异种脱蛋白松质骨支架在脊柱横突间融合中应用的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：现如今关于组织工程骨的相关研究大多集中在骨干临界性骨缺损方面，关于其在脊柱融合中的相关研究和报道相对较少。
目的：探讨在脊柱横突间融合治疗中异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的应用可行性。
方法：取成年猪股骨远端松质部分，制备异种脱蛋白松质骨材料，与重组人骨形态发生蛋白复合后，再复合骨髓间充质干细胞制备组织工程骨。取24只山羊，制备横突间植骨床，随机均分为2组，观察组左侧植入组织工程骨，右侧植入载重组人骨形态发生蛋白的异种脱蛋白松质骨；对照组左侧植入自体髂骨，右侧植入异种脱蛋白松质骨。植入后4，8，12周获取融合节段，进行大体观察、X射线观察、组织学观察及生物力学检测。
结果与结论：X 射线显示，两组植入材料均固定良好，固定效果可靠。植入后不同时间点，各组植入材料均处于良好位置，材料周围组织未出现化脓或者坏死等，且均出现软组织长入、包裹，植入材料周围均未出现积液和坏死等，其中组织工程骨组影像学表现与组织学表现优于载重组人骨形态发生蛋白异种脱蛋白松质骨组、异种脱蛋白松质骨组，与自体骨最接近。植入后12周，组织工程骨组最大弯曲载荷最接近自体髂骨组，两组间比较差异无显著性意义。表明在脊柱横突间融合治疗中，异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架具有一定的应用可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 异种骨, 脱蛋白, 脊柱融合, 横突间脊柱融合, 骨移植, 松质骨

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, most of the studies regarding tissue engineering bone have mostly focused on critical-size bone defects of the backbone; however, there are less studies and reports on its spinal fusion.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of xenogeneic deproteinized cancellous bone as bone tissue engineering scaffold in the treatment of spinal intertransverse fusion.

METHODS: The cancellous part in the distal femur of adult pigs was obtained to prepare xenogeneic deproteinized cancellous bone. After combined with the recombinant human bone morphogenetic protein, the xenogeneic deproteinized cancellous bone was combined with bone marrow mesenchymal stem cells to prepare tissue engineering bone. Twenty-four goats were obtained to prepare intertransverse bone bed, and randomly divided into two groups: observation and control groups. In the observation group, the tissue engineered bone was implanted into the left side, and the xenogeneic deproteinized cancellous bone of recombinant human bone morphogenetic protein was implanted into the right side. In the control group, the autologous iliac bone was implanted into the left side, and xenogenic deproteinization cancellous bone was implanted into the right side. At the 4^th, 8^th and 12^th weeks after implantation, the fusion segment was obtained for gross observation, X-ray observation, histological observation and biomechanical testing.

RESULTS AND CONCLUSION: X-ray films showed that the implant materials from these two groups were fixed well and reliably. At different time points after implantation, the implant materials from each group were all in good position. There were no purulent and necrotic tissues around the material. Soft tissue ingrow and wraping were present. There were no effusions and necrosis surrounding the implant materials. The imaging and histological performance in the tissue engineering bone group outperformed that in the recombinant human bone morphogenetic protein xenogenic deproteinized cancellous bone group and xenogenic deproteinized cancellous bone group, which was the most close to the autogenous bone. At the 12^th week after implantation, the maximum bending load in the tissue engineering bone group was the most close to the autogenous iliac bone group. There was no significant difference between these two groups. These results demonstrate that as bone tissue engineering scaffold, xenogenic deproteinized cancellous bone has a certain application feasibility in the treatment of spinal intertransverse fusion.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Bone Transplantation, Spinal Fusion

吕波，董文，刘武清. 异种脱蛋白松质骨支架在脊柱横突间融合中应用的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(43): 6946-6952.

Lv Bo, Dong Wen, Liu Wu-qing. Application feasibility of xenogeneic deproteinized cancellous bone scaffold in the treatment of spinal intertransverse fusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(43): 6946-6952.

