苯丙酸诺龙对烫伤模型大鼠雄激素受体介导靶基因转录调控的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：中重度烧创伤一直是临床全身治疗的难点，与创面局部处理并重，极大影响治疗预后。同化激素在烧伤动物模型与临床患者的使用治疗中取得安全良好效果。同化激素的应用虽受运动兴奋剂管理的限制，但其雄激素受体与核受体辅助调节因子仍是近年来基因调控机制研究的热门新兴领域。

目的：探索苯丙酸诺龙对烫伤大鼠体内雄激素受体介导靶基因转录调控的影响。

方法：将36只大鼠随机分为苯丙酸诺龙组、模型组与对照组。苯丙酸诺龙组和模型组大鼠以热水制成20%体表面积深Ⅱ度烫伤大鼠模型后2 d，分别后肢肌肉注射苯丙酸诺龙和生理盐水，隔日1次，连续21 d。

结果与结论：苯丙酸诺龙组与模型组大鼠肝脏及性腺(睾丸、卵巢)中类固醇受体辅助活化因子1和胰岛素样生长因子1基因表达水平差异有显著性意义(P < 0.05，除肝脏中类固醇受体辅助活化因子1)；而模型组与对照组大鼠肝脏及性腺(睾丸、卵巢)中类固醇受体辅助活化因子1、c-myc和胰岛素样生长因子1基因表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)。说明在不同组织不同生理病理条件下苯丙酸诺龙对类固醇受体辅助活化因子1、c-myc、胰岛素样生长因子1基因表达的作用是不同的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 组织构建实验模型, 苯丙酸诺龙, 烫伤, 类固醇受体辅助活化因子1, c-myc, 胰岛素样生长因子1

Abstract:

BACKGROUND: Moderate to severe burn and trauma, treatment of which has been paid equal attention to wound surface, is always a difficulty of clinical systemic treatment and has a poor prognosis. Anabolic hormones have acquired secure and good results in the treatment of burns in both animals and clinical patients. Although use of anabolic hormones is restricted by the doping management, but its androgen receptor and nuclear receptor coregulators are the newly emerging areas of interests in the field of gene regulation mechanism in recent years.

OBJECTIVE: To investigate the effect of nandrolone phenylpropionate on androgen receptor-mediated transcriptional regulation of target gene in rat scald models.

METHODS: Thirty-six rats were randomly divided into nandrolone phenylpropionate, model and control groups. In the nandrolone phenylpropionate and model groups, rats were subjected to a 20% total body surface area second-degree scald injury by hot water. Two days after model preparation, rats in these two groups were intramuscularly injected with nandrolone phenylpropionate and saline, once every other day, for a total of 21 days.

RESULTS AND CONCLUSION: The gene expression levels of steroid receptor coactivator-1 and insulin-like growth factor 1 in the rat livers and gonads (testes, ovaries) were significantly different between the nandrolone phenylpropionate and model groups (P < 0.05), except steroid receptor coactivator-1 in the liver. There were no significant differences in steroid receptor coactivator-1, c-myc and insulin-like growth factor 1 in the rat livers and gonads (testes, ovaries) between model and control groups (P < 0.05). The results demonstrate that nandrolone phenylpropionate has different effects on the gene expression of steroid receptor coactivator-1, c-myc and insulin-like growth factor 1 in different tissues under different physiological and pathological conditions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Nandrolone Phenylpropionate, Liver, Gonads, Receptors, Steroid

中图分类号:

R318

李凯，岑瑛. 苯丙酸诺龙对烫伤模型大鼠雄激素受体介导靶基因转录调控的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6509-6514.

