高压氧干预脑梗死模型大鼠脑水肿及神经功能变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究认为，高压氧有较好保护脑神经和脑细胞的作用，应用高压氧可使氧分压快速弥撒到相对缺氧的脑组织中，增加脑组织的血氧含量，促进脑水肿及脑神经功能的恢复。

目的： 观察大脑中动脉阻塞造模后高压氧干预对大鼠脑梗死组织水肿的影响，并探讨其对脑梗死大鼠神经功能保护的可能作用机制。

方法：成年雌性SD大鼠65只，造模成功60只，随机区组法分为假手术组、脑梗死组、高压氧组，每组20 只，按照线栓线法建立大鼠大脑中动脉阻塞脑梗死模型。造模后3 d，通过TUNEL法检测各实验组大鼠脑梗死区神经细胞的凋亡情况。伤后72 h通过RT-PCR、Western blot检测脑梗死区周围AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2基因转录和蛋白的表达，通过苏木精-伊红染色观察脑梗死区病理组织形态学变化，通过免疫组织化学法检测胶质纤维酸性蛋白的表达量，高压氧干预后24 h，3 d及伤后1、2 周行Longa行为学评分，检测神经功能的损伤情况。

结果与结论：①高压氧组Longa行为学评分在治疗后1，2 d均较脑梗死组显著降低(P < 0.05)。②造模后3 d高压氧组细胞凋亡指数均明显低于脑梗死组(P < 0.05)。③造模后72 h，与脑梗死组相比高压氧组AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2基因和蛋白表达均较显著降低(P < 0.05)。结果提示高压氧治疗通过减少大鼠脑梗死区神经细胞的凋亡和降低脑组织水肿，对脑梗死起到保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 高压氧, 脑梗死, 神经再生, 神经功能, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have suggested that hyperbaric oxygen could better protect cranial nerve and brain cells. Hyperbaric oxygen therapy can make oxygen partial pressure rapidly diffusing toward relatively hypoxic brain tissue, so as to increase blood oxygen content in the brain tissue, reduce brain edema and promote the recovery of brain function.

OBJECTIVE: To observe the effects of hyperbaric oxygen therapy on brain tissue swelling in rats after middle cerebral artery occlusion, and discuss the possible mechanism of action underlying the neuroprotective effects of hyperbaric oxygen therapy in rats with cerebral infraction.

METHODS: Sixty adult female rat models of cerebral infarction were successfully established by middle cerebral artery occlusion using suture method and then randomly divided into the sham, cerebral infarction and hyperbaric oxygen therapy groups (n=20 rats/group). At 3 days after middle cerebral artery occlusion, apoptosis of nerve cells in the infract area of rats in each group was detected by TUNEL method. At 72 hours after middle cerebral artery occlusion, the gene transcription and protein expression of aquaporin 4/9 and matrix metalloproteinases 9/2 in the peri-infarct area were detected by RT-PCR and western blot analysis. The pathomorphological change in the infract area was observed by hematoxylin-eosin staining. The expression level of glial fibrillary acidic protein was detected by immunohistochemistry. At 24 hours and 3 days after hyperbaric oxygen therapy and at 1 and 2 weeks after middle cerebral artery occlusion, neurological behaviors were evaluated using Longa behavioral scores.

RESULTS AND CONCLUSION: After 1, 2 days of hyperbaric oxygen therapy, Longa behavioral scores in the hyperbaric oxygen therapy group were significantly lower than those in the cerebral infarction group (P < 0.05). At 3 days after middle cerebral artery occlusion, cell apoptosis index in the hyperbaric oxygen therapy group was significantly lower than that in the cerebral infarction group (P < 0.05). At 72 hours after middle cerebral artery occlusion, the aquaporin 4/9, matrix metalloproteinases 9/2 gene and protein expression in the hyperbaric oxygen group were significantly lower than those in the cerebral infarction group (P < 0.05). These results suggest that hyperbaric oxygen therapy can play its protective role by decreasing apoptosis of nerve cells in the infarct area and lessening the edema of brain tissue in rats with cerebral infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Cerebral Infarction, Hyperbaric Oxygen, Nerve Regeneration

中图分类号:

R318

田烜. 高压氧干预脑梗死模型大鼠脑水肿及神经功能变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6423-6428.

Tian Xuan. Variations of brain edema and neurological function of rat models of cerebral infarction after hyperbaric oxygen therapy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6423-6428.