图/表（结果） 9

2.1 实验数量分析入组的24只实验动物均进入结果分析。

2.2 动物大体情况术后三四小时，动物恢复清醒，并开始活动；术后1 d，活动和精神状态、进食均恢复正常。

2.3 影像学检查结果术后所有动物的植入材料均固定良好，固定效果可靠。各组X射线影像学评分见表1。

组织工程骨组：术后第4周，与横突桥接处部分区域模糊，以内侧明显，有形状不规则新骨生成，移植物密度略低于周围骨床(图3A)；术后第8周，上下桥接部间隙变小，移植材料边界不清，大量连续骨痂生成，部分髓腔再通(图3C)；术后第12周完全融合，移植材料与骨床自然连接，密度相近(图3E)。

骨形态发生蛋白2复合骨：术后第4周，与横突桥接部有不规则骨痂形成，移植材料纹理清晰，密度略低于组织工程骨组(图3A)；术后第8周，上下桥部间隙变小，移植材料边界不清，大量新生骨向材料中心生长，边缘密度高于中央部，部分髓腔再通(图3C)；12周后移植材料大部分与骨床骨性愈合(图3E)。

自体髂骨组：材料各时间段融合情况与组织工程骨组大体一致。早期组织工程骨密度略低于自体骨，12周后基本相同，与横突自然连接，与骨床密度均匀一致，骨塑形佳(图3B，D，F)。

异种脱蛋白松质骨组：术后4周新骨形成较少，移植材料纹理清晰，无明显骨痂生成(图3B)；术后第8周，移植材料体积变小，横突桥接处部间隙清晰，两端圆钝，存在明显的吸收且密度下降(图3D)；术后12周与周围骨床未发生融合，靠近横突部存在少量条索状新生骨，中央部材料大部分吸收(图3F)。

2.4 标本大体观察术后不同时间所有植入材料均处于良好的位置状态，材料周围组织未出现化脓或者坏死等，且均出现软组织长入、包裹。术后4周，组织工程骨组、骨形态发生蛋白2复合骨、自体髂骨组均与周围骨质纤维发生愈合，并存在少量骨痂形成；术后8周，出现更明显的骨形成，材料与横突及椎板发生骨性愈合；术后12周，材料大多呈现出骨痂包埋情况。术后4周，异种脱蛋白松质骨组材料桥接部被纤维组织所包裹，无典型骨块组织；术后8周，存在大量结缔组织充填；术后12周，横突桥接部出现少量骨痂生成。2.5 组织学观察结果两组动物植入材料周围均未出现积液和坏死等，各组组织学评分情况见表2。

组织工程骨组：术后4周，材料周边有少量吸收，在吸收陷窝(Howship陷窝)可见破骨细胞贴附，周围较多成骨细胞并产生胶原基质，可见少量淋巴细胞，多点岛状生长的新生骨组织贯穿整个移植材料，血管样组织形成较多(图4A)；5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫组化染色可见材料孔隙边缘阳性细胞较多，细胞核大，排列紧密(图4B)。术后8周，新生骨小梁周围可见大量成骨细胞和破骨细胞，载体材料大量吸收，代之以较多编织骨，部分形成髓腔，无淋巴细胞浸润(图4C)。术后12周，编织骨交错排列，逐渐向板层骨过渡，存在骨髓形成，新生骨完全桥接横突骨(图4D)。

骨形态发生蛋白2复合骨组：术后4周时，靠近横突部有较多新骨生成，新生骨呈明显梯度生长，靠近骨床部成骨活跃，中部血管样组织较多，骨髓组织少(图5A)。术后8周时，近横突部出现骨髓组织，中部出现大量胶原纤维，交互连接，周边成骨明显，并向材料中心生长(图5B)。术后12周，中央出现骨髓组织，纤维组织减少，大量编织骨生成，骨改建尚不完善(图5C)。

自体髂骨组：4周时新生骨已桥接宿主骨，周边成骨活跃，原骨小梁周围出现大量成骨细胞和破骨细胞(图6A)。8周时移植材料大量吸收，逐渐被新生编织骨替代，大量骨髓出现(图6B)。12周时新生骨逐渐改建为板层骨，与横突自然连成一体，新生骨小梁成熟，取代自体骨(图6C)。

