人成骨细胞分化及骨保护素分泌：R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5923-5927.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.004

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人成骨细胞分化及骨保护素分泌：R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

吴思敏，刘庆梅，马彦云，王久存，赵东宝

解放军第二军医大学附属长海医院风湿免疫科，上海市 200433

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 赵东宝，博士，教授，主任医师，解放军第二军医大学附属长海医院风湿免疫科，上海市 200433
作者简介:吴思敏，女，1987年生，江苏省南京市人，汉族，2015年解放军第二军医大学毕业，硕士，医师，主要从事成骨细胞及类风湿关节炎相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81273284)

Differentiation and osteoprotegerin secretion of human osteoblasts: R-spondin 1 effect via Wnt/beta-catenin signal pathway

Wu Si-min, Liu Qing-mei, Ma Yan-yun, Wang Jiu-cun, Zhao Dong-bao

Department of Rheumatology and Immunology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Zhao Dong-bao, M.D., Professor, Chief physician, Department of Rheumatology and Immunology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
About author:Wu Si-min, Master, Physician, Department of Rheumatology and Immunology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81273284

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明Wnt/β-catenin信号通路活性受抑是类风湿关节炎骨侵蚀的始动因素，增强该通路有望治疗类风湿关节炎关节破坏。R-脊椎蛋白1(RSpo1)可能是Wnt激活剂，尚无人成骨细胞相关研究。
目的：验证R-脊椎蛋白1抑制DKK1促进该细胞的分化成熟。
方法：给予S40转染人成骨细胞株hFOB 1.19 Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及Wnt信号通路抑制剂DKK1不同刺激，通过检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨保护素水平，观察R-脊椎蛋白1在成骨细胞中的作用。
结果与结论：R-脊椎蛋白1对hFOB 1.19细胞增殖无影响，Wnt-3a上调碱性磷酸酶活性，与R-脊椎蛋白1共刺激可增强该作用；R-脊椎蛋白1可减少DKK1对hFOB1.19细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用。R-脊椎蛋白1可提高骨保护素质量浓度，但R-脊椎蛋白1对骨保护素的增强作用大于DKK1对其的抑制作用。提示R-脊椎蛋白1通过抑制DKK1，参与Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞分化成熟，分泌骨保护素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨细胞, 骨保护素, R-脊椎蛋白1, Wnt, DKK1, hFOB1.19, 成骨细胞, 破骨细胞, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have funded that reduced Wnt/β-catenin signaling is involved in the onset and/or progression of bone erosion in rheumatoid arthritis. It can lead to potential new treatment approaches of bone erosion by enhancing Wnt/β-catenin signaling pathway. R-spondin 1 may act as a Wnt agonist, but there is no study in human osteoblasts.

OBJECTIVE: To verify the effect of R-spondin 1 on promoting differentiation and maturation of human osteoblasts by inhibiting DKK1.

METHODS: S40-transfected human osteoblast lines, hFOB1.19, were treated with R-spondin 1, Wnt-3a and DKK1 to detecting the proliferation, alkaline phoshpatase activity and osteoprotegerin concentration.

RESULTS AND CONCLUSION: R-spondin 1 had no effects on hFOB1.19 cells. Wnt-3a upregulated the activity of alkaline phoshpatase, which could be enhanced by addition of R-spondin 1. R-spondin 1 could reduce the DKK1-mediated inhibition of alkaline phoshpatase activity in hFOB1.19 cells. R-spondin 1 increased the concentration of osteoprotegerin, and moreover, the promotion of osteoprotegerin by R-spondin 1 alone was stronger than the inhibition by DKK1. These findings suggest that R-spondin 1 can inhibit DKK1 by Wnt/β-catenin signal pathway to promote the differential and maturation of human osteoblasts to excrete osteoprotegerin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoprotegerin, Osteoblasts, Osteoclasts

中图分类号:

R318

吴思敏，刘庆梅，马彦云，王久存，赵东宝. 人成骨细胞分化及骨保护素分泌：R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5923-5927.