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料健康成年清洁级Wistar大鼠36只，鼠龄4个月，体质量(250±50) g，雌雄各半，由四川大学华西医学中心动物中心提供，生产许可证scxk川2013-026，实验许可证scxk川2013-185。采用随机数字表法，随机分为苯丙酸诺龙组、模型组与对照组，各12只。三组动物均给予鼠用全价颗粒饲料喂养，自由饮水采食，环境湿度40%，温度26-28 ℃，正常日光。

烫伤模型建立实验用主要试剂与仪器：
试剂及仪器	来源
苯丙酸诺龙注射液	上海第九制药厂
Trizol试剂	美国Gibco公司
RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit	立陶宛MBI公司
PCR试剂盒	美国Applied Biosystems公司
荧光定量PCR引物及探针	大连宝生物公司
FTC2000实时荧光定量PCR仪	加拿大枫岭公司
GeneAmp PCR System 9600	美国PE公司
超声细胞粉碎仪96-Ⅱ型	中国宁波新芝科器研究所
凝胶成像系统	美国Bio-rad公司

1.2 造模方法环境适应性饲养1周后，彻底仔细小心剪剃苯丙酸诺龙组和模型组大鼠背后部被毛，面积约10 cm× 6 cm，温水清洁。剪毛后第2天，速眠新(0.3 mL/kg)大腿肌肉注射麻醉，观察大鼠双眼神情淡漠及四肢活动减弱后，使用自制中间开窗空心的泡沫模具紧贴固定大鼠，显露大鼠背部去毛区，于98 ℃水槽浸烫大鼠背部去毛区5 s，制成20%体表面积深Ⅱ度烫伤大鼠模型(预实验病理证实)^[28]。

大鼠致伤后立即给予40 mL/kg生理盐水腹腔注射，观察大鼠生命体征、活动、采食以及创面等情况。对照组大鼠不做任何处理。

1.3 造模成功的检测标准烫伤至真皮层，体表可见形成局部疱痂红斑，达到深Ⅱ度烫伤大鼠模型，被覆表皮痂壳，创面基底红润，生命体征稳定，认为造模成功。

1.4 干预措施干预措施于烫伤后第2天开始实施。苯丙酸诺龙组大鼠后肢肌肉注射苯丙酸诺龙5 mg/kg，隔日1次，连续21 d。模型组大鼠注射生理盐水。对照组大鼠不做任何处理。

1.5 取材烫伤后第21天，各组大鼠断头处死，打开腹腔，剪取肝脏、双侧睾丸、双侧卵巢组织。

1.6 实时荧光定量PCR 采用Trizol^TM法提取大鼠肝脏、睾丸、卵巢组织总RNA，反转录RT后进行荧光定量PCR扩增^[29-32]，检测肝脏、睾丸、卵巢组织类固醇受体辅助活化因子1、c-myc、胰岛素样生长因子1基因的表达水平。引物序列见表1。

表1 类固醇受体辅助活化因子1、c-myc、胰岛素样生长因子1和GAPDH基因的引物

Table 1 Gene primers of steroid receptor coactivator-1, c-myc, insulin-like growth factor 1 and GAPDH

目的基因	引物(5’→ 3’)	产物长度(bp)
类固醇受体辅助活化因子1	F：5’-CTG AGC AGA TGA ATG ATC CA-3’ R：5’-GGA CGT CAG CAA ACA CCT GA-3’ TM：5’-FAM-CTG CAA CCA GCT CTC ATC CAC-TAMRA-3’	132
c-myc	F：5’-CAG CAG CGA CTC TGA AGA A-3’ R：5’-GCA CCT CTT GAG GAC CAG T-3’ TM：5’-FAM-AGA GGC CAC AGC AAA CCT CC-TAMRA-3’	157
胰岛素样生长因子1	F：5’-GAC GCT CTT CAG TTC GTG T-3’ R：5’-CAT CTC CAG CCT CCT CAG A-3’ TM:5’-FAM-CAA GCC CAC AGG CTA TGG CTC-TAMRA-3’	140
GAPDH	F：5’-TGG GTG TGA ACC ACG AGA A-3’ R：5’-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3’ TM：5’-FAM-CTG CAC CAC CAA CTG CTT AGC-TAMRA-3’	143