图/表（结果） 2

2.1 造模成功动物数量及过程实验选用SD大鼠65只，造模过程中大鼠死亡5只，剩余大鼠分为3组，实验过程无脱失，60只大鼠进入结果分析，见图1。

2.2 模型稳定性线栓法建立脑梗死模型具有损伤小、不需开颅、疗效肯定、还能控制缺血和再灌注时间的优势，并具有操作简单、稳定可行的优点，现已成为研究者们热衷采用的方法。 2.3 TUNEL检测大鼠脑梗死区神经细胞的凋亡情况TUNEL检测结果显示凋亡神经细胞的细胞核内出现特异性棕黄色颗粒物，光镜下可看见凋亡细胞散布在整个脑梗死区，在损伤区边缘凋亡阳性细胞亦可见。在高压氧组中，免疫组织化学呈棕黄色颗粒的凋亡细胞数(13.38±3.92)明显少于脑梗死组(31.59±2.61，P < 0.05)，假手术组未出现凋亡细胞。见图2。 2.4 AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA表达结果显示大鼠脑梗死造模72 h后，高压氧组梗死区脑组织AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA的表达高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；高压氧组大鼠梗死区脑组织AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA的表达较脑梗死组明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图3，表1，2。 2.5 AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2蛋白的表达结果显示大鼠脑梗死造模72 h后，高压氧组脑梗死区组织AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 蛋白的表达高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；高压氧组大鼠脑梗死区AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 蛋白的表达较脑梗死组显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图4，表1，2。 2.6　脑梗死区病理组织形态学变化造模后2周，光镜下可见脑梗死组梗死灶中心区及周围区神经细胞数目明显减少，神经元、神经胶质细胞肿胀，神经细胞及血管周围间隙扩大；高压氧组可见大鼠脑梗死区脑组织的水肿状态有明显减轻，梗死灶周边区神经细胞的数目增加。见图5。 2.7 各组脑梗死后胶质纤维酸性蛋白的表达量免疫组织化学显示，假手术组可见脑组织神经纤维密集排列，脑梗死组梗死区神经纤维排列稀疏，仅见很少且短的神经纤维；高压氧组神经纤维密集程度介于假手术组与脑梗死组之间，见图6。每视野下胶质纤维酸性蛋白阳性纤维数：假手术组(30.18±2.52)，高压氧组(22.42±4.52)，脑梗死组(9.43±2.58)，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。 2.8 神经学缺损评分各组大鼠在手术后1 h基本苏醒，但因手术创伤和脑梗死缘故，2 h后才可活动，假手术组无神经功能缺失，高压氧组在高压氧治疗前2 h神经行为学评分与脑梗死组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。高压氧治疗后24 h，高压氧组神经症状有所减轻，治疗72 h，高压氧组症状基本消失，与脑梗死组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)。见表3。

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引言

材料方法

1.1 造模动物 3月龄成年雌性SD大鼠65只，清洁级，体质量250-300 g，购自天津医科大学动物实验室，动物许可证号：SCXK(津) 20070003。将大鼠随机分为脑梗死模型组、高压氧组和假手术组。

1.2 造模方法实验于2014年3年至2015年2月在河北医科大学完成。

线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型^[2-3]：术前不禁水、禁食12 h。大鼠用4%异氟醚吸入麻醉，保留自主呼吸。取颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内和颈外动脉后结扎颈总动脉和颈外动脉，在颈总动脉近分叉处剪一“v”字形切口，将多聚赖氨酸或明胶处理过的1.8号鱼线由切口插入右颈内动脉，进线深度为(18.0±0.5) mm，直至大脑中动脉起始部，以完全阻断血供。假手术组不栓塞。

1.3 造模成功的检测标准造模过程中大鼠死亡5只。造模后大鼠即刻出现右侧Horner征即为模型成功的标志。

1.4 高压氧干预高压氧组造模后4 h置于高压氧舱(上海701所杨园高压氧舱厂)内，用纯氧洗舱30 min后，新鲜钠石灰颗粒吸收CO₂。按0.01 MPa/min的速率匀速加压到0.25 MPa，稳压30 min，间断加纯氧使氧体积分数维持在96.5%以上，随后以0.25 ATA/min匀速减压至常压并出舱活动，隔天1次，共暴露8次。假手术组及模型组大鼠在同时段模拟进出舱活动。

1.5 指标检测

1.5.1 TUNEL法检测大鼠脑梗死区神经细胞的凋亡情况造模后72 h，每组取5只大鼠行TUNEL法检测计数，按德国Roche公司TUNEL检测试剂盒说明书操作。胞核呈棕黄色颗粒即为TUNEL阳性细胞，在高倍镜(×400)下随机计数5个视野下阳性细胞数量，以其平均值表示，计算凋亡指数。凋亡指数=阳性细胞/(阴性细胞+阳性细胞)×100%。