Wu Si-min, Liu Qing-mei, Ma Yan-yun, Wang Jiu-cun, Zhao Dong-bao. Differentiation and osteoprotegerin secretion of human osteoblasts: R-spondin 1 effect via Wnt/beta-catenin signal pathway [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5923-5927.

图/表（结果） 4

2.1 hFOB1.19培养及观察 S40转染人hFOB 1.19成骨细胞呈多形态细胞样，贴壁生长。在33.5 ℃环境内细胞分裂较快。细胞形态如图1。

2.2 Wnt-3a、R-脊椎蛋白1不影响hFOB 1.19细胞增殖为了研究R-脊椎蛋白1是否影响hFOB1.19细胞的增殖，使用RTCA微电子阻抗技术，利用细胞指数监测动态细胞数目的变化，在RTCA中，其细胞数目越多，阻抗越大，细胞指数值则越大^[11]。在给予相应刺激后，并未发现Wnt-3a、R-脊椎蛋白1对hFOB 1.19细胞数量产生影响(图2)。从hFOB1.19细胞的细胞指数曲线图中可以发现，50 μg/L的Wnt-3a组对该细胞的增殖影响不明显；在Wnt-3a与R-脊椎蛋白1共刺激组中，hFOB 1.19细胞数量与空白对照组及单独Wnt-3a组均未见明显的细胞增殖。添加DKK1的刺激组与其他刺激组相比，也未见hFOB 1.19细胞生长的下降趋势。因此，根据该细胞指数曲线图可以发现，Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及DKK1均未对hFOB 1.19细胞增殖功能产生影响。因此，R-脊椎蛋白1并非通过刺激成骨细胞增殖而调控该细胞的分化和功能。 2.3 R-脊椎蛋白1在hFOB 1.19中对碱性磷酸酶活性的影响 2.3.1 单独Wnt-3a上调碱性磷酸酶活性，R-脊椎蛋白1对其无影响碱性磷酸酶是一种普遍存在的细胞内酶。体内50%的碱性磷酸酶均是由成骨细胞分泌，该指标常用于监测成骨细胞分化能力，在骨代谢异常和骨病的研究中被广泛应用^[12]。为确定R-脊椎蛋白1对成骨细胞分化能力的影响，实验对hFOB 1.19细胞进行相应刺激后，检测细胞内碱性磷酸酶活性。根据所得结果处理数据后发现，Wnt-3a显著上调hFOB 1.19细胞碱性磷酸酶活性(P < 0.05)。与空白组相比较，碱性磷酸酶活性约提高约98%。单独R-脊椎蛋白1刺激时，未见碱性磷酸酶活性升高。在Wnt-3a与R-脊椎蛋白1共刺激时，hFOB1.19细胞上清液中碱性磷酸酶活性达到最高，较空白组升高108%(P < 0.001)，但与Wnt-3a单刺激相较，碱性磷酸酶活性提高不明显(图3)。因此，该结果说明R-脊椎蛋白1与Wnt-3a共刺激时仅存在上调碱性磷酸酶活性的作用，两者联合使用对hFOB 1.19细胞分化能力影响不显著。 2.3.2 R-脊椎蛋白1可以减弱Dkk-1对hFOB1.19细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用为了验证R-脊椎蛋白1与DKK1对hFOB1.19细胞分化功能的影响，给予该细胞Wnt-3a与Dkk1共刺激，可观察到碱性磷酸酶活性明显下降，较单独Wnt-3a刺激时，其活性下降约65%(P < 0.001)。当再加入的R-脊椎蛋白1时，与Wnt-3a、DKK1共刺激组相较，碱性磷酸酶浓度较前提高约82%(P < 0.002)(图4)。该结果表明，R-脊椎蛋白1可以减弱DKK1对成骨细胞碱性磷酸酶活力的抑制作用。即表明R-脊椎蛋白1可逆转DKK1对成骨细胞分化能力的抑制作用。

