高压氧治疗促进脑梗死模型大鼠神经再生微环境及神经功能的恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量临床研究证实，脊髓损伤区域的微环境通过高压氧可获得显著改善，但高压氧对脑损伤微环境有何影响呢？
目的：观察高压氧治疗对大鼠脑梗死区神经再生微环境及神经功能恢复的影响。
方法：构建大脑中动脉阻断制作局灶性脑梗死模型大鼠，并进行高压氧治疗，设假手术组和模型组作对照，假手术组不结扎颈内动脉不干预，模型组造模后模拟除压力和氧浓度以外的其他高压氧治疗过程及环境条件。
结果与结论：与模型组相比，治疗后第16天高压氧组的大鼠肢体功能评分、术后14 d 脑梗死区组织生长相关蛋白43表达均升高(P < 0.05)，术后24 h梗死灶体积均降低(P < 0.05)。结果证实，高压氧治疗促进脑梗死模型大鼠神经再生微环境及神经功能的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 脑梗死, 缺血性, 大鼠, 高压氧, 神经再生, 运动功能, 生长相关蛋白43, 微环境, 恢复, 细胞

Abstract:

BACKGROUND: Numerous clinical studies have confirmed that the microenvironment at a spinal cord injury site can be obviously improved through hyperbaric oxygen therapy; however, what effect does hyperbaric oxygen have on the microenvironment of the injured brain?

OBJECTIVE: To investigate the effect of hyperbaric oxygen therapy on nerve regeneration microenvironment and the recovery of rat nerve function after focal cerebral infarction.

METHODS: Rat models of focal cerebral infarction were established by occlusion of the middle cerebral artery and subjected to hyperbaric oxygen therapy. Sham group and model group were established as comparison. In the sham group, rat models of focal cerebral infarction were established but did not receive any treatment. Rats in the model group were placed in a hyperbaric oxygen therapy chamber but the pressure and oxygen concentration were not administered.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the score of rat limb function at 16 days after treatment and the expression of growth associated protein 43 in the rat cerebral infarcted area at postoperative 14 days were significantly increased , but infarct volume at postoperative 24 hours was all significantly decreased in the hyperbaric oxygen therapy group (all P < 0.05). These results confirmed that hyperbaric oxygen therapy can improve nerve regeneration microenvironment and promote the recovery of rat nerve function after focal cerebral infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

孙晶晶，宋乃光，张耀龙，高淑焕，孙彩悦，薛建，贺永贵，习瑾琨，张国彬. 高压氧治疗促进脑梗死模型大鼠神经再生微环境及神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6460-6464.

Sun Jing-jing, Song Nai-guang, Zhang Yao-long, Gao Shu-huan, Sun Cai-yue, Xue Jian, He Yong-gui, Xi Jin-kun, Zhang Guo-bin. Hyperbaric oxygen therapy improves nerve regeneration microenvironment and promotes rat nerve function recovery after cerebral infarction [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6460-6464.

图/表（结果） 3

参考文献

引言

脑血管病是各种血管源性脑部病变引起的脑功能障碍，是一种发病率、复发率及致死率、致残率极高的疾病，已经成为严重影响公众健康的世界性问题。随着世界人口的老龄化，环境污染，饮食结构的改变等，脑血管疾病发病率正逐年升高，而中国是世界上脑血管病患者最多的国家，对于脑血管病的相关研究具有重要的临床及基础意义。脑是人体的最重要器官，但是脑组织对缺血缺氧耐受性却极差。目前脑梗死病被公认为是危害人类健康最为严重的一种疾病，其发病率、死亡率及致残率均较高，是国内外医务工作者治疗研究的重大难题^[1-3]。目前临床上常用的治疗方式有溶栓治疗、神经影像，但对于大多数患者而言，脑梗死后神经功能的恢复并不理想^[4-6]。脑梗死后如何提高神经系统结构的可塑性与功能的恢复也是近些年来神经学科研究的热点^[7-9]。大量实验和临床研究表明，高压氧治疗脑梗死有较好的效果，高压氧治疗能够调节受损细胞的代谢，保护缺血半暗带区可存活的脑细胞，避免缺血再灌注引起的继发性损伤，可以促进侧支循环的建立、促使血脑屏障功能的恢复、起到神经保护作用^[10-12]。高压氧治疗是指将机体置于高气压的环境中通过呼吸与环境等压的纯氧，可减轻继发性神经损伤，促进内源性干细胞的增殖与分化。相关研究表明，高压氧治疗提高机体的动脉血氧分压，增加中枢神经系统组织血氧含量，促进中枢神经系统组织的有氧代谢^[23-24]。

实验采用高压氧作为干预因素探讨其对脑梗死后的疗效，并对生长相关蛋白43的表达与神经功能恢复进行观察，进一步阐述了高压氧对脑梗死后神经修复的作用及可能的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物 4周龄SD大鼠68只，体质量280-320 g，雄性，购自华北煤炭医学院。动物质量合格证号：SCXK 20060008。大鼠恒温饲养，自由饮水和进食，在实施实验的前1 d给予禁食但不禁水。

