抑制GATA5蛋白可否促进HELA细胞中癌干细胞因子sox2、c-myc及CD44的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1566

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 710-715.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1566

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抑制GATA5蛋白可否促进HELA细胞中癌干细胞因子sox2、c-myc及CD44的表达

冯海鹏^1，2，郑艺菲^1，2，周莹^1，2，李志路^1，2，孙艳^1，2，刘坤^1，2，张瑞祝^1，2，王桥芸^1，2，孟波²，林波^1，2，李孟森^1，2，3

¹海南省肿瘤发生与干预重点实验室，海南省海口市 571199；²海南医学院，海南省海口市 571199；³海南医学院肿瘤研究所，海南省海口市 571199

修回日期:2018-10-30 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 李孟森，教授，博士，海南省肿瘤发生与干预重点实验室，海南省海口市 571199；海南医学院，海南省海口市571199；海南医学院肿瘤研究所，海南省海口市 571199；林波，博士，海南省肿瘤发生与干预重点实验室，海南省海口市 571199；海南医学院，海南省海口市 571199
作者简介:冯海鹏，男，1990年生，山东省人，2017 年潍坊医学院毕业，主要从事肿瘤发生与干预研究。共同第一作者：郑艺菲，女，1991年生，陕西省人，2013年海南医学院毕业，主要从事肿瘤发生与干预研究。共同第一作者：周莹，女，1991年生，湖北省人，2016年湖北科技学院毕业，主要从事肿瘤发生与干预研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560450)，项目负责人：李孟森；国家自然科学基金项目(31560243)，项目负责人：林波；海南省研究生创新课题基金项目(Hys2017-178)，项目负责人：孟波；海南省研究生创新课题基金项目(Hys2017-180)，项目负责人：冯海鹏；海南省研究生创新课题基金项目(Hys2018-277)，项目负责人：冯海鹏；海南省研究生创新课题基金项目(Hys2018-278)，项目负责人：王桥芸；海南省研究生创新课题基金项目(Hys2018-279)，项目负责人：张瑞祝

Inhibition of GATA5 expression in HELA cells promotes expression of sox2, c-myc and CD44 in HELA cells

Feng Haipeng^{1, 2}, Zheng Yifei^{1, 2}, Zhou Ying^{1, 2}, Li Zhilu^{1, 2}, Sun Yan^{1, 2}, Liu Kun^{1, 2}, Zhang Ruizhu^{1, 2}, Wang Qiaoyun^{1, 2}, Meng Bo², Lin Bo^{1, 2}, Li Mengsen^{1, 2, 3}

¹Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; ²Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China; ³Institute of Oncology, Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China

Revised:2018-10-30 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Li Mengsen, MD, Professor, Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China; Institute of Oncology, Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China； Lin Bo, MD, Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China
About author:Feng Haipeng, Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China. Zheng Yifei, Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China. Zhou Ying, Hainan Provincial Key Laboratory of Oncology Occurrence and Intervention, Haikou 571199, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 571199, Hainan Province, China. Feng Haipeng, Zheng Yifei and Zhou Ying contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560450 (to LMS) and 31560243 (to LB); Hainan Provincial Postgraduate Innovation Project, No. Hys2017-178 (to MB), Hys2017-180 (to FHP), Hys2018-277 (to FHP), Hys2018-278 (to WQY), and Hys2018-279 (to ZRZ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
sox2：SRY(sex determining region Y)-box2，也称为sox2，是sox家族的一员，作为一种转录因子，是维持未分化的胚胎干细胞自我更新或多能性必不可少的编程因子；在哺乳动物的许多发展阶段发挥关键作用。癌细胞中被过度激活，也作为癌干细胞标志性因子。
c-myc：c-myc位于第8染色体上，作为转录因子调节原癌基因的表达。Myc家族由3个相关的人类基因c-myc、l-myc和n-myc组成。在癌症中，c-myc编程因子被激活并持续表达，导致激活许多癌基因表达进而促使癌症的形成，c-myc被认为是抗癌药物的一个有前景的靶点。

