腺相关病毒介导β-神经生长因子基因转染内皮祖细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：基因疗法为许多难治性疾病的治疗带来了新思路，选择合适的细胞、基因及载体是基因治疗的关键。

目的：利用重组腺相关病毒载体介导β-神经生长因子基因转染大鼠骨髓源内皮祖细胞，观察目的基因β-神经生长因子的表达情况及对内皮祖细胞增殖的影响。

方法：分离、培养、鉴定大鼠骨髓源内皮祖细胞，使用携带β-神经生长因子基因的重组腺相关病毒(rAAV-GFP-β-NGF)转染内皮祖细胞，根据绿色荧光蛋白荧光表达情况检测转染效率。利用ELISA法在蛋白水平检测β-神经生长因子的表达情况，MTT法检测目的基因对内皮祖细胞增殖活性的影响。

结果与结论：成功从大鼠骨髓中分离培养出内皮祖细胞，经鉴定符合内皮祖细胞特征。β-神经生长因子基因成功转染内皮祖细胞，转染率为65.3%。基因转染组细胞培养上清中检测到β-神经生长因子蛋白的表达，且可持续10 d，空白组和空载病毒转染组未检测到β-神经生长因子的表达。重腺相关病毒转染后内皮祖细胞增殖活性增高，与空载病毒转染组和空白组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，空白组和空载病毒转染组之间增殖活性差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，经重组腺相关病毒介导可成功将β-神经生长因子基因转染入大鼠骨髓源内皮祖细胞，使其持续表达β-神经生长因子蛋白并促进内皮祖细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 神经生长因子, 内皮祖细胞, 基因转染, 细胞培养, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, gene therapy has become a new trend for disease therapy and brought promise for some refractory diseases. Its key is to choose proper cells, genes and vectors.

OBJECTIVE: To use recombinant adeno-associated virus mediated β-nerve growth factor (β-NGF) to transfect rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells in vitro, and to investigate the effect of β-NGF expression on the proliferation of endothelial progenitor cells.

METHODS: The endothelial progenitor cells were isolated, cultured and identified from the bone marrow of rats. Empty vector or recombinant adenovirus-associated virus containing β-NGF gene was transferred into endothelial progenitor cells. We examined the transfection efficiency by fluorescence expression of green fluorescent protein. Expression of β-NGF protein was detected using ELISA, and its effect on the proliferation of endothelial progenitor cells was determined using MTT method.

RESULTS AND CONCLUSION: Rat endothelial progenitor cells were isolated and cultured successfully in vitro and were identified positive by the function of cells and immunofluorescence staining. The endothelial progenitor cells were infected directly by the recombinant adenovirus-associated virus containing β-NGF gene with an efficiency of 65.3%. β-NGF protein was detected in the culture supernatant of transfected endothelial progenitor cells, which reached a high level at 10 days after gene transfection. Furthermore, there was no β-NGF protein in the blank and empty vector groups. After transfection, the proliferative ability of endothelial progenitor cells was increased, which was significantly higher than the blank and empty vector groups (P < 0.05). But there was no difference between the latter two groups (P > 0.05). These findings suggest that recombinant adenovirus-associated virus containing β-NGF gene can be successfully transferred into rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells and promote the proliferation of endothelial progenitor cells.

Key words: Nerve Growth Factor, Cells, Cultured, Genes, Transfection

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 内皮祖细胞形态刚分离出的单个核细胞为悬浮的小圆形细胞，贴壁较慢，24 h可见少许细胞贴壁，形态仍保持圆形，体积逐渐伸展变大并呈细长梭形或不规则多边形(图1A)。第5天，细胞逐渐进入快速增殖阶段，出现团状细胞，中心细胞聚集，外周梭形细胞呈放射状分布(图1B)。10 d时可见大的集落(图1C)，3周左右可见集落联合，细胞缩短，彼此相邻，呈铺路石样排列(图1D)。 2.2 内皮祖细胞鉴定对分离培养得到的内皮祖细胞行免疫荧光染色鉴定，检测到特异性表面抗原CD34、CD133和VEGFR2呈阳性染色反应(图2)。所得结果符合内皮祖细胞特征。