1.2 造模方法实验于2012年1月至2014年5月在天津医科大学神经病学实验室完成。

取大鼠68只，经体积分数5%乙醇消毒颈部皮肤，用10%水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔注射麻醉后，在颈部正中行切口，之后游离右侧的颈总、颈内和颈外动脉，分别结扎颈总动脉及颈外动脉，制作“v”形切口于颈总动脉近分权处，将一末端用乙醇灯烧成圆头的尼龙线置入颈内动脉17.0-18.0 mm，直至感到轻微阻力感，其中48只阻断大脑中动脉起始段及其所有血液供应，结扎颈内动脉，另外20只不结扎颈内动脉设为假手术组。

高压氧治疗促进脑梗死模型大鼠神经再生微环境及神经功能恢复相的关试剂：
试剂	来源
Western blot试剂盒，Trizol	TaKaRa公司
cDNA合成试剂盒	北京天根生化有限公司
AMV反转录试剂盒	杭州博日公司
生长相关蛋白43抗体	美国Becon Dickinson公司产品
Western blot化学发光试剂	Santa cruz公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG	美国Sigma公司
PVDF膜	Pierce公司
水合氯醛	大连宝生物工程公司

1.3 造模成功的检测标准及分组激光多普勒血流仪监测局部脑血流。造模后24 h，依据Zea Longa 5分制标准进行评分^[8]，神经缺损评分>2分者为造模成功。排除造模失败的5只及造模后死亡的3只，将剩余的40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及高压氧组，每组各20只。

1.4 高压氧治疗方法在大鼠进高压氧舱前，先将舱底置新鲜钠石灰。再于进舱后用纯氧充分洗舱10 min后，将高压氧组大鼠送入单人高压氧舱。依据100 kPa(1 ATA >/min)的速率加压到0.25 MPa下，使舱内的氧浓度> 90%，停留60 min(其间用纯氧通风10 min)后，以20 min匀速减至常压状态下。高压氧治疗从术后第3天开始，以1次/d进行高压氧治疗，连续治疗16 d。假手术组建模后不干预。模型组的大鼠也置于舱内，使其模拟除压力和氧浓度以外的其他过程及环境条件。实验过程中通过观察窗认真观察动物在舱内的行为状态，使舱内温度保持在22-24 ℃。

1.5 神经功能缺损评估根据Garcia评分法对动物进行神经行为学评估^[13]。于麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食。于脑梗死模型建立后24 h，由另一不了解实验分组情况的操作者按照Garcia评估法进行神经行为学评分并记录。此评分法最低分为3分，最高分为18分。3-7分为重度神经功能缺损，8-11分为中度神经功能缺损，12-18分为轻度神经功能缺损。分值越高说明动物的神经行为学功能越好，分值越低，说明神经功能障碍越严重。评分时间设为治疗后2 d，2周，4周。

1.6 脑梗死体积测定在神经行为学评分完成后，治疗后16 d，以体积分数3.5%的水合氯醛将大鼠过量麻醉，再将其断头处死，迅速取出脑组织，置于-20 ℃冰盐水中10 min进行冰冻，于脑槽中取行冠状位切片，片厚2 mm。于37 ℃下迅速放入20 g/L的2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)溶液中(避光)染色30 min。然后用40 g/L甲醛缓冲液固定24 h后拍照。用计算机图像处理软件(Adobe Photoshop 7 CS) 计算每张脑片的面积和梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死灶)。梗死体积=梗死面积×切片厚度，全脑体积=全脑面积×切片厚度，梗死体积百分比(%)=梗死灶体积/全脑体积。

1.7 RT-PCR检测生长相关蛋白43 mRNA的表达治疗后16 d，于各组分别取5只大鼠，用体积分数10%水合氯醛将所有大鼠深麻醉后处死。取大鼠脑组织后放入40 g/L多聚甲醛中后固定，再置于0.1 moI/L PBS中至组织下沉，连续冠状冰冻切片后，置入脑保护液-20 ℃下保存。应用Trizol试剂说明书介绍的方法提取各组组织的总RNA，RNA的含量应用紫外分光光度计测定，取5 μL总RNA，在B-BLV反转录酶作用下进行反转录反应。

生长相关蛋白43基因：上游引物为5’-GGG AGA TGG CTC TGC TACT-3’，下游引物为5’-AGA CAG GGT TCG GTG GG-3’，片段长度778 bp；β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，片段长度151 bp；PCR反应条件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环32周期，最后72 ℃延伸7 min。每个反应重复3次。

取5 mL的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后置于GDSS000凝胶自动成像仪上拍照提取图像进行分析，以生长相关蛋白43与β-actin条带的灰度比值作为扩增产物的相对表达量。

