骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨方向的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5916-5922.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.003

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骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨方向的分化

杨宇明¹，袁峰²，陆海涛¹，张峻伟¹，盛晓磊¹，李智多¹

1徐州医学院研究生学院，江苏省徐州市 221000； 2徐州医学院附属医院，江苏省徐州市 221000

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 袁峰，博士，主任医师，硕士生导师，徐州医学院附属医院，江苏省徐州市 221000
作者简介:杨宇明，男，1987年生，江苏省徐州市人，汉族，徐州医学院骨科在读硕士，主要从事脊柱外科与骨组织工程的研究。
基金资助:
江苏省卫生厅课题(H201129)

Osteogenic differentiation of nucleus puplousus cells co-cultured with autologous periosteal cells

Yang Yu-ming¹, Yuan Feng², Lu Hai-tao¹, Zhang Jun-wei¹, Sheng Xiao-lei¹, Li Zhi-duo¹

1School of Graduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 2Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Yuan Feng, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
About author:Yang Yu-ming, Studying for master’s degree, School of Graduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Project of Jiangsu Health Department, No. H201129

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨膜细胞已被应用于骨缺损及修复，但其可否在成骨诱导环境中与髓核细胞共培养向成骨分化，并应用于椎间隙骨性融合的相关研究报道较少。

目的：分离培养髓核细胞与骨膜细胞，观察特定环境下髓核细胞的成骨潜能，以及加入骨膜细胞与其共培养后的成骨能力。

方法：Ⅱ型胶原酶消化离心贴壁法分离兔髓核细胞；组织贴壁培养法分离兔骨膜细胞。采用细胞表面抗原CD90、CD105免疫荧光染色法鉴定骨膜细胞，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞。实验分为两组：成骨诱导环境单独培养的髓核细胞为对照组，加入骨膜细胞与髓核细胞共培养为实验组。CCK8法检测细胞增殖，分别行碱性磷酸酶、茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色进行成骨鉴定，Western blot检测两组细胞成骨诱导后骨桥蛋白的表达。

结果与结论：骨膜细胞表面抗原CD90、CD105呈阳性，髓核细胞甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性；1，3，5，7，9 d各时间点实验组髓核细胞增殖活性显著高于对照组；诱导2周后2组细胞碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均为阳性，但实验组阳性表达高于对照组(P < 0.05)；实验组骨桥蛋白表达强于对照组。髓核细胞具有成骨分化的潜能，但体外的增殖能力较低，加入骨膜细胞后，共培养细胞增殖分化能力提高。成骨诱导下骨膜细胞与髓核细胞共培养具有良好相容性，细胞相互黏附，并具有强于单独诱导髓核细胞的成骨能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨细胞, 髓核细胞, 骨膜细胞, 共培养, 成骨分化, 增殖, 分化, 黏附, 骨形态发生蛋白7, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Periosteal cells have been used in bone repair, but whether nucleus puplousus cells co-cultured with autologous periosteal cells can differentiate into osteoblasts in spinal fusion is rarely reported.

OBJECTIVE: To isolate nucleus puplousus cells and periosteal cells so as to observe the osteogenic ability of nucleus puplousus cells co-cultured with periosteal cells or not.