摘要
背景：GATA5蛋白在多种癌症发生过程中被抑制表达，有研究显示GATA5降低表达或被甲基化后失去功能，不能有效促进干细胞分化，维持细胞的正常功能。宫颈癌HELA细胞表达GATA5蛋白，在宫颈癌中抑制GATA5表达是否可促进其恶性转化还是未知。
目的：分析GATA5蛋白在宫颈癌HELA细胞中被进一步抑制表达后，其恶性转化情况及与癌干细胞形成相关因子sox2，c-myc及CD44的表达情况。
方法：转入CMV-siRNA-gata5，使GATA5在HELA细胞中被进一步抑制表达后， ①RT-PCR检测c-myc mRNA，sox2 mRNA的表达；②MTT法检测HELA细胞的增殖能力；③检测HELA细胞的集落形成和软琼脂单克隆形成能力；④Western blot检测细胞GATA5、c-myc、sox2蛋白表达变化；⑤激光共聚焦检测细胞的CD44蛋白定位及蛋白表达变化。
结果与结论：用CMV-siRNA-gata5抑制HELA细胞中的GATA5表达后，HELA细胞的增殖能力、单克隆形成及集落形成能力均增强；同时发现其癌干细胞因子c-myc，sox2，CD44的表达增强。提示GATA5蛋白被抑制表达后，HELA细胞的恶行性为增加，其机制可能是GATA5被抑制后，促进了癌干细胞因子sox2，c-myc，CD44等的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4184-3202(冯海鹏)；0000-0001-5124-322X(郑艺菲)；0000-0002-5379-8875(周莹)

关键词: 宫颈癌, HELA细胞, GATA5, c-myc, sox2, CD44, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: GATA5, as a tumor suppressor gene, plays a role in inhibiting the development of cancer. GATA5 can be methylated in gastrointestinal tumors and then lose its function. GATA5 can be also methylated during hepatocarcinogenesis, and then cannot promote the differentiation of stem cells and maintain the normal function. Cervical cancer HELA cells express GATA5 protein, in which whether GATA5 plays a tumor suppressor function is still unknown.
OBJECTIVE: To analyze the expression of sox2, c-myc and CD44 related to cancer stem cell formation after suppressing the expression of GATA5 in cervical cancer HELA cells.
METHODS: Transfection of CMV-siRNA-gata5 further inhibited the expression of GATA5 in cervical cancer HELA cells. The expression of c-myc mRNA and sox2 mRNA were then detected by RT-PCR. The proliferation of HELA cells was detected by MTT. The colony formation and soft agar monoclonal formation of HELA cells were observed. The expression of GATA5, c-myc and sox2 was detected by western blot. The expression and location of CD44 was detected by laser confocal microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After suppressing the expression of GATA5 in cervical cancer HELA cells by CMV-siRNA-gata5, the proliferation, cell monoclonal formation and colony formation of HELA cells were enhanced. The expression of c-myc, sox2 and CD44 was also strengthened. These findings indicate that the malignant activity of HELA cells is increased by inhibiting the GATA5 protein expression. The mechanism may be that inhibition of GATA5 promotes the expression of cancer stem cell factors sox2, c-myc, and CD44.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Uterine Cervical Neoplasms, Hela Cells, GATA5 Transcription Factor, Proto-Oncogene Proteins c-myc, SOXB2 Transcription Factors, Stem Cells

中图分类号:

冯海鹏，郑艺菲，周莹，李志路，孙艳，刘坤，张瑞祝，王桥芸，孟波，林波，李孟森. 抑制GATA5蛋白可否促进HELA细胞中癌干细胞因子sox2、c-myc及CD44的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 710-715.

Feng Haipeng, Zheng Yifei, Zhou Ying, Li Zhilu, Sun Yan, Liu Kun, Zhang Ruizhu, Wang Qiaoyun, Meng Bo, Lin Bo, Li Mengsen. Inhibition of GATA5 expression in HELA cells promotes expression of sox2, c-myc and CD44 in HELA cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 710-715.