2.3 rAAV-GFP-β-NGF转染内皮祖细胞的荧光观察通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，在转染第4天，被rAAV-GFP-β-NGF转染的内皮祖细胞(rAAV/NGF-EPC)和被rAAV-GFP-IRS转染的内皮祖细胞(rAAV/IRS-EPC)均开始出现绿色荧光，并随时间推移绿色荧光表达逐渐增加，第6天荧光明显增强(图3)，随机选取10个视野，计算每个视野里表达绿色荧光细胞数之和与总细胞数的比值，测得转染率为65.30%。

2.4 ELISA法检测β-神经生长因子蛋白表达按照β-神经生长因子的ELISA试剂盒说明书测定标准品及各孔细胞培养上清液中β-神经生长因子蛋白含量。rAAV-GFP- β-NGF转染组检测到β-神经生长因子蛋白表达，见图4。空白组和空载病毒组未检测出β-神经生长因子蛋白表达。 2.5 MTT法检测细胞增殖能力与空载病毒转染组和空白组比较，rAAV-GFP-β-NGF转染组转染5 d和7 d时增殖活性增高(P < 0.05)，空白组和空载病毒转染组增殖活性差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞形态学观察和生物学特性检测。

1.2 时间及地点于2014年11月在山东大学第二医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 5周龄Wistar大鼠20只，体质量130 g左右，购于山东大学医学院实验动物中心，实验处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 主要试剂及仪器 EGM-2MV培养基(瑞士Lonza公司)，胎牛血清、MTT(美国GIBCO公司)，Histopaque-1083分离液、0.25%胰蛋白酶、β-神经生长因子ELISA试剂盒(美国Sigma公司)，兔抗大鼠CD133单克隆抗体、兔抗大鼠CD34单克隆抗体、兔抗大鼠VEGFR-2单克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG二抗、PE标记羊抗兔IgG二抗(美国Santa Cruz公司)、高速低温离心机(德国HERAUS公司)、CO₂孵育箱、超净工作台(Thermo公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 内皮祖细胞的分离与培养 ①大鼠腹腔注射0.5 mL 3%戊巴比妥钠麻醉致死，浸入盛有体积分数75%乙醇的烧怀中消毒15 min后移出。②无菌条件下取出股骨、胫骨，去除附着于骨表面的肌肉，浸入盛有PBS的小烧怀中，用剪刀剪去骨干骺端，暴露出骨髓腔。③取一支10 mL一次性注射器抽取6-8 mL的EBM-2不完全培养液冲洗骨髓腔数次，至骨发白透亮，收集细胞悬液。④取大鼠淋巴细胞分离液4 mL加入12 mL离心管中，倾斜45°，再缓缓将细胞悬液加于淋巴细胞分离液之上，使其体积比为1︰1，注意保持两者之间的界面清晰，勿使其彼此混合。⑤将离心管配平后放于离心机中，离心半径12 cm，2 000 r/min离心 20 min；缓缓取出离心管，可看到离心管内的液体分为4层，最下层为红细胞与粒细胞，中间层为淋巴细胞分离液，最上层为血浆与EBM-2培养基，在中间层与最上层之间有一层薄薄的云雾状层。⑥将移液器直插入云雾状层，缓缓抽吸；将抽取的液体转移入另一离心管中，然后加入10 mL PBS，吹打均匀，离心5 min (离心半径12 cm，1 500 r/min)；吸弃上清液，加入10 mL PBS，吹打均匀，离心5 min(离心半径12 cm，1 500 r/min)。⑦吸弃上清液，加入5 mL EBM-2完全培养基，将细胞沉淀吹打均匀，接种于T25细胞培养瓶中，放入CO₂培养箱培养。⑧于第4天更换培养基，以后每隔3 d换液1次。待细胞生长铺满至约90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，以5×10⁴/cm²密度传代培养用于实验。

1.4.2 内皮祖细胞表面标志分子免疫荧光检测 ①取培养10 d的第3代内皮祖细胞，将孔内的培养液弃去，以PBS漂洗3次，每次5 min。②加入40 g/L多聚甲醛室温固定 30 min后，以PBS漂洗3次，每次5 min。③加入5%BSA置于培养箱中孵育30 min后，吸弃BSA。④分别加入一抗VEGFR2、CD133、CD34，置于4 ℃冰箱过夜。⑤PBS漂洗3次，每次5 min。⑥加入对应二抗PE标记羊抗兔IgG与FITC标记的羊抗兔IgG，孵育2 h。⑦以PBS漂洗2次，每次5 min，倒置显微镜下观察。