1.7 主要观察指标大鼠肝脏、睾丸、卵巢组织细胞类固醇受体辅助活化因子1及下游c-myc、胰岛素样生长因子1基因的表达水平。

1.8 统计学分析所有数据在SPSS软件包12.0版上作统计学处理，结果以x(_)±s表示，进行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

苯丙酸诺龙作为一种蛋白同化激素，药效学优良，同化指数高，蛋白同化作用强，而雄性化作用弱，药代动力学良好，肝肾毒副作用小，价廉物美，使用方便。苯丙酸诺龙作为一种人工合成的雄激素衍生物，是通过与雄激素受体结合，使受体活化变构，解离与受体结合在一起的辅助抑制因子，募集多级多种辅助激活因子，与其他基础转录因子及聚合酶等共同组成活化转录复合物，与重塑染色体上相应的雄激素反应元件结合，通过启动子与增强子，启动靶基因的活化转录翻译，从而发挥其生物学效应。在过去的研究中发现在动物和严重烧伤等患者的临床实践中取得良好的治疗效果，并发现不同的组织在不同的生理病理状态下对苯丙酸诺龙的治疗作用反应是不一致的，雄激素家族可从多层次、多水平调节雄激素受体，而且这种调节作用具有组织和/或细胞特异性。类固醇受体辅助激活因子1又称甾体激素受体共激活子1，是雄激素受体等多种核受体结合配体——激素活化变构后首先要募集的辅助激活因子，通过类固醇受体辅助活化因子1再募集次级辅助活化因子如CBP/P300等，构建活化转录复合物调节雄激素受体介导的靶基因的转录翻译表达，类固醇受体辅助活化因子1起共用开关的作用。类固醇受体辅助活化因子1及下游胰岛素样生长因子1、c-myc基因三者均与组织细胞增殖分化、维持细胞稳定、促进创伤愈合等方面密切相关，类固醇受体辅助活化因子1、胰岛素样生长因子1、c-myc基因在反映雄激素受体活化介导靶基因转录调控的过程中有重要作用^[33-37]。因此，苯丙酸诺龙在不同的生理或病理状态下是否通过提高不同组织类固醇受体辅助活化因子1的表达募集，并上调胰岛素样生长因子1、c-myc基因的表达，而有利于雄激素受体介导的靶基因活化转录调控，表现组织细胞特异性的同化作用？目前，尚未查见苯丙酸诺龙对类固醇受体辅助活化因子1及胰岛素样生长因子1、c-myc明确作用的文献报告。 3.1 苯丙酸诺龙对类固醇受体辅助活化因子1基因表达的作用本实验结果显示，苯丙酸诺龙组大鼠肝脏类固醇受体辅助活化因子1基因表达有所增加，说明正常生理状态和病理状态下肝脏类固醇受体辅助活化因子1水平相对较低，苯丙酸诺龙和创伤刺激仅有利于肝脏类固醇受体辅助活化因子1的表达，苯丙酸诺龙与创伤刺激对肝脏类固醇受体辅助活化因子1基因表达的作用没有叠加，使用苯丙酸诺龙并不能提高肝脏类固醇受体辅助活化因子1基因的表达水平。但是苯丙酸诺龙组大鼠睾丸和卵巢类固醇受体辅助活化因子1基因表达却明显高于模型组与对照组，提示苯丙酸诺龙能明显提高睾丸和卵巢类固醇受体辅助活化因子1基因表达；而模型组和对照组差异无显著性意义，提示在生理和病理状态下睾丸和卵巢类固醇受体辅助活化因子1基因表达均较低下，创伤刺激不能明显提高睾丸和卵巢类固醇受体辅助活化因子1基因表达。在过去的研究中，人们发现生理情况下类固醇受体辅助活化因子1基因在肝脏、性腺、大脑等组织分布存在差异，对性欲、性行为、生殖等产生不同的生理心理效应，类固醇受体辅助活化因子1及同源基因表达组织分布丰度决定其参与核受体介导目的基因转录调控的具体身份^[38-45]，本实验也支持这一观点。