体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞：转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1的协同刺激作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0512

摘要/Abstract

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文题释义：
骨髓间充质干细胞诱导分化：骨髓间充质干细胞具有强大多向分化潜能。在特定的培养、分化条件下可定向分化为软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞等。越来越多的学者将骨髓间充质细胞应用于临床及基础研究。
生长因子：通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用。

摘要
背景：目前诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞主要以使用诱导因子的方法为主。
目的：分析转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的协同刺激作用，以求获得最佳的诱导效应。
方法：取SD大鼠骨髓，采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养骨髓间充质干细胞。按添加诱导因子不同分4组：转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组、转化生长因子β1组、胰岛素样生长因子1组、对照组。在基础诱导液基础上添加相应诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。诱导21 d后行Ⅱ型胶原免疫荧光染色，诱导7，14，21 d后行免疫细胞化学染色检测Ⅱ型胶原表达。
结果与结论：①诱导21 d后，转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组、转化生长因子β1组免疫荧光显示胞浆呈棕红色，高度表达Ⅱ型胶原，而胰岛素样生长因子1组和对照组结果呈阴性；②免疫细胞化学染色显示，转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1组在各个时间段的Ⅱ型胶原表达量明显高于转化生长因子β1组(P < 0.01)，且随着时间的延长，表达量逐渐增加。胰岛素样生长因子1组和对照组免疫细胞化学染色呈阴性；③结果表明，体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞时，转化生长因子β1与胰岛素样生长因子1具有协同刺激作用，二者联合使用可获得较佳的诱导效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2929-3201(谭荣邦)

关键词: 软骨细胞, 诱导分化, 胰岛素样生长因子1, 转化生长因子β1, 干细胞, 骨髓间充质干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Inducing factors are currently used as a main method for the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the collaborative stimulation of transforming growth factor beta1 (TGF-β1) and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) to induce the directed differentiation of BMSCs to chondrocytes, and to explore the best inductive effect.
METHODS: Rat BMSCs were isolated, cultured and purified using adherent culture. Then, different inducing factors were added in the induction medium: TGF-β1+IGF-1 group, TGF-β1 group, IGF-1 group, and control group without growth factors. Immunofluorescence was carried out at 21 days of induction. The expression of collagen type II was evaluated by immuncytochemical staining at 7, 14 and 21 days of induction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence detection of the TGF-β1+IGF-1 and TGF-β1 groups showed highly expressed collagen type II (brown red-stained cytoplasm), while negatively expressed collagen type II in the other two groups. (2) Findings from the immuncytochemical staining showed that the expression of collagen type II was stronger in the TGF-β1+IGF-1 group than the TGF-β1 group (P < 0.01), and the expression was gradually enhanced with time. Meanwhile, there was also no expression of collagen type II in the IGF-1 and control groups. To conclude, the combination of TGF-β1 and IGF-1 can achieve the better inductive effect on the chondrogenic differentiation of BMSCs in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Chondrocytes, Cell Differentiation, Insulin-Like Growth Factor I, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

谭荣邦，陈宏明，罗世官，李日著，曾德创. 体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞：转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1的协同刺激作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2631-2636.

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图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞诱导前后形态学变化 原代培养24 h后首次换液，去除未贴壁细胞，倒置显微镜下见贴壁细胞呈分散、克隆集落样生长，大部分细胞形态呈梭形、三角形，小部分细胞形态呈圆形，细胞增殖迅速。3-5 d后大部分细胞呈纺锤形成纤维样细胞形态，可见明显细胞集落形成，细胞呈放射状排列，有突起。随着细胞增殖，细胞集落间互相融合。7-10 d后细胞长满瓶底80%-90%进行传代。传代细胞开始呈圆形，贴壁后伸展为梭形，细胞核居中，有1个或2个核仁。第3代后细胞纯化，杂质细胞极少见，细胞形态均一，极个别细胞呈宽大多边形，见图1A。诱导7 d后细胞形态开始发生改变，逐渐转变成三角形、星形、多边形，随着诱导时间延长，三角形、星形、多边形细胞逐渐增多，21 d后绝大多数细胞呈三角形、星形、多边形细胞形态，可见多个突起，见图1B。

2.2 骨髓间充质干细胞鉴定结果 流式细胞仪检测结果显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90，CD29，阳性率分别为99.6%，99.7%，而极少表达CD34，CD45，阳性率分别为0.1%，0.7%，见图2。免疫荧光显示骨髓间充质干细胞表达CD90，CD29在99%以上，而不表达CD34，CD45，见图3。说明实验中分离培养的细胞是非造血干细胞的骨髓间充质干细胞。

2.3 骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的鉴定

2.3.1 Ⅱ型胶原免疫荧光染色 诱导21 d后，TGF-β1+ IGF-1组、TGF-β1组免疫荧光显示胞浆呈棕红色，高度表达Ⅱ型胶原，而IGF-1组和对照组结果呈阴性，见图4。