2.4 R-脊椎蛋白1对骨保护素分泌的影响 2.4.1 R-脊椎蛋白1明显促进骨保护素的分泌，但与Wnt-3a无协同作用因为成骨细胞被认为是核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)的受体，成骨细胞来源的骨保护素被认为是抑制破骨细胞形成的主要因子。为了检测R-脊椎蛋白1诱导下对骨保护素分泌的影响，实验检测了不同刺激下hFOB1.19细胞上清中骨保护素水平。在单独给予Wnt-3a刺激时，该细胞的骨保护素质量浓度较对照组升高约53%(P < 0.005)。在单独给予R-脊椎蛋白1刺激时，骨保护素质量浓度达到最高，与空白组相较约升高73%(P < 0.005)。然而，当Wnt-3a与R-脊椎蛋白1共刺激时，骨保护素质量浓度较对照组升高仅21%(P < 0.01)。此结果说明Wnt-3a及R-脊椎蛋白1均存在促进成骨细胞分泌骨保护素的功能，但两者间并不存在协同作用(图5)。

2.4.2 R-脊椎蛋白1对骨保护素的增强作用大于DKK1对其的抑制作用为了明确R-脊椎蛋白1与DKK1影响骨保护素时的关系，予以刺激中添加DKK1。与碱性磷酸酶活力检测结果相一致的是，Wnt-3a与DKK1共刺激时，骨保护素质量浓度也出现明显下降，其水平与空白对照组持平，与单独Wnt-3a刺激组相比下降约34%(P < 0.05)。而予以添加R-脊椎蛋白1时，其骨保护素质量浓度也再次升高(P < 0.05)。但是，如前所提及的结果：单独R-脊椎蛋白1明显上调了骨保护素水平。在该结果中，无法判断Wnt-3a、R-脊椎蛋白1及DKK1联合刺激时所引起的骨保护素质量浓度升高，是由于R-脊椎蛋白1自身上调骨保护素的作用，还是由于R-脊椎蛋白1逆转DKK1抑制作用的结果(图6)。

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引言

类风湿关节炎是典型的肿瘤坏死因子α诱导型自身免疫性病，其主要病理基础为关节滑膜慢性炎症、软骨降解和骨质侵蚀，从而促使关节结构破坏，导致残废。已有研究表明经典的Wnt/β-catenin信号通路参与骨代谢平衡，该通路在进化过程中高度保守，通过Wnt配体与胞膜上的Frizzled和LRP5/6共受体结合后稳定胞质内β-catenin，并通过β-catenin入核，结合Tcf/Lef转录因子来调节靶基因的表达水平，影响成骨细胞(osteoblast，OB)发育、分化和凋亡，从而对骨量进行调节。所以，Wnt/β-catenin信号通路在类风湿关节炎关节侵蚀起到重要而关键作用^[1]。 Dkk1是Dickkopf家族成员，是一种Wnt信号通路抑制剂^[2]，可以特异地与LRP5/6结合，从而干扰LRP5/6与Frizzled复合物结合，抑制下游信号传导，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路^[3]。体内肿瘤坏死因子α升高可上调DKK1的表达，从而直接抑制成骨细胞分化和成熟^[4]。因此，DKK1成为联接免疫系统和骨形成的关键桥梁。新近发现，R-脊椎蛋白(R-Spondin，RSpo)蛋白家族成员R-脊椎蛋白1可以激活Wnt/β-catenin信号通路，并在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用^[5]。Kim等^[6]提出R-脊椎蛋白1在功能上具有拮抗Dkk1活性，而可能具有激活Wnt信号通路作用。此外，RSpo家族蛋白是一种崭新的Wnt信号配体，与其他已知Wnt配体明显不同，RSpo蛋白活性依赖Wnt内源性配体如Wnt3A协同作用^[7-9]，但有关RSpo调控Wnt/β-catenin的机制并不十分清楚。因此，推测R-脊椎蛋白1可能通过抑制DKK1，从而参与Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞分泌骨保护素(osteoprotegerin，OPG)抑制破骨细胞(osteoclast，OC)的功能，进而抑制骨丢失，使得骨平衡向着骨形成方向发展，抑制关节侵蚀的发生。但是，目前相关研究尚局限于小鼠成骨细胞，为了进一步阐述R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin在人关节侵蚀中的作用，本研究中使用S40转染的人成骨细胞株hFOB1.19，通过观察R-脊椎蛋白1是否影响人成骨细胞的增殖，观察成骨细胞分化指标——碱性磷酸酶活性，并检测其对成骨细胞所分泌的骨保护素浓度的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2014年3月至2015年4月于复旦大学人类学教育部重点实验室完成。