图/表（结果） 2

2.1 CMV-SiRNA-gata5降低GATA5蛋白表达并促进细胞生长 用荧光观察转染CMV-siRNA-gata5的细胞后，细胞转染效率在70%以上，见图1A。

经过G418筛选，干扰GATA5表达后，通过Western blotting实验发现GATA5的表达量降低，见图1B。同时通过激光共聚焦实验发现GATA5主要分布细胞核中，胞浆中也有分布，干扰GATA5表达后，细胞核中GATA5含量明显减少，见图1C。

MTT实验发现干扰GATA5表达后，HELA细胞增长速度加快，见图1D。以上结果表明CMV-siRNA-gata5可以有效干扰GATA5的表达，干扰GATA5表达后，HELA细胞增殖加快。

2.2 抑制GATA5表达后促进细胞单克隆形成 软琼脂单克隆实验中，通过CMV-siRNA-gata5降低GATA5表达后的HELA细胞形成的克隆球体大于正常对照组，且CMV-SiRNA-gata5干扰GATA5表达后，克隆球周围有明显分散细胞，见图2A。细胞集落形成实验发现，降低GATA5表达后的HELA细胞与正常组相比形成的细胞集落更大，形成的个数也多，见图2B。提示GATA5的表达与细胞单克隆及集落形成相关，降低GATA5表达后，有利于细胞单克隆及集落形成。

2.3 抑制GATA5表达后促进c-myc，sox2 mRNA及蛋白表达 见图3。

实验发现，在干扰GATA5表达后，通过RT-PCR定量检测发现干细胞重编程因子c-myc，sox2 mRNA在细胞中表达升高，见图3A；通过Western blotting 实验发现细胞中的c-myc，sox2蛋白表达量同样升高，见图3B；激光共聚焦实验也发现c-myc蛋白及sox2蛋白的表达增强，见图3C。

降低GATA5表达后，c-myc mRNA及sox2 mRNA在细胞中含量升高，表明GATA5从基因转录水平抑制c-myc，sox2蛋白的表达；抑制GATA5表达后，Western blot和激光共聚焦证实了c-myc，sox2蛋白表达升高并入核。

2.4 抑制GATA5表达后促进干细胞因子CD44表达 激光共聚焦发现，抑制GATA5表达后，经过G418筛选后，HELA细胞表达的CD44增强，见图4。提示GATA5的表达降低可能促进CD44的表达，而CD44与成瘤性、侵袭性及淋巴转移性等细胞恶性行为相关。进一步提示抑制GATA5表达，促使HELA细胞的恶行性为增加。

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引言

宫颈癌是导致成年女性死亡的主要疾病之一，全世界每年有47万例宫颈癌新增病例，死亡人数超过20万例^[1]。多数宫颈癌患者被发现时已处在晚期阶段，失去手术机会，只能接受放疗和化疗，但放疗和化疗会带来较多的不良反应和并发症。近来发现宫颈癌中含有癌干细胞及c-myc、sox2、CD44等癌干细胞因子，这些因子激活相关通路、启动癌基因的表达，促进癌症恶性转化，是导致癌症治疗困难的潜在因素^[2-3]。

GATA转录因子家族共有GATA1-GATA6等6个成员^[4]，GATA5是调控器官发育的转录因子，主要表达与内胚层来源的器官，对组织的分化和增殖具有重要的调控作用，比如参与调控染色质状态，在胚胎时参与心脏、肠的调控，参与调控早期肝脏的发育^[6]。GATA5调控细胞重编程，促进干细胞分化，进而维持组织器官的正常功能。当癌症发生时，GATA5多被甲基化失去转录调节功能，进而失去维持细胞正常功能的作用^[7-10]，比如在消化道肿瘤中GATA5可以被甲基化进而失去功能^[7]；在肝癌中也存在GATA5甲基化和抑制表达现象，当去GATA5甲基化和在肝癌细胞中过表达GATA5后，发现GATA5能抑制肝癌细胞生长，促进肝癌癌细胞凋亡^[9]。当GATA5被甲基化或被抑制表达后，不能有效维持细胞正常分裂，不能有效抑制c-myc等癌基因的表达，不能有效抑制细胞基因重编程和细胞恶性转化^[11]。在宫颈癌细胞HELA中有GATA5表达，其是否参与抑制宫颈癌细胞恶性转化的机制还不清楚。因此，此次研究构建了CMV-siRNA-gata5慢病毒干扰表达载体，通过感染HELA细胞，然后检测GATA5被抑制表达后，细胞的增殖、单克隆形成等生物活性的变化，同时检测恶性转化相关基因sox2，c-myc，CD44等的表达，观察GATA5被抑制后HELA细胞的恶行性为变化并探讨其机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验分析。