2.3.2 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色 TGF-β1+ IGF-1组、TGF-β1组Ⅱ型胶原染色呈阳性，胞浆见棕黄色、棕褐色颗粒，近胞核处明显。而IGF-1组和对照组结果呈阴性，见图5。以JEDR8010D形态图像分析软件VESION1.0扫描图片，结果见表1。TGF-β1+ IGF-1组Ⅱ型胶原表达量明显高于TGF-β1组(P < 0.01)，且随着时间的延长，表达量逐渐增加，表明TGF-β1与IGF-1共同诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞时两者具有协同刺激作用。

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引言

目前对气管大的缺损(成人的40%-50%，儿童的1/3)处理思路是使用气管替代物修复以恢复气管通畅及气管的生理功能^[1]，而利用组织工程技术构建组织工程气管被认为是理想的气管替代物，是气管修复研究的热点。合适的软骨种子细胞来源是构建组织工程气管的关键因素之一。骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力、多向分化潜能、可自体移植、取材对自体创伤小^[2]、免疫原性弱及不涉及伦理道德争议等诸多优点。骨髓间充质干细胞在特定的培养、分化条件下可定向分化为软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞等^[3-9]。

目前骨髓间充质干细胞已被应用于基础及临床多个学科，包括呼吸系统^[10-11]、骨骼系统^[12-14]、消化系统^[15-16]、循环系统^[17-18]、眼科^[19]、泌尿系统^[20]、血液系统^[21]、免疫系统^[22-23]、神经系统^[24-25]、内分泌系统^[26]。骨髓间充质干细胞可定向分化为软骨细胞，故而有可能成为组织工程气管软骨研究最理想的种子细胞。

目前诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞方法有：①各种诱导因子作用；②诱导因子及与软骨细胞共培养^[27]；③流体切应力作用^[28]。主要还是以使用诱导因子的方法为主，包括胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)和转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)。

实验以TGF-β1、IGF-1作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞，比较单独使用和联合使用对Ⅱ型胶原表达量的影响，寻求一种体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的最优方法。

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材料方法

1.1 设计 细胞水平对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年1月至2017年2月在右江民族医学院实验研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康SD大鼠15只，雌雄不限，四五周龄，体质量200-300 g，由右江民族医学院实验动物中心提供。对SD大鼠的处理严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定^[29-30]。

1.3.2 实验仪器和试剂 CO₂培养箱(Hereaus公司)；形态学显微镜 Nikon ECLIPES E200(Nikon公司)；荧光显微镜Leica DMRE2(Leica公司)；CA-1480-2垂直层流洁净工作台(上海上净净化设备有限公司)；低温高速离心机(Hereaus公司)；即用型SABC试剂盒(武汉博士德公司)；兔抗-Ⅱ型胶原(武汉博士德公司)；DMEM-F12(Hyclone公司)；FITC anti-rat CD29，FITC anti-rat CD45，FITC anti-rat CD90，PE anti-rat CD34(Biolegend公司)；IGF-1，TGF-β1(Peprotech公司)。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞获取、培养、纯化 颈椎脱臼法处死SD大鼠，无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨，去除股骨和胫骨两端，用5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基反复冲打骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶中，加入5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养^[31]。24 h后首次换液，去除未贴壁细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长情况^[32-33]。以后每3 d换液1次，细胞长满瓶底80%-90%时给予0.25%胰酶消化传代，继续培养，通过换液、传代去除杂质细胞，一般第3，4代后可获得均一性好的骨髓间充质干细胞。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 ①表面特异抗原鉴定：取生长状态良好的第4代骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰酶消化，离心，分别加入PE-CD34、FITC-CD29、FITC-CD90、FITC-CD45抗体，并设同型对照，室温孵育30 min，PBS冲洗，上流式细胞仪检测^[34]；②免疫荧光鉴定：取生长状态良好的第4代骨髓间充质干细胞，接种于6孔板，孔内置玻片，加入5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置于37℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养，观察细胞长满爬片后，分别加入PE-CD34、FITC-CD29、FITC-CD90、FITC-CD45抗体，室温孵育30 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观察并拍照。

1.4.3 体外诱导及分组 取第4代骨髓间充质干细胞按1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板，内置盖玻片行细胞爬片。按添加诱导因子不同分4组：①TGF-β1+ IGF-1组：10 μg/L TGF-β1和50 μg/L IGF-1联合诱导；②TGF-β1组：10 μg/L TGF-β1单独诱导；③IGF-1组：50 μg/L IGF-1单独诱导；④对照组：单独使用DMEM高糖培养基，不加诱导因子。4组在DMEM高糖培养基中加入50 mg/L维生素C、6.25 mg/L胰岛素、51.6 μg/L地塞米松作为基础诱导液。