异种脱蛋白松质骨组：术后4周可见大量的纤维组织及细小血管浸入，支架材料部分降解，较少见成骨细胞与软骨细胞(图7A)。8周时材料进一步被吸收，桥接横突两端部分有少量不成熟骨组织形成(图7B)。12周新生骨向材料内生长，但新生骨量较少，充满纤维组织，载体材料大部吸收(图7C)。2.6 生物力学测定结果组织工程骨组、骨形态发生蛋白2复合骨组、自体髂骨组、异种脱蛋白松质骨组的大弯曲载荷分别为(59.27±9.65)，(51.42±6.35)，(65.15±4.21)， (18.84±1.87) N。组织工程骨组、骨形态发生蛋白2复合骨组、自体髂骨组最大弯曲载荷高于异种脱蛋白松质骨组 (P < 0.05)，组织工程骨组、自体髂骨组最大弯曲载荷高于骨形态发生蛋白2复合骨组(P < 0.05)，组织工程骨组最大弯曲载荷与自体髂骨组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

现如今，临床治疗多种脊柱疾病时均会选择脊柱融合治疗^[1]。在脊柱融合治疗过程中对患者进行骨移植处理，需要用到大量植骨材料^[2]，以往大多采用患者自体骨移植的方式，但材料来源受限制且容易增加手术时间，并对患者造成新的损伤等^[3-6]。其中，组织工程骨即为一种重要的骨材料，包含种子细胞、载体材料和骨生长因子^[7-8]。本次研究过程中所选用的载体为异种脱蛋白松质骨，通过对异种骨进行处理和移植，可有效解决材料的来源问题，并避免取自体髂骨手术造成的并发症^[9-10]。松质骨的最大特点是其疏松的网状孔隙结构，其力学性质受骨块孔隙密度和骨小梁排列方向的影响。较之其他载体，异种脱蛋白松质骨具备理想骨替代材料的优点：具备良好的生物相容性；具有合适的力学强度，可以发挥出机械支持和空间占位作用，可作为修复大段骨缺损的“支架”材料，还可以填充物的形式修复骨性腔洞；具有天然的多孔结构和合适的孔隙率，利于复合种子细胞及骨诱导因子，便于血管组织的长入和骨软骨分化形成；来源丰富，易于大量获取和加工成载体而贮存；作为一种生物组织，与宿主骨骼具有同源性结构排列，植入后易于为受体组织细胞接近而吸收替代，成为宿主骨的一部分，而不是作为异物长期存留体内；与骨诱导因子结合后能减缓后者的释放，便于局部维持足够浓度和作用时间，以便更好地发挥骨诱导活性。本实验过程中，通过理化方法结合移植免疫学和材料力学制作脱蛋白松质骨载体，并进行力学及生物学性能等观察，发现其具有良好的力学性能，符合骨组织工程载体要求，是一种十分理想的支架材料；在实验过程中，还选择将其与自体骨髓间充质干细胞及骨形态发生蛋白进行复合处理，得到组织工程骨，然后通过构建动物模型的方式，了解以异种脱蛋白松质骨为载体构建组织工程骨在脊柱横突间融合的效果和可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年3至7月在天津市红桥医院骨科实验室完成。

1.3 材料

实验动物：26只6-8月龄雄性青山羊，由青岛中创生物科技有限公司提供，生产许可证：鲁H090206，体质量20-20.5 kg，健康状况良好。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理的问题均符合要求。

1.4 实验方法

制备异种脱蛋白松质骨载体材料：取成年猪股骨(购自本地农贸市场)远端松质部分，截取骨块并去除皮质骨和软骨，制作为块状，大小为3.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，骨块的长轴要保证与松质骨骨小梁排列方向一致。利用氯仿甲醇液对骨块进行脱处理，并利用蒸馏水进行振荡冲洗，冲洗结束利用双氧水进行浸渍，重复操作3次。于室温条件下对处理完毕的骨块以蒸馏水振荡冲洗，然后将骨块置于无菌离心管中，3块/管，利用DMEM/F12培养基进行反复浸泡，并检测浸液pH值，待pH值达到7.3，取出骨块，利用双层血浆袋进行密封，3块/袋，共50袋。利用⁶⁰Co进行幅射消毒，置于-4 ℃环境下保存备用。处理后的猪股骨远端松质骨骨块见图1。