1.2 时间及地点 实验于2018年5月至8月在海南省肿瘤发生与干预实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞 人宫颈癌细胞系HELA(From Department of Cell Biology，Peking University Health Science Center)。细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基培养于37 ℃，含体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱中。

1.3.2 实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；青霉素和链霉素(Sigma，美国)；兔抗人GATA5抗体(Abcam，英国)；兔抗人c-myc抗体(Abcam，英国)；兔抗人sox2抗体(Abcam，英国)；鼠抗人GAPDH抗体(Abcam，英国)；HRP-标记羊抗鼠/兔IgG(Abcam，英国)；Alex647-标记山羊抗兔(Abcam，英国)；重组慢病毒质粒(碧云天生物技术研究所，中国)； MTT试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；增强型化学发光显色系统(Amersham Life Science，美国)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立慢病毒介导的过表达CMV-siRNA-gata5- EGFP的细胞系 将HELA细胞接种到六孔板中直至它们达到70%-80%汇合。根据说明书的要求，CMV-siRNA-gata5-EGFP重组慢病毒感染HELA细胞后用含嘌呤霉素筛选5 d，使用FACSAria系统检测EGFP阳性细胞。干扰序列如下：5'-AAA GUC CUC AGG CUC GAA C-3'。

1.4.2 细胞增殖检测 转染CMV-siRNA-gata5，CMV-siRNA-scramble 或者不转染质粒(control)的HELA细胞培养48 h后，将HELA细胞经胰酶消化后取1.5×10⁴细胞传代培养到96孔板中，分别再培养24，48，72 h后，根据说明书的要求，使用MTT法检测细胞增殖活性，MTT的终质量浓度为5 g/L，MTT每孔添加量为20 μL，放细胞培养箱中孵育4 h后，每孔加入200 μL二甲基亚砜，振荡10 min使结晶物充分溶解，使用酶标仪选择490 nm处的吸光度值测定样品。所获数据至少重复6个孔，实验重复3次。对照组的细胞活性设定为100%，生长率=(对照组-处理组)/对照组× 100%(A₄₉₀)^[12]。

1.4.3 集落形成实验 转染CMV-siRNA-gata5，CMV-siRNA-scramble 或者不转染质粒(control)的HELA细胞培养48 h后，把这些细胞以1 000细胞/孔的密度接种在24孔板中，24 h后更换含400 g/L的G418培养基每2 d更换1次。7 d后，用体积分数75%乙醇固定30 min，用0.2%结晶紫(北京中山生物技术有限公司，中国)染色15 min，PBS洗涤3次。用显微镜(100倍)进行拍摄，观察和计数，参考文献进行^[13]。

1.4.4 软琼脂克隆形成实验 转染CMV-siRNA-gata5，CMV-siRNA-scramble或者不转染质粒(control)的HELA细胞培养48 h后，在六孔板下层平铺1.2%琼脂后，将含有1 000细胞和含体积分数20%胎牛血清的完全培养基与0.7%软琼脂1∶1混合平铺上层。在37 ℃孵育10 d。用尼康倒置显微镜(尼康公司，东京，日本)拍摄和计数菌落。

1.4.5 实时定量PCR(RT-PCR)测定sox2及c-myc mRNA表达 使用RNA提取试剂盒按说明书进行实验操作，测定提取细胞内的总RNA浓度后，参照RNA RT-PCR引物试剂盒和RT-PCR Starter试剂盒说明书的反应体系和反应条件。采用定量PCR仪进行实验。所需引物sox2：正：5'-GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA AGA GG-3'，反：5'-TTG CGT GAG TGT GGA TGG GGA TTG GTG-3'；c-myc：正：5'-CAG GAC TGT ATG TGG AGC GGC TTC-3'，反：5'-TGC TGT CGT TGA GAG GGT AG-3'；GAPDH：正：5'-AAA TCC CAT CAC CAT CTT CCA G-3'，反：5'-TGA GTC CTT CCA CGA TAC CAA A-3'。