1.5.2 RT-PCR检测造模后72 h，在3组实验大鼠中分别取梗死区的脑组织50 mg，随机取每组5只大鼠。按照Trizol 试剂盒说明书步骤在脑组织中提取总RNA，由紫外分光光度计检测总RNA的含量，经RT-PCR两步法试剂盒(北京中山生物技术公司产品)把mRNA反转录为cDNA，之后再将cDNA行PCR扩增。所用引物见下列表。取扩增产物行电泳实验，电泳结果由凝胶图像分析仪系统来进行吸光度的分析，计出算AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2与GAPDH的吸光度积分的比值，作为AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA指标的表达。

引物序列：
引物	序列	产物长度(bp)
AQP9	上游5’-CCA GCT CCA TTC ATA TCC AC-3’ 下游5’-CTA ATG ACA ACA GGC TCC AG-3’	137
AQP4	上游5’-CCA GCT GTG ATT CCA AAA CGG AC-3’ 下游5’-TCT AGT CAT ACT GAA GAC AAT ACC TC-3’	305
基质金属蛋白酶9	上游5’-GGT TTC TGT CCA GAC CAA GG-3’ 下游5’-TGC AAG GAT TGT CAT CTG G A-3’	379
基质金属蛋白酶2	上游5’-TTT TTG TGC CCA AAG AAA GG-3’ 下游5’-ATG TCA GAC AAC CCG AGT CC-3’	414
GAPDH	上游5’-GAG GAC CAG GTT GTC TCC TG-3’ 下游5’-GGA TGG AAT TGT GAG GGA GA -3’	300

1.5.3 Western Blot检测造模后72 h，RT-PCR提取后将剩余物以1 500 r/min的离心速度，将其离心30 min后，上清为粗体蛋白，经Bradford法测定总蛋白的浓度。以5%的浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，再经37 ℃摇床行2 h封闭，将其洗膜10 min，共洗膜3次，将AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2多克隆抗体以1∶500的浓度稀释溶于TBST中，然后于室温下孵育60 min；TBST经3次，10 min的洗膜后加入1︰2 000稀释的兔抗鼠抗体中(碱性磷酸酶标记)。在室温孵育 60 min后；TBST再经3次，10 min的洗膜，然后用TBS洗膜10 min DAB显色，Quantity one图像分析，AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2蛋白表达的指标(以AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2产物与GAPDH产物条带吸光面积的比值来表示)。

1.5.4 免疫组织化学和苏木精-伊红染色各组在伤后2周随机各取5只大鼠麻醉处死，取材行梗死处组织学检查以证实恢复程度。沿冠状位将大鼠脑切成3 mm厚的组织块，用0.1 mol/L PBS洗3次，快速脱水，低温石蜡包埋。取有大体病变的组织块从额侧开始切取冠状组织片，切片厚度 6 μm。每个组织片每隔200 μm连续取3张，分别做常规苏木精-伊红染色、胶质纤维酸性蛋白蛋白免疫组织化学及阴性对照染色。每个组织块取5组。每张切片在高倍镜(×200)下，于每张切片梗死灶边缘区取相互不重叠的5个视野，计数其中的胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，每组大鼠所有切片阳性细胞数的(x(_)±s)作为该组动物梗死灶边缘区胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学阳性细胞值(以阳性细胞数/10×40视野表示)。

1.6 模型大鼠神经功能评分手术结束麻醉苏醒后2，24，48，72 h，观察其行为和肢体瘫痪情况，神经病学评分按照Longa的5分法进行(0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识丧失)，分数越高，神经功能障碍越严重。

1.7 主要观察指标 ①观察脑梗死区周围AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2基因转录和蛋白的表达。②观察脑梗死区病理组织形态学变化。③观察胶质纤维酸性蛋白的表达量。④观察Longa行为学评分及神经功能的损伤情况。

1.8 统计学分析采用 SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料采用x(_)±s表示，多组间比较采取单因素方差分析及q 检验，以P < 0.05为差异有显着性意义。