制备骨形态发生蛋白2复合骨：按照0.5 mg∶1 mL的比例将相对分子质量为1 200的骨形态发生蛋白2成熟肽和PBS混匀，并于超净台内加液器滴加在处理后的猪股骨远端松质骨骨块上，滴加完毕置于无菌抽滤瓶。负压状态下使其均匀分布，进行无菌处理，干燥后保存待用。

构建组织工程骨：抽取2只青山羊骨髓5 mL，参考文献[2]方法分离培养与鉴定骨髓间充质干细胞。将细胞悬液经细胞计数后以1×10⁴/cm²接种于培养瓶中，添加传代培养液进行孵育。取刚接种的第2代细胞，以成骨诱导培养液(DMEM/F12培养基+体积分数10%胎牛血清+10^-7 mol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 mg/L维生素C+青、链霉素100 mg/L)培养并进行孵育。将制备好的重组人骨形态发生蛋白-异种脱蛋白松质骨置于6孔培养板中，1块/孔，并于超净台内滴加1 mL细胞悬液。细胞上架，结束后取

组织工程骨脊柱融合实验的试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
重组人骨形态发生蛋白2成熟肽	广州达晖生物技术有限公司
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)及其单克隆抗体	上海微蒙生物技术有限公司
乙二胺四乙酸(EDTA)	上海研域生物科技有限公司
DMEM培养基	武汉博士德生物工程有限公司
X射线机	四川西南医用设备有限公司
电子万能力学实验机	山东蓝鸟医学科技发展有限公司
细胞培养箱	山东安迈医学科技有限公司
相差倒置显微镜	北京冠普佳科技有限公司
温控离心机	湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司
pH计	扬州华辉检测仪器有限公司
荧光显微镜	大连光耀辉科技有限公司
6孔细胞培养板	广州东锐科技有限公司
流式细胞仪	上海索宝生物科技有限公司
高效分析仪	北京金果实科技有限公司
图像分析软件系统	安徽蓝盾光电子股份有限公司
胎牛血清	浙江天杭生物科技有限公司
地塞米松	潍坊瑞华生物科技有限公司
β-甘油磷酸钠	荆州市杰胜药业有限公司
维生素C	郑州诚旺化工有限公司
青、链霉素	北京泊宁乐成科技有限公司

出6孔板并置于孵育箱中进行孵育，孵育条件为置37 ℃、体积分数5%CO₂，待细胞贴壁。5 h后取出6孔板，无菌条件下对组织块进行翻面，并加入诱导培养液进行7 d的培养(图2)。

构建动物模型与分组干预：将24只青山羊随机均分为观察组和对照组，对动物进行常规禁食、麻醉之后，于腰骶部正中做切口，取出横突间内侧皮质暴露松质部分，制备横突间植骨床，观察组于左侧植入组织工程骨，右侧植入骨形态发生蛋白2复合骨；对照组左侧植入自体髂骨，右侧植入异种脱蛋白松质骨。术后在相同的环境条件下对动物进行常规喂养。

1.5 主要观察指标 ①动物大体情况：观察动物进食、活动及伤口愈合情况。②术后4，8，12周对动物进行脊柱融合段X射线检查，并进行评分。③标本观察：术后4，8，12周每组各处死4只动物，获得融合段上下各一节段椎体脊柱，对融合段材料及周围组织反应进行观察。④组织学检查：获取临近横突部融合材料，常规甲醛固定、脱钙、脱水等处理后切片、染色，并置于光学显微镜下观察移植区骨形成情况，并进行组织学评分。⑤检测新生骨组织的细胞来源：利用免疫组化法对组织工程骨标本细胞中的5-溴脱氧尿嘧啶核苷进行检测。⑥生物力学测定：术后12周

X射线检查评分标准：
指标	得分
骨塑形
未见骨塑形	0
骨髓腔形成	2
皮质骨形成	4
骨连接
桥接线清楚	0
桥接线部分存在	2
桥接线消失	4
新骨形成
无	0
仅限于桥接部(< 25%)	1
覆盖25%-50%	2
覆盖51%-75%	3
> 75%	4

组织学评分标准：
指标	0分	1分	2分	3分	4分
桥接部连接	无	单纯纤维连接	软骨连接	骨性连接	有皮质骨形成
编织骨形成	无	少量	中量	大量	连续骨小梁形成
骨髓形成	无	开始出现骨髓	骨髓≥1/2	全部为红骨髓	黄骨髓形成

