医院干细胞与基因药物重点实验室完成。

1.3 材料

组织激肽释放酶1转染大鼠骨髓间充质干细胞的病毒感染复数的选择实验用试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
腺病毒载体pAd- 组织激肽释放酶1-IRES2-EGFP(293A细胞) Life	Life Technologies Corporation公司
四甲基偶氮唑盐	Sigma公司
荧光显微镜	OLYMPUS公司
流式细胞仪	BD FACScan公司
DNM-9602A型酶标分析仪	北京普朗新技术有限公司

细胞：大鼠骨髓间充质干细胞(第2代)购买于北京医科利昊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养将第4代骨髓间充质干细胞用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基培养，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中，每日置于倒置相差显微镜下观察其形态变化，每隔3 d换液1次。待细胞生长融合度达80%-90%时，弃去旧培养液，用2 mL PBS冲洗1次，后加入500 μL体积分数0.25%胰蛋白酶消化细胞，并轻轻拍打培养瓶一侧，于镜下观察，若细胞变圆，胞质回缩，细胞间隙增大，立即加入1.5 mL的完全培养基终止消化，移入离心管中，900 r/min，离心3 min，小心倒掉上清，加入适量的完全培养基将细胞从管底吹起，混匀，按照1∶3的比例进行传代。

1.4.2 病毒最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI) 的选择 MOI是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。MOI值=加入病毒总数/细胞总数。

将携带组织激肽释放酶1基因的腺病毒作为载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，分为未转染组、MOI 50，MOI 100，MOI 150及MOI 200组，细胞接种数量为1×10⁹ L^-¹，根据MOI值计算出加入病毒量，以便观察。

1.4.3 组织激肽释放酶1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞将已为对数生长期的第5代大鼠骨髓间充质干细胞接种6孔板中，设置计数孔(计数用)、对照孔(不加病毒)及测试孔(加入不同的MOI)，每孔加入体积分数10%胎牛血清的完全培养基2 mL，24 h贴壁后将计数孔的细胞消化进行细胞计数，根据细胞数量以及所设的MOI值，计算出加入的病毒数量，进行转染，4 h后更换液体为完全培养基，且分别在24，48，72 h用荧光显微镜观察是否转染以及转染程度，72 h后利用流式细胞仪检测分析结果。

1.4.4 MTT法检测病毒对细胞的抑制率以5 000/孔的数量将第5代大鼠骨髓间充质干细胞接种于96孔板上，且每孔的培养基为150 μL，设置调零孔(只有培养基)，对照孔(细胞和培养基)及测试孔(细胞、培养基、病毒液)，各设5个复孔，待细胞贴壁后转染病毒，转染72 h后每孔加入10 µL MTT后置于孵箱继续培养4 h，弃上清，加入100 µL的DMSO，置摇床低速振荡10 min，在酶标仪紫外线吸光度490 nm处测量各孔的吸光度值。

1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞的形态观察及转染组织激肽释放酶1后的荧光显微镜、流式细胞仪和MTT的检测结果。

1.6 统计学分析所有数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料服从正态分布用x(_)±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析和LSD检验；不服从正态分布采用中位数和四分位间距表达，组间比较采用秩和检验。计数资料用率表达，组间比较采用卡方检验。检验水准α=0.05。

讨论

组织激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)是一类广泛存在于组织中的性质相似的化合物，人类多种疾病均与其的表达量的改变有关^[7-9]。目前的研究表明KKS家族的基因至少有15个，其中组织激肽释放酶1主要与心血管、肾脏及神经疾病有关^[10-12]，其表达主要通过缓激肽或赖氨酰缓激肽调节从而发挥作用。

骨髓间充质干细胞具有自我更新能力，能够在合适的诱导条件下向心肌细胞、神经元、血管内皮细胞、上皮细胞和骨细胞等分化^[13-17]。骨髓间充质干细胞的优点之一就是易于导入外源基因，故成为现研究领域的热门种子细胞，且已有有关基因修饰干细胞治疗疾病的研究报道，证实了骨髓间充质干细胞能够携带外源基因^[18-23]。

实验采用组织激肽释放酶1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞，体现了细胞治疗与基因治疗的联合，即体细胞的基因治疗法。组织激肽释放酶1在心脏疾病发生时，能够起到保护心肌、抑制炎症及改善心功能的作用^[8]。实验的目的是将组织激肽释放酶1转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，观察其是否具有促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的能力，要做到这一步的前提是组织激肽释放酶1基因的成功转染。

实验利用构建好的腺病毒载体将目的基因组织激肽释放酶1转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，且通过荧光显微镜、流式细胞仪以及MTT共3种检测手段确定最佳MOI值。结果显示，荧光显微镜下观察每组细胞均有绿色荧光的表达，说明携带有目的基因组织激肽释放酶1的腺病毒载体成功转染到骨髓间充质干细胞上，但要算出其转染率主要依靠流式细胞仪的检测。实验中流式结果显示，每组细胞均达到流式要求的细胞数目，且每组总细胞数目大致相同，当MOI值为150时，转染率最高，为80.8%；根据MTT法的结果显示，MOI为100和150时，差异无显著性意义，提示两者对细胞的抑制率等效，但当MOI值为200时，细胞的生长受到明显抑制。综上所述，根据荧光显微镜、流式细胞仪及MTT检测结果提示组织激肽释放酶1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的最佳病毒感染复数为150。

转染结果的高低有众多原因，不但与使用载体的种类相关、转染步骤的不同，还与包装基因的种类以及大小有关，或是作用细胞的不同，亦或是在操作过程中一部分已转染成功的细胞的损伤及丢失，均可造成不同实验结果的差异性^[24-37]。目前并无已发表的研究结果表明组织激肽释放酶1转染骨髓间充质干细胞是否成功及转染率的论述，故而本次实验结果可作为之后组织激肽释放酶1与细胞治疗联合手段的参考。在本次实验当中，采用以往的经典检测方法，即MTT，是否可以利用CCK-8这种最新方法予以改进，得到的数据是否能更准确的体现出病毒对细胞生长的抑制性呢？还有待实验进一步的证实。

利用基因转染的方法将携带有组织激肽释放酶1基因的腺病毒载体转染到大鼠骨髓间充质干细胞上，观察其是否成功转染及转染后的最佳MOI值，为今后组织激肽释放酶1联合药物干预治疗心脏疾病奠定了基础，同时也可为基因转染方面的实验研究提供参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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