R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin信号通路对人成骨细胞增殖、分化及骨保护素分泌实验所用细胞及试剂：
细胞及试剂	来源
实验用hFOB1.19人SV40转染成骨细胞	中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库
D-MEM/F-12培养基、体积分数10%优质胎牛血清	GIBCO
Recombinant Human R-Spondin 1	Sino Biological Inc.
Recombinant Human Wnt-3a、人骨保护素 Elisa试剂盒	R&D systems
Recombinant Human Dkk-1	Millipore
碱性磷酸酶检测试剂盒	南京建成生物工程研究所

细胞培养：实验用hFOB 1.19人SV40转染成骨细胞，该细胞培养基为D-MEM/F-12培养基并添加0.3 g/L G418及体积分数10%优质胎牛血清。在95%空气、体积分数5% CO₂、33.5 ℃温度下孵育，每2 d换液1次，当瓶壁细胞密度达80%左右时用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

实时细胞分析检测系统(real-time cell analyzer，RTCA)监测细胞增殖情况：RTCA系统采用的微电子生物传感器技术，在接近生理状态下获得检测结果，并且自动、连续监测，获取全过程动态信息，结果无需标记，对细胞无创伤。本研究使用该系统检测hFOB1.19在不同刺激下的细胞增殖情况。在16孔E-plate板中，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞密度约为1×10⁴。将16孔E-plate板放入监测仪内，置于孵育箱内孵育12 h后，细胞完全贴壁，细胞指数(cell index，CI)稳定于1-1.5时，予以Wnt-3A(50 μg/L和100 μg/L)，R-脊椎蛋白1(100 μg/L)及Dkk-1(100 μg/L)刺激并监测细胞增殖情况。

碱性磷酸酶检测：碱性磷酸酶测定试剂盒利用碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低^[10]。将hFOB1.19细胞铺板，每孔细胞密度约1×10⁵，培养24 h后，待细胞密度约50%时，予以加入Wnt-3a(50 μg/L)、Wnt-3a(100 μg/L)、R-脊椎蛋白1(100 μg/L)、Dkk1(100 μg/L)。48 h后弃上清，每孔加入MilliQ水60 μL，用细胞刮将贴壁的hFOB1.19成骨细胞直接刮下，将刮下的细胞加入1.5 mL离心管中，并放入液氮中反复冻融3次，使细胞发生破裂。在一个96孔板中，按照说明书要求加入30 μL样本，并使用酚标准应用液作为不同浓度梯度的标准孔，以及设置双蒸水为空白孔。每孔分别加入试剂盒中的缓冲液、基质液与不同浓度的酚标准贮备液后，充分混匀，放入37 ℃水浴15 min后添加显色剂，设置酶标仪测定波长为490 nm，测定各孔吸光度A值。根据标准曲线，计算对应各孔的碱性磷酸酶浓度。

酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测细胞上清液中骨保护素水平：将hFOB 1.19成骨细胞予以Wnt-3、R-脊椎蛋白1、Dkk1等不同刺激48 h后，收集上清液。使用骨保护素ELISA试剂盒中捕获抗体包被孔板，室温下过夜。加入收集的上清液，室温孵育2 h。洗涤后依次加入酶标抗体、显色液及终止液中止反应，在450 nm波长下检测其A值，处理数据计算骨保护素质量浓度。

1.4 主要观察指标不同刺激组中细胞增殖曲线、碱性磷酸酶活性及骨保护素质量浓度。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，组间比较用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前较多的研究大多利用小鼠成骨细胞探索R-脊椎蛋白1f与Wnt/β-catenin信号通路对骨骼的影响，体外培养人成骨细胞增殖、分化及成熟能力都较鼠成骨细胞低，培育环境要求苛刻，所以使用人成骨细胞研究甚少。本研究首次使用S40转染人hFOB 1.19成骨细胞，该细胞系在 0.6 g/L新霉素G418的克隆选择下，使用温度敏感的表达载体pUCSVisA58转染自然流产的胎儿四肢组织而建立。具有分化为表达造骨细胞表型的成熟造骨细胞的能力。提供了一个同质化的快速增殖模型系统，用于研究正常人造骨细胞的分化、造骨细胞生理激素及生长因子和对造骨细胞的功能及分化有影响的细胞因子，为人原代成骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关探索奠定了基础。