讨论

3.1 脑梗死模型的建立脑梗死模型的制作方法有光化学法、开颅法、线栓法和栓塞法等。但是光化学法需要特殊的设备，且再灌注困难；开颅法由于需开颅，要求的手术技术较高，且具有较高的并发症及死亡率；栓塞法虽然可以较好的模拟人脑梗死发病机制，却受栓塞部位不恒定、血栓易自溶等很多因素的干扰。而线栓法建立脑梗死模型具有损伤小、不需开颅、疗效肯定、还能控制缺血和再灌注时间的优势，现已成为研究者们热衷采用的方法。而建立操作简便、稳定可靠且重复性好的脑梗死模型是探讨脑梗死的发病机制、演变过程及预防治疗的重要手段，而选择理想的实验动物及手术制作方法是模型成功的关键。

脑梗死模型建模成功的标志是，在建模后有明显的神经症状改变，如Homer征、向对侧倾倒、对侧前肢的瘫痪、认知障碍等，且损伤侧脑均出现明显的脑梗死灶。近些年来关于大鼠脑梗死模型的制造国内外已有许多报道，由于大鼠脑血管解剖特点及大鼠动脉环的组成和人类更接近，且具有较强的生命力及抗感染力，所以研究者们将其作为理想的建模动物。

3.2 高压氧治疗脑梗死高压氧是一种常用的临床治疗手段，在缺血性脑损伤、脊髓损伤方面的应用较为广泛^[12]。目前国内外研究发现，高压氧对治疗大鼠脑梗死有疗效，且这种疗效具有明显的时间窗，即在脑梗死损伤后6 h内效果最为明显^[13-15]。高压氧治疗大鼠脑梗死的机制有多种：①改善脑缺氧，维持脑细胞能量代谢，清除氧自由基以及保护梗死周围缺血半暗带组织，提供ATP。②降低脑血管通透性和脑血流量，减轻脑水肿。③有研究认为高压氧作用下，凝血系统受到抑制而抗凝血系统则被激活，血浆形成血栓活动减弱。同时非饱和类脂质过氧化和红细胞脆性增加，有利于溶血过程，促进了血栓溶解^[16-18]。④高压氧可使血液中氧含量增加，改善血液流变学，促进神经元功能恢复^[19-21]。这些机制可以促进脑梗死的治疗，同时也可改善脑梗死的预后。本研究以线栓法成功制作MCAO模型，造模后4 h开始给予高压氧治疗，发现造模后3 d高压氧组细胞凋亡指数均明显低于脑梗死组，表明早期给予高压氧治疗能够改善大脑中动脉闭塞大鼠神经功能^[22-24]。有关研究发现，胶质纤维酸性蛋白表达与星形胶质细胞活性呈正相关，星形胶质细胞在脑损伤修复过程中起着重要作用^[25-27]，在低氧脑损伤时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量增多^[28-30]。本实验结果表明应用高压氧可促进梗死灶周围活性细胞增生，从而起到保护梗死后脑组织的作用。另有研究发现，脑梗死后基质金属蛋白酶9表达的增加与脑梗死面积有密切关联^[31-33]，选择性基质金属蛋白酶9抑制剂可使大鼠脑梗死灶体积减小30%，证明抑制基质金属蛋白酶的活性有可能成为治疗缺血性脑血管病的途径^[34-36]。本实验在造模后72 h，高压氧组与脑梗死组相比AQP4/9、基质金属蛋白酶9/2基因和蛋白的表达均有显著降低，说明脑梗死造模后行高压氧治疗，对梗死区神经组织水肿相关基因和蛋白的表达能够得到有效的减轻，基质金属蛋白酶9/2，AQP4/9基因及蛋白表达的下降可以减轻脑水肿程度，同时还可有效的减轻损伤区神经细胞的凋亡。综上所述，实验性大鼠脑梗死后行高压氧干预，能够显著减轻脑水肿，提高脑梗死后大鼠的神经功能评分，改善其预后。高压氧具有改善大鼠脑梗死区微环境的作用^[37-39]，其可能通过以下途径：①脑梗死后局部组织可出现水肿、缺氧状况，而高压氧可以显著提高脑梗死区的氧浓度，增大氧弥散距离，减低因缺氧所致神经细胞的凋亡。②高压氧可使基质金属蛋白酶9/2，AQP4/9基因及蛋白的表达下调，明显降低脑梗死区的水肿程度。③高压氧还能纠正梗死区组织的酸中毒，改善脑梗死部位的微循环，保持损伤区脑神经细胞的能量代谢，且能恢复可逆性损伤的神经元功能。总之，全面了解高压氧干预对大鼠脑梗死修复及其基因调节的作用，将为临床康复治疗中高压氧干预的应用提供有利的理论依据。但仍有很多问题有待进一步研究。
杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；中国组织工程研究组织工程