METHODS: Type II collagenase digestion method was used to isolate and purify nucleus pulposus cells, which were confirmed by toluidine blue and immunohistochemical staining. Periosteal cells were isolated histologically
and cultured in complete medium, and cell surface antigens CD90, CD105 were identified by immunofluorescence staining. According to the experimental needs, the cells were assigned into two groups. Nucleus pulposus cells and periosteal cells were co-cultured by osteogenic induction medium in the experimental group. Nucleus pulposus cells in the control group were cultured alone in osteogenic induction medium. Cell morphology was observed by inverted microscopy, and cell proliferation was detected by cell counting kit-8. The osteogenic differentiation indexes of cells in each group were measured using alkaline phosphatase staining, alizarin red staining, and type I collagen immunohistoehemical staining. The expression of osteopontin was tested by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: CD105 and CD90 expressions of the periosteal cells were positive. Nucleus puplousus cells were positive for toluidine blue and collagen type II immunohistochemical staining. The proliferative ability of nucleus puplousus cells was significantly higher in the experimental group than the control group at days 1, 3, 5, 7, 9. After 2 weeks of induction, the cells were positive for alkaline phosphatase staining, alizarin red staining, and type I collagen immunohistoehemical staining, but the experimental group showed higher positive expressions than the control group (P < 0.05). The expression of osteopontin was also higher in the experimental group than the control group. These findings indicate that nucleus puplousus cells possess osteogenic ability, but have lower proliferative ability in vitro. After co-culture with periosteal cells, the proliferative ability of nucleus puplousus cells can be increased. Under osteogenic induction, nucleus puplousus cells co-cultured with periosteal cells have good compatibility and adhere with each other, which have stronger osteogenic ability than cells cultured alone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Periosteum, Osteoblasts, Bone Morphogenetic Protein 7

中图分类号:

R318

杨宇明，袁峰，陆海涛，张峻伟，盛晓磊，李智多. 骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨方向的分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5916-5922.

Yang Yu-ming, Yuan Feng, Lu Hai-tao, Zhang Jun-wei, Sheng Xiao-lei, Li Zhi-duo. Osteogenic differentiation of nucleus puplousus cells co-cultured with autologous periosteal cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5916-5922.

图/表（结果） 6

2.1 髓核细胞与骨膜细胞形态学观察原代髓核细胞5 d左右开始贴壁，刚贴壁后细胞呈圆形、短梭形、多边形、胞质向外突出，11 d左右80%细胞融合成团，形状呈火焰状、漩涡状分布；经传代后，第1代细胞贴壁时间明显缩短，为36 h左右，细胞形态上没有太大变化；第2代细胞形态与原代相似，有明显的伪足，有的细胞出现细长或者树根样足突，大部分成短梭；第3代细胞与2代类似并能长期稳定生长(图1)。原代骨膜细胞培养48 h后完全贴壁，早期呈梭形，4 d左右细胞排列紧密，呈典型的长梭形、平行或漩涡排列，集落间出现重叠；14 d时原代细胞融合约90%，进行纯化并传代扩增。第1代细胞约24 h贴壁，呈均匀一致的长梭形。第2代细胞增殖旺盛，5-7 d即可完全融合，且细胞形态较为均一。第3代细胞生长稳定，细胞形态仍呈长梭形，呈漩涡状平行生长(图2)。

P3髓核细胞与骨膜细胞共培养为梭形、多角形、不规则形，细胞相互黏附，相容性良好(图3)。 2.2 髓核细胞与骨膜细胞的鉴定髓核细胞甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均阳性(图4)，骨膜细胞CD90、CD105阳性(图5)。

2.3 CCK-8检测成骨诱导后两组细胞的增殖活性 CCK8法检测结果如表所示，两组细胞A值随着时间延长均升高，在各时间点的差异有显著性意义(P < 0. 05)，同时两组细胞在不同诱导时间的变化趋势有显著性意义(P < 0.05)，表明髓核细胞与骨膜细胞相容性良好，诱导后的共培养细胞增殖分化能力高于髓核细胞。同时以6孔A值的均值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线(图6)，见表1。

2.4 两组细胞成骨分化的鉴定诱导2周后，碱性磷酸酶、茜素红、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均阳性，但实验组钙结节较对照组大，胞浆及胞质被染成棕黄色，实验组细胞核周围棕黄色颗粒明显增多(图7-9)。