雌激素拟似剂他莫昔芬tamoxifen必须依赖类固醇受体辅助活化因子1基因表达，选择性作用于骨骼、心血管系统，而在乳腺却能拮抗雌激素作用，并不能引起类固醇受体辅助活化因子1基因过表达，利用基因敲除类固醇受体辅助活化因子1基因沉默可使裸鼠产生雌二醇和孕酮部分抵抗。结合本实验结果，说明类固醇受体辅助活化因子1在类固醇激素核受体机制中是必须征集招募的辅助激活因子。 3.2 苯丙酸诺龙对胰岛素样生长因子1基因表达的作用实验结果显示，在肝脏、睾丸、卵巢三种组织，苯丙酸诺龙组胰岛素样生长因子1基因表达水平均明显高于模型组和对照组，提示苯丙酸诺龙能提高肝脏、睾丸、卵巢胰岛素样生长因子1基因表达水平；苯丙酸诺龙组、模型组和对照组大鼠胰岛素样生长因子1基因表达水平均是肝脏表达最高，卵巢其次，睾丸最低，提示胰岛素样生长因子1的表达也存在组织细胞的分布丰度差异。既往研究证明，肝脏是胰岛素样生长因子1基因表达的主要器官，在全身其他组织也有表达^[46-48]，与本实验结果一致。雌二醇和他莫昔芬均能诱导胰岛素样生长因子1基因表达，但干扰类固醇受体辅助活化因子1基因只能较小抑制雌二醇的诱导胰岛素样生长因子1基因表达，而能够废除他莫昔芬对胰岛素样生长因子1基因表达的诱导；去氢表雄酮及其硫酸盐可以增加血浆胰岛素样生长因子1基因表达水平；类固醇受体辅助活化因子1基因敲除的裸鼠可产生胰岛素样生长因子1分泌减少和细胞抵抗而导致生长迟缓。结合本实验结果，说明胰岛素样生长因子1基因表达是类固醇激素作用机制的其他可能途径之一。 3.3 苯丙酸诺龙对c-myc基因表达的作用实验结果显示，虽然生理情况与病理状态下c-myc基因表达水平略有不同，苯丙酸诺龙和创伤刺激有利于c-myc基因表达，但苯丙酸诺龙并不能增加肝脏、睾丸、卵巢c-myc基因的表达，使用苯丙酸诺龙并没有增加诱导肿瘤发生的危险。苯丙酸诺龙组、模型组和对照组大鼠均是卵巢表达最高，睾丸其次，肝脏最低，提示c-myc的表达也存在组织细胞的分布丰度差异。过去研究表明，原癌基因c-myc广泛存在于机体组织，作用多样可调，c-myc基因的过表达常是肿瘤发生和预后的指示标志^[49-52]。雌二醇E2和他莫昔芬均可诱导细胞c-myc基因的表达，类固醇受体辅助活化因子1沉默对雌二醇诱导c-myc基因表达影响较小，但能废除他莫昔芬对c-myc基因表达的诱导；在大鼠中利用K14启动子表达质粒诱导c-myc基因过表达而抑制粘合素α6和β1的表达，与类固醇受体辅助活化因子1基因敲除的杂交裸鼠相似，可以引起和观察到大鼠和裸鼠面耳颈部发生慢性溃疡，经久不愈。结合本实验结果，说明不同类固醇激素对c-myc基因表达的影响不同，蛋白同化激素治疗剂量尚不足以诱导c-myc基因表达致肿瘤水平。本实验设计通过对类固醇受体辅助活化因子1、胰岛素样生长因子1、c-myc基因表达水平的体内观测，对苯丙酸诺龙的作用机制进行了部分分子水平的探讨，在研究中仍有诸多问题有待进一步探讨和改进，后期采用RNA干扰技术进行体外实验观察。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程