通过观察在R-脊椎蛋白1等刺激下，hFOB 1.19细胞的增殖、碱性磷酸酶活力和骨保护素水平3方面，阐述其对人成骨细胞的相关影响。本研究中并未观察到R-脊椎蛋白1对该细胞的增殖产生影响，说明R-脊椎蛋白1并非通过刺激成骨细胞增殖发生量变，而产生其功能上的质变。

在碱性磷酸酶活力检测方面，单独Wnt-3a及与R-脊椎蛋白1联合刺激时，确实观察到碱性磷酸酶活性的上调，但是尚未达到协同效应，仅仅说明两者间存在增强作用。因此，仅可认为Wnt-3a与R-脊椎蛋白1对hFOB 1.19细胞存在增强其分化能力的作用。但在碱性磷酸酶活力方面，R-脊椎蛋白1逆转DKK1的抑制作用是明确的。与Wnt-3a和DKK1联合刺激组的结果相比较，可见R-脊椎蛋白1比Wnt-3a在逆转DKK1对hFOB1.19分化功能的抑制作用更具有潜力。

同样的，在骨保护素水平检测方面，观测到R-脊椎蛋白1与Wnt-3a联合刺激也出现骨保护素质量浓度的增高，但增强的效果并不明显。但是，与碱性磷酸酶活力结果不同的是，单独R-脊椎蛋白1的刺激下骨保护素水平即可达到最高，说明在hFOB 1.19细胞成熟方面，单独R-脊椎蛋白1即可上调骨保护素水平。因此，Wnt-3a、R-脊椎蛋白1与DKK1三者联合刺激所出现的骨保护素质量浓度升高，无法明确是R-脊椎蛋白1自身的作用还是因为其逆转了DKK1的抑制效应，该部分有待进一步研究与验证。但令人可喜的是，R-脊椎蛋白1也许对hFOB 1.19细胞其成熟能力的影响更具有潜力。结合碱性磷酸酶活力检测的结果，可发现R-脊椎蛋白1与Wnt-3a一方面促进成骨细胞分化成熟，另一方面促进成熟的成骨细胞分泌骨保护素，从而与RANK-RANKL-OPG通路相联系，通过骨保护素的分泌增加，抑制破骨细胞的分化和成熟，两种调节骨代谢通路既独立又偶联，并且相互之间存在功能对话，从而维持骨平衡。为下一步研究成骨细胞/破骨细胞共培养环境中R-脊椎蛋白1在Wnt/β-catenin信号通路中的作用辅以铺垫。

虽然，在骨保护素水平检测的结果中并未明确其骨保护素质量浓度的升高，是因为R-脊椎蛋白1对骨保护素的上调作用还是其对DKK1的抑制，但是，无论从碱性磷酸酶活力方面还是骨保护素的检测结果，均可证明R-脊椎蛋白1确实可逆转DKK1的抑制作用，促进成骨细胞分化及分泌骨保护素，抑制破骨细胞。在类风湿关节炎滑膜炎阶段，可以观察到增生的滑膜或血管翳由骨软骨移行部向骨组织侵蚀征象，其最前线有大量的破骨细胞存在^[13-14]。根据本研究的结果，作者认为R-脊椎蛋白1在发挥促进成骨作用的同时，兼顾抑制破骨的作用，因此具有更加良好的应用前景，但相关作用机制研究，仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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人成骨细胞分化及骨保护素分泌：R-脊椎蛋白1通过Wnt/β-catenin通路的作用

Differentiation and osteoprotegerin secretion of human osteoblasts: R-spondin 1 effect via Wnt/beta-catenin signal pathway

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