2.5 两组细胞碱性磷酸酶活性检测在1，2，3周3个时间点，实验组碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有显著意义(P < 0.05)，见表2。 2.6 Western Blot检测细胞诱导后骨桥蛋白的表达检测14 d时两组细胞蛋白，均检测到骨桥蛋白的表达，使用ImageJ分析灰度值，实验组水平高于对照组，两组之间差异有显著性意义(P < 0.05)(图10)。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察、细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2013年3月至2014年1月在徐州医学院附属医院中心实验室完成。

1.3 材料健康新西兰大耳白兔2只，普通级，雄性，体质量2.0-3.0 kg，约3月龄，由徐州医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(苏)2005-0005。

骨膜细胞与髓核细胞共培养实验用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、青/链霉素、 CCK8细胞增殖及毒性检测试剂盒	碧云天生物技术研究所
胎牛血清、DMEM/F-12培养基	美国Thermo公司
地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C	美国 Sigma公司
BMP7	美国PeproTech公司
茜素红	合肥博美生物科技公司
OPN一抗、Rabbit Anti-Collagen Ⅱ antibody、Rabbit Anti-Collagen Ⅰ antibody、抗兔CD90和CD105抗体	北京博奥森生物技术有限公司
b-actin一抗	美国Santa Cruz Biotechnology公司
超敏兔两步法检测试剂盒	北京中杉金桥生物技术有限公司
碱性磷酸酶检测试剂盒	南京建成生物工程研究所
YMT-Z型倒置显微镜	日本Olympus公司
免疫荧光显微镜	日本Nikon公司
Western Blot电泳仪	美国Bio-Rad公司
HTS 700型酶联免疫检测仪	日本东芝公司

1.4 实验方法

1.4.1 髓核细胞分离与培养取3月龄新西兰大耳白兔，耳缘静脉注射麻醉后，无菌从后背正中线切开皮肤，分离、剥开椎旁肌肉，暴露脊柱，用咬骨钳截取部分脊柱，仔细剥离椎体周围所附着的肌肉及软组织，尖刀轻轻切开椎间盘纤维环，显露出髓核组织，用眼科剪夹取胶冻样髓核组无菌条件下尽可能去除残留组织后用PBS清洗3-5次去除红细胞。眼科剪将组织剪成1 mm ×1 mm ×1 mm左右的组织块，加入五六倍体积0.25 g/LⅡ型胶原酶，37 ℃水浴摇床上(80 r/min)消化1 min后加入等体积含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基终止消化，1 200 r/min离心5 min弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，将细胞收集调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1接种至含基础培养基的25 cm²培养瓶中。置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。5 d后第1次换液体，2 d换液1次，并于每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待细胞生长融合达80%-90%后，进行传代。

1.4.2 兔骨膜细胞的分离及培养取完髓核组织后，无菌条件下，分离、剥开肌肉及周围组织，暴露胫骨，咬骨钳截断整段胫骨，仔细剥离附着的软组织，无菌条件下，切取胫骨上段内侧面骨膜，PBS冲洗3-5次，用眼科剪将骨膜剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，均匀接种至含基础培养基的25 cm²培养瓶中。置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。48 h后开始贴壁， 2 d换液1次，并于每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，第2次换液时倒掉组织块。待细胞生长融合达80%-90%后，进行传代。

1.4.3 髓核细胞的鉴定

甲苯胺蓝染色：取第3代细胞以1×10⁹L^-1细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔板，每孔加入1.5 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱培养至细胞达80%-90%融合。用预温的PBS洗3次，5 min/次；40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，5 min/次；0.2%Triton X-100透化2-5 min；PBS洗3次，5 min/次；每孔加入硼砂甲苯胺蓝染液，覆盖整个细胞生长表面，室温孵育20 min并轻微振荡，小心吸去未结合的染料，PBS轻轻冲洗2遍，吸去PBS液，即刻于倒置相差显微镜下观察并拍照。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：同法备好髓核细胞，体积分数3%H₂O₂溶液室温覆盖5 min，消除内源性过氧化物酶活性，去掉3%H₂O₂溶液，PBS冲洗3次，2 min/次；PBS冲洗，2 min×3次；滴加一抗稀释液(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂1(Polymer Helper)，室温或37 ℃孵育10-20 min，PBS或TBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂2(poly-HRP anti-Rabbit IgG)，室温或37 ℃孵育10-20 min，PBS或TBS冲洗，2 min×3次；应用DAB溶液显色，于显微镜下观察细胞浆内情况，约 10 min。蒸馏水淋洗终止显色反应；于倒置相差显微镜下观察、拍照。