1.8 Western blot法检测生长相关蛋白43蛋白表达治疗后16 d，将样本加入电泳缓冲液后加样，电泳完结束后将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，转印后加入一抗：由兔抗大鼠生长相关蛋白43抗体(1∶800)4 ℃过夜；兔抗大鼠β-actin(1∶5 000)4 ℃过夜。经TBST洗膜5 min×4次后，经山羊抗兔抗体1∶700，37 ℃下摇床孵育1.5 h，再经TBST洗膜5 min×4次后，经二甲基联苯胺(DAB)显色，实验重复3次。蛋白的检测均以PBS替代一抗作为阴性对照，以内参β-actin作为阳性对照，采用Quantity One图像分析系统，用每一个样本的条带灰度值与相应样本的β-actin条带灰度值相比计算出其比值。

1.9 主要观察指标各组神经功能缺损评分、脑梗死体积、各组脑梗死区生长相关蛋白43 mRNA和蛋白的表达。

1.10 统计学分析所有实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，组间均数差异的比较采用单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

大量动物和临床试验研究证明高压氧可以通过直接和间接途径发挥作用，对脑梗死后的神经保护起着重要作用^[14-17]，特别是缺血再灌注模型的疗效最为显著。目前有研究表明高压氧治疗脑梗死的机制有多种^[18-21]：①通过改善组织缺氧，维持缺血细胞代谢，提供ATP。②降低脑血管通透性、改善血液流变学，减轻脑水肿。③保护梗死周围缺血半暗带组织，改善脑梗死的预后。④增加血液中的氧含量，促使神经元功能恢复。研究表明，高压氧联合药物治疗可以明显降低大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠脑梗死的体积从而起到脑神经保护作用^[22]，提示高压氧联合药物治疗可以提高临床治疗效果^[22]。Rusyniak等^[23]的研究结果表明早期高压氧介入治疗对缺血性脑血管病患者有明确的远期恢复治疗效果，可以改善脑卒中后神经功能的恢复，还可预防再次发生卒中的危险等。 MCAO模型和神经功能缺损评分是脑保护机制研究中较为常用的技术平台，在临床脑卒中的病例中，大脑中动脉阻塞的比例最高^[24-25]。MCAO模型不需要开颅，梗死部位比较恒定，可重复性好，模型稳定性高，其所模拟的病理生理过程与临床脑卒中是极其相似的，是目前国内外应用较为广泛的经典方法。且MCAO模型避免了开颅法所具有的动物损伤较大，易感染；以及光化学法的梗死只限于皮质，可不出现明显的神经表现等的缺点。但是此方法对于动物的要求以及手术者的操作比较严格。实验制作MCAO模型，通过对神经运动功能的评定、进行生长相关蛋白43蛋白质印迹的分析及梗死灶体积的计算，来分析高压氧对对大鼠脑梗死区神经再生微环境及神经功能恢复的影响。结果显示，在术后第2天，3组肢体功能评分无明显显著性差异，治疗后2周高压氧组的大鼠肢体功能评分高于模型组，而模型组及假手术组之间无显著性差异；在治疗后16 d高压氧组的生长相关蛋白43表达均较模型组及假手术组显著升高；在术后24 h高压氧组梗死灶体积均明显低于模型组。生长相关蛋白43是神经组织所固有的一种特异性的磷酸蛋白质，是神经元发育和再生的一个内在决定因子，被认为是一个整体蛋白^[26-29]。在神经系统发育和损伤再生时，生长相关蛋白43的表达升高^[30-32]，其在神经元中以胞体的囊泡中及生长的神经纤维末端含量最为丰富，占到质膜总蛋白的1%，是含量最高的蛋白质之一。相关研究证明在局灶性脑梗死时，生长相关蛋白43蛋白呈现持续性表达，并且与大鼠的行为学恢复密切相关^[33-35]。实验结果表明在术后7 d高压氧组大鼠的生长相关蛋白43表达均较模型组及假手术组显著升高，说明脑梗死后高压氧治疗可以促进生长相关蛋白43的表达，进而促使神经纤维的生长及再生。综上所述，高压氧治疗在脑梗死发病后的应用具有良好疗效，尤其是在脑梗死早期给予高压氧治疗，可以明显提高脑梗死后大鼠神经功能缺损评分，减少梗死灶体积，改善脑梗死预后。高压氧是临床氧疗中最具有说服力的治疗，其可通过改善脑缺氧、减少神经细胞凋亡和增加神经再生等促进梗死后的神经再生功能。但因高压氧使用中可能出现：延误使用、不合理的压力选择及所选的患者不合适等，而影响了其在临床上获得较为满意的治疗效果。因此，排除以上不利因素，高压氧对脑梗死的治疗将发挥着极其重要的作用，对高压氧的研究可为临床上脑梗死患者尽早治疗提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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