1.4.6 Western blotting实验测定GATA5，C-myc，Sox2蛋白表达 转染CMV-siRNA-gata5，CMV-siRNA-scramble的HELA细胞培养48 h后，通过Western分析细胞中GATA5，C-myc，Sox2蛋白表达。实验方法如前所述^[14]。

1.4.7 激光共聚焦检测蛋白表达 将转染CMV-siRNA- gata5，CMV-siRNA-scramble细胞接种到激光共聚焦专用培养皿中，用补充有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养在37 ℃，体积分数5%CO₂的湿润气氛下中培养24 h。细胞固定通透后，与兔抗人第一抗体GATA5，c-myc，sox2，CD44孵育12 h，后与带有荧光的Alex647二抗一起温育2 h，用PBS洗涤后，添加DAPI，通过激光共聚焦显微镜(Fuji，Japan)观察GATA5，c-myc，sox2，CD44的表达和定位。使用Olympus Fluoview FV1000(日本)激光共聚焦显微镜观察标记结果并拍摄图像。方法按文献[15]进行。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR检测c-myc，sox2 mRNA表达；②MTT法检测细胞系增殖能力；③集落形成和软琼脂单克隆形成实验检测过表达细胞自我更新能力和干细胞样水平；④Western blot检测细胞蛋白表达变化；⑤激光共聚焦检测细胞蛋白定位及蛋白表达变化。

1.6 统计学分析 用SPSS 13.0对实验数据进行统计分析，数据以x(_)±s表示，所有数据用student’s t 检验或ANOVA进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义^[14]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

GATA5在大多数癌细胞中存在甲基化，而甲基化的GATA5失去生物调节功能。Lei等^[9]研究发现GATA5在肝细胞癌中被甲基化，用去甲基化试剂增强GATA5表达后，抑制肝癌细胞克隆形成、促进肝癌细胞凋亡。Liu等^[10]研究发现在胆管癌细胞中，用去甲基化试剂增强GATA5表达后，抑制胆管癌细胞增殖及迁移。作者在实验中也发现GATA5在宫颈癌细胞HELA中发挥相应的生物学功能。HELA细胞表达GATA5，此次实验通过siRNA-gata5抑制GATA5表达后，促进HELA细胞增殖，并促进细胞单克隆及集落形成，提示部分干扰GATA5表达，促进HALA细胞恶性转化，也反向证实GATA5在抑制HALA细胞增殖等方面起作用。

c-myc，sox2作为癌干细胞重编程因子，促进癌细胞无限增殖及增加恶性程度^[16-21]，c-myc，sox2的表达增加预示癌干细胞特性的形成^[22-23]。CD44为重要的干细胞因子，在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用^[24-29]，作者发现在转入CMV-siRNA-gata5干扰部分GATA5表达后，细胞的c-myc、sox2、CD44表达增强，预示癌细胞的恶性程度增加。总之，GATA5与HELA 细胞的增殖、癌干细胞重编程因子c-myc，sox2，CD44的表达相关，部分抑制GATA5表达促进癌干细胞重编程因子c-myc，sox2，CD44的表达及细胞恶性转化。

宫颈癌的有效治疗越来越得到重视，如何提高治疗效果，降低肿瘤耐药性，提高患者生存率是一个急需解决的问题。sox2、c-myc、CD44D等重编程干细胞因子通过直接或者间接的方式促进癌细胞的恶性进展。 GATA5作为抑癌基因，维持干细胞正常干性，促使干细胞分化，维持组织的正常功能，然而在癌症发生后，GATA5表达受到抑制，GATA5多因甲基化而失去功能，不能有效抑制癌症的发生。因此，靶向提高癌细胞中GATA5的生物活性，可能在宫颈癌治疗中起到积极作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

抑制GATA5蛋白可否促进HELA细胞中癌干细胞因子sox2、c-myc及CD44的表达

Inhibition of GATA5 expression in HELA cells promotes expression of sox2, c-myc and CD44 in HELA cells

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