1.4.4 骨膜细胞的鉴定骨膜细胞表面标记物检测：取第3代细胞以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔板，每孔加入1.5 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱培养至细胞达80%-90%融合。用预温的PBS洗3次，5 min/次；40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，5 min/次；0.2%Triton X-100透化2-5 min；PBS洗3次，5 min/次；体积分数5%山羊封闭血清并室温孵育30 min，弃封闭液；加入鼠抗兔CD44、CD45抗体反应液，4 ℃孵育过夜；弃一抗，PBS洗3次，5 min/次；加入FITC荧光素标记的二抗 37 ℃避光孵育30 min；PBS洗3次，5 min/次；95%甘油封固，荧光显微镜下观察染色情况。

1.4.5 建立体外兔骨膜细胞与髓核细胞共培养体系并成骨诱导配制成骨诱导培养基含骨形态发生蛋白7、地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C，浓度分别为40 μg/L、 10^-7 mol/L、10^-2 mol/L和50 mg /L。将第3代的髓核细胞以1×10⁵ /孔的密度接种于6孔板中(此为对照组)，实验组在此基础上加入第3代骨膜细胞，两种细胞数比例为1∶1，24 h待细胞贴壁后，按照分组情况分别加入成骨诱导培养基 2 mL，将细胞培养板置于37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱中，每3 d换液。

1.4.6 CCK8法检测成骨诱导后共培养组细胞和髓核细胞的增殖活性分别于培养1，3，5，7，9 d后取出各组细胞，每组6孔，离心收集细胞至96孔板，每孔加入100 µL DMEM/F-12(含体积分数10%胎牛血清和双抗)培养液及10 µL CCK8溶液，37 ℃孵育4 h。选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值(A)，以6孔A值的均值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

1.4.7 碱性磷酸酶活性检测分别于诱导1，2，3周时取出各组细胞，每组3孔，离心收集细胞至96孔板，并按照碱性磷酸酶测试试剂盒说明书操作，浓度以金氏单位/L表示。

1.4.8 Western Blot检测细胞骨桥蛋白的表达成骨诱导14 d时终止培养，用含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解液 (50 mmol/L Tris，pH 7.4，0.5% NP-40 and 0.01%SDS)裂解细胞，4 ℃离心收集上清；取上清(20 µg蛋白)进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后转膜并用5%脱脂奶粉封闭 1 h；加相应一抗4 ℃过夜；PBST(0.1%Tween 20)洗膜4次(5 min/次)；加入相应二抗室温孵育1 h，PBST洗膜4次(5 min/次)；曝光显影。

1.5 主要观察指标 ①髓核细胞与骨膜细胞形态观察。②诱导后髓核细胞组与共培养细胞组增殖曲线。③应用免疫荧光测定CD90、CD105表达鉴定骨膜细胞，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定髓核细胞。④Ⅱ型胶原免疫组织化学、碱性磷酸酶及茜素红染色检测诱导成骨分化。⑤Western Blot检测骨桥蛋白的表达。

1.6 统计学分析由第一作者应用SPSS 19.0统计软件包进行分析，数据以x(_)±s表示，采用配对样本t 检验、单因素、重复测量数据方差分析，P< 0.05为差异有显著性意义。织。