取各组标本，利用电子万能力学测试仪进行三点弯曲力学测定。

1.6 统计学分析对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，采用ANOVA方差分析，并予以方差齐性检验，计算P 值，如果经计算P < 0.05，则提示经比较两组数据间存在统计学差异。

讨论

临床对不同原因导致的骨缺损患者进行治疗过程中，需要利用一定的骨修复材料对患者进行植骨处理^[11-12]。脊柱融合过程中便需要对患者进行骨移植，横突间周围肌肉组织丰富，植骨床条件好，横突相当于桥墩的作用，对植骨块的稳定起重要作用。在骨移植材料方面，自体骨是较为重要的来源之一^[13]。但自体骨移植在供体方面受到较大的限制，且容易对患者造成新的创伤^[14]，而且采取自体骨移植的方式还极易导致感染等不良事件的出现，不利于患者术后恢复^[15]。骨移植过程中，还可以采用异体骨移植的方式进行骨缺损修复^[16]。但异体骨大多来源于尸骨和动物骨骼，因此在生物相容性等方面存在十分突出的问题^[17-19]。骨组织工程学的不断发展，有力推动了骨移植材料的发展^[20-22]。

组织工程骨是一种新型的骨材料，包含种子细胞、载体材料和骨生长因子^[23-24]。组织工程骨是以可降解生物材料为载体，复合各种骨生长因子及成骨细胞等形成的复合物，具有与人体骨十分接近的形态及功能^[25-26]。将其应用于临床骨缺损修复之中，可实现有效的缺损修复及功能重建^[27-33]。但现如今关于组织工程骨的相关研究大多集中在骨干临界性骨缺损等方面，关于脊柱融合骨移植的相关研究和报道相对较少。

种子细胞与载体材料的黏附是组织工程研究的基本问题，细胞必须与材料发生黏附才能进行迁移、增殖和分化。单纯骨髓间充质干细胞是理想的种子细胞，但植入体内成骨能力较低，主要原因是由于缺乏细胞载体，骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。在组织工程骨成骨中，脱蛋白骨可发挥骨传导支架的作用，为再血管化和成骨细胞的分化提供稳定环境。本次研究过程中，即通过构建动物模型的方式，了解以异种脱蛋白松质骨为载体构建组织工程骨进行脊柱横突间融合的效果和可行性。
本次研究过程中一共涉及到4种植入材料，即实验动物自体髂骨和异种脱蛋白松质骨、组织工程骨及单纯复合骨形态发生蛋白2的异种脱蛋白松质骨。本次研究结果显示，术后两组动物的植入材料均固定良好，固定效果可靠，材料周围组织未出现化脓或者坏死等，且均出现软组织长入、包裹，组织工程骨组的影像学评分和组织学评分均优于其他复合骨组和单纯脱蛋白松质骨组，并与自体骨组较为接近。分析出现这一结果的原因，是因为在进入动物体内之后，组织工程骨的种子细胞可在宿主体内存活，并良好生长及分化^[34-36]。本实验结果表明，组织工程骨可与宿主骨桥接部有新骨形成，且移植材料周围和内部也存在新骨形成情况。分析出现这一结果的原因，是因为组织工程骨的种子细胞在宿主体内发生了存活和生长及分化，多点岛状生长的新生骨组织贯穿在整个移植材料之中。骨形态发生蛋白2复合骨新生骨呈梯度生长，在距离骨床部较近的地方成骨活跃及周边成骨明显，并向材料中心方向进行生长。而单纯脱蛋白松质骨载体移植，未表现出明确的骨诱导能力，但却具有一定的骨传导作用，新骨可以沿着骨床边缘向移植区内生长。Brdu属于胸腺嘧啶核苷衍生物，在S期可以渗入DNA分子中，因此可随细胞分裂增殖传给子代细胞，通过免疫组化技术可对其进行检测。本次研究过程中经检测发现，在植入后4周可以观察到可染色阳性种植细胞，即提示种植细胞植入体内环境后可继续生存，并发挥出一定的成骨功能。本次研究结果还表明，组织工程骨可以提供与动物自体骨十分接近的生物力学强度，显著高于单纯脱蛋白松质骨组及重组合异种骨组，是一种十分理想的骨移植材料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程