1.4.4 Ⅱ型胶原免疫荧光染色 诱导21 d后取各组细胞，40 g/L多聚甲醛固定，血清封闭，0.25%TritonX-100通透20 min，先后加入一抗(兔抗Ⅱ型胶原抗体)及对应的生物素化二抗，室温孵化30 min，PBS洗涤后加入SABC-Cy3，中性树脂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.5 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色 取诱导7，14，21 d 3个时间段的各组细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定，5%BSA封闭，加入一抗(兔抗Ⅱ型胶原抗体)，置湿盒内4 ℃过夜，PBS清洗后加单克隆小鼠抗兔IgG，PBS洗3遍，加DAB显色剂显色10 min，苏木精复染，梯度脱水，透明，中性树脂封固。以JEDR8010D形态图像分析软件VESION1.0扫描图片，分析细胞胞浆中的Ⅱ型胶原量。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态及鉴定结果；②骨髓间充质干细胞诱导后形态变化以及Ⅱ型胶原表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0软件包进行处理，数据以x(_)±s表示，行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

创伤、肿瘤等原因导致的气道受损严重影响呼吸、语言和吞咽功能。特别是气管损害超过成人的40%-50% (5.0-6.0 cm，9至10个软骨环)，儿童的1/3时，不能直接行端端吻合，在这种情况下只能进行气管移植，以恢复气道的通气功能。组织工程的发展为气管移植带来了新的思路。种子细胞来源是组织工程气管研究的首要问题，Ertan等^[35]将TGF-β1和IGF-1联合作用于骨髓间充质干细胞，应用于软骨组织工程学研究取得了良好的效果，说明骨髓间充质干细胞在组织工程气管构建方面有良好的应用前景。目前骨髓间充质干细胞分离纯化方法有贴壁培养分离法、密度梯度分离法、流式细胞分离法、免疫磁性分离法等^[36]，以上4种方法各有优缺点^[37]。贴壁细胞分离法是利用骨髓间充质干细胞贴壁特性，通过换液、消化传代去除不贴壁杂质细胞，使得培养的骨髓间充质干细胞纯化。密度梯度离心法是根据骨髓中各种细胞成分密度不同，分离出单个核细胞后贴壁培养。流式细胞分离法、免疫磁性分离法对细胞有一定程度的损伤，分离后出现细胞死亡、增殖缓慢等问题，另外检测成本较高和技术水平要求高，在某种程度上限制流式细胞分离法、免疫磁性分离法的应用。综合以上各种纯化方法优缺点，实验采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养骨髓间充质干细胞。培养的细胞贴壁快，贴壁率高，很快形成细胞克隆集落，最终可获得大量骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞无特异性表面标志物^[38]，一般表达间质、内皮、上皮和肌肉细胞特征的标志物，如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106等，而不表达典型造血干细胞表面抗原，如CD34、CD14、CD45^[39]。目前尚未建立鉴定骨髓间充质干细胞的统一标准，一般多采用表面标志物和形态结构功能特性来综合鉴定^[40-41]。实验采用流式细胞术联合免疫荧光法，即定量和定性方法结合共同鉴定骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞表达CD90、CD29在99%以上，而不表达CD34、CD45。结果显示全骨髓培养+贴壁纯化法具有操作简单、高效、实用、快速等优点，是值得推荐的分离培养方法。

体外诱导骨髓间充质干细胞的分化主要取决于加入的诱导因子。目前的研究已证实TGF-β1和IGF-1可诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞。TGF-β1是骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞过程中的关键因子^[42]。TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的具体机制是TGF-β1产生一种信号通过smad途径传导至细胞核，激活sox9，促进sox9表达，继而促进细胞中Ⅱ型胶原基因的表达，促进Ⅱ型胶原的分泌^[43]。因此，TGF-β1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的功能^[44]。IGF-1促使细胞有丝分裂，合成软骨基质蛋白多糖，促进Ⅱ型胶原表达。但目前对IGF-1诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞的具体机制尚不完全明确。Mara等^[45]研究发现，骨髓间充质干细胞经IGF-1诱导后Sox9、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平较低，与TGF-β1相比，IGF-1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的效率极低。而本实验单独使用IGF-1未能诱导出软骨细胞，考虑与IGF-1诱导效率低有关。联合应用TGF-β1与IGF-1诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞时，骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的效率明显增高，说明两种因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞时有协同刺激作用。这种协同作用在早期促进骨髓间充质干细胞分化更加明显，同时可以避免单独使用诱导因子产生的不良结果，如单纯TGF-β1诱导易导致软骨细胞肥大化^[46]。

TGF-β1或联合使用TGF-β1和IGF-1作为诱导因子时，免疫荧光和免疫细胞化学染色检测结果显示Ⅱ型胶原表达呈阳性，表明TGF-β1或联合使用TGF-β1和IGF-1可以诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞。而单独使用IGF-1时诱导出的细胞Ⅱ型胶原表达呈阴性，表明单独使用IGF-1不能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞，考虑与IGF-1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的效率极低有关。从免疫细胞化学染色Ⅱ型胶原定量结果可看出联合应用TGF-β1和IGF-1时Ⅱ型胶原表达量明显增加，骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的效率明显增高，效果更显著。TGF-β1与IGF-1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化具有协同刺激作用，其具体机制有待进一步研究。

实验采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养出高度纯化的骨髓间充质干细胞。联合使用TGF-β1、IGF-1诱导骨髓间充质干细胞在体外定向分化为软骨细胞，获得了最佳的诱导效应，为进一步应用组织工程技术修复气管软骨缺损提供了实验基础与技术可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程