讨论

椎间盘作为脊柱重要连接单位，如果能使之骨化，则有望达到脊柱融合的目的。纤维环细胞具有成骨潜能，表现为成纤维细胞经过诱导转化为成骨细胞，并表达成骨细胞标志物骨桥蛋白^[6-8]。人体的椎间盘边缘有大量的成纤维细胞，但是在腰椎不稳的情况下，如果单纯的把椎间盘边缘的成纤维细胞诱导成骨不足以使腰椎稳定。组织工程中对脊柱融合的相关研究包括：干细胞复合生物支架促进横突间融合或剥离椎间盘组织促进椎间隙融合、以及向椎间盘内注射成骨诱导因子等，但均存在椎间盘细胞来源受限，需造成较大创伤等不足之处。由此，找到使椎间盘内髓核原位骨化的方法成为了本实验的目的。骨膜细胞具有较强的自我更新能力和分化潜能，其本身是成骨细胞的前体细胞，大量的骨膜细胞位于骨膜生发层，在特定的诱导条件下，具有向成骨细胞分化的功能^[9-10]。与干细胞相比：骨膜细胞的增殖能力高于骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞^[11]；通常从骨髓中分离应用于骨组织工程中，而骨膜在本质上与骨的形成和修复密切相关，因此，相较于骨髓间充质干细胞，骨膜细胞可能具有更强的相关性^[12-13]。酶原组织消化培养法分离髓核细胞是基于髓核组织细胞外基质富含大量的Ⅱ型胶原，对剪碎的的髓核组织单纯酶原消化可直接获取单个髓核细胞。组织块分离骨膜细胞的原理是基质层的细胞从组织块游出后贴附伸展。Choi 等^[14]利用流式技术对骨膜细胞进行分离和纯化，并行表面抗原分析研究，发现其中CD90和CD105是骨膜细胞重要表面抗原，骨膜细胞传至15代仍能稳定表达。髓核细胞含有丰富的蛋白多糖和Ⅱ型胶原，通常软骨细胞没有特定的表型标记，但其细胞外基质与软骨细胞类似，这一特征使研究认为类软骨细胞是髓核细胞的本质，Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖是判断类软骨细胞的重要标志^[15-17]。实验中CD90、CD105免疫荧光为阳性；甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性，说明细胞为骨膜细胞及髓核细胞。 Muschik等^[18]将骨形态发生蛋白2直接注射到兔的椎间盘中，12周后观察到了明显的成骨。贝抗胜等^[19-21]对骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞向成骨分化进行了大量深入的研究，发现骨形态发生蛋白7在体外培养中具有增强骨膜细胞分化为成骨细胞的作用，经骨形态发生蛋白7诱导的骨膜细胞具有典型的成骨细胞的功能，并能明显表达成骨细胞的特定基因和分泌特殊的成骨蛋白^[22]。骨形态发生蛋白7诱导细胞向成骨分化的研究越发成熟，通过观察细胞学形态以及检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、钙结节和骨桥蛋白可以作为骨形态发生蛋白7诱导细胞分化为成骨细胞的鉴定及其成骨作用和发挥代谢调节作用的评价标准^[21]。实验中，诱导2周后的两组细胞，碱性磷酸酶、茜素红、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均阳性，表明分化为成骨细胞；共培养细胞的成骨检测阳性表达高于单独诱导的髓核细胞，表明加入骨膜细胞后共培养细胞成骨能力较强，可以弥补髓核细胞增殖分化能力不足。骨形态发生蛋白7至发现至今对其研究已较为成熟，并已被用于临床。综上所述，骨形态发生蛋白7诱导下的骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨分化为椎间隙融合提供了新的思路。本实验的研究目的，并非为了替代自体骨移植。临床病例中，脊柱不稳导致颈、腰痛的患者数量较多，然而，其临床表现及相关影像学检查，这类患者又暂无手术指征，如不加以注意，过度劳累，会引发一系列相关疾病，并需手术。应遏制这类患者的脊柱间不稳，提早干预椎间隙骨化，使其稳定，避免常规脊柱外科手术。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨方向的分化

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