1.4.3 rAAV-GFP-β-NGF转染体外培养的内皮祖细胞 rAAV-GFP-β-NGF由广州百恩维生物科技公司合成。将第3代内皮祖细胞传代至24孔板中，当细胞达80%融合时，实验组和阴性组分别用感染复数值为1.0×10⁶ v.g/cell的rAAV-GFP-β-NGF和rAAV-GFP-IRS(含0.5 mL EGM-2MV、体积分数为2%胎牛血清)孵育2 h，再加入0.5 mL EGM-2MV(含体积分数为18%胎牛血清)继续培养24 h，得到被rAAV-GFP-β-NGF转染的内皮祖细胞(rAAV/NGF- EPC)和被rAAV-GFP-IRS转染的内皮祖细胞(rAAV/IRS-EPC)。换为完全EGM-2MV培养基继续培养用于下一步实验。空白组内皮祖细胞仅给予换液处理。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。

1.4.4 ELISA法检测β-神经生长因子蛋白表达于转染后第1，4，7，10天将转染基因的内皮祖细胞、转染空载体的内皮祖细胞和正常培养内皮祖细胞的培养液，以1 000 r/min转速离心20 min，取上清进行检测。

按ELISA说明书操作，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加入不同浓度的标准品或待测样品100 μL，轻轻晃动混匀，酶标板上覆膜，37 ℃反应120 min。经第一和第二抗体孵育反应后，用酶标仪在450 nm处测量各孔的吸光度值。对标准品中β-神经生长因子蛋白浓度及对应的吸光度值绘制标准曲线，将细胞培养上清液中测得的吸光度值在标准曲线上确定β-神经生长因子蛋白含量。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期的转染基因的内皮祖细胞、转染空载体的内皮祖细胞和未转染的内皮祖细胞，胰酶消化后，用培养基制成单细胞悬液。将细胞以每孔5×10³(200 μL)的密度接种于96孔板孵育。分别于培养的第1，2，3，5，7天吸弃培养液，加入MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，然后终止培养，小心吸尽上清液，加入二甲基亚砜150 μL，平板床振荡10 min。在酶标仪上490 nm波长处比色，以单纯培养基调零测定各孔吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①内皮祖细胞转染β-神经生长因子基因后目的蛋白的表达。②腺相关病毒介导β-神经生长因子基因转染对内皮祖细胞增殖能力的影响。

1.6 统计学分析数据采用x(_)±s表示，SPSS 16.0软件进行组间比较的单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

过去人们普遍认为神经元再生能力低、损伤区域微环境变化及瘢痕形成等原因以致中枢神经系统损伤后几乎无法恢复，所以脊髓损伤一直是临床最难处理问题之一。现在研究显示脊髓损伤并非完全无法恢复^[9-10]。脊髓损伤再生的关键在于建立有效的神经生长微环境。保持有利于神经生长的神经生长因子持续有效浓度以及能为脊髓修复提供充足血供保障的血运系统正是这种微环境的两大要素。神经生长因子由Rita Levi-Montgalcin在1952年发现，是最早被发现的神经营养因子，也是目前研究得最为透彻神经细胞生长因子之一，广泛分布于中枢神经系统、外周神经系统及周围组织，不仅能营养神经元，而且能促进突起生长。机体可由脊髓中的神经元细胞、神经胶质细胞等通过自分泌和旁分泌的形式产生神经生长因子，其通过与神经生长因子受体结合发挥作用。在神经元损伤时，神经生长因子可选择性地与高亲和力受体TrkA结合发挥生物效应，维持受损神经元的存活和分化，决定轴突生长方向，促进受损神经修复，诱导突起延伸^[11-13]。神经生长因子能够促进轴突再生，对神经元的发育、分化、再生等特性均起重要调控作用，对治疗脊髓损伤、脑损伤等中枢神经系统疾病有很好应用前景^[14-16]。神经生长因子由两个α亚基、一个β亚基和两个γ亚基组成，其中β亚基是神经生长因子具有促进神经生长作用的活性部分，β-神经生长因子可单独表现出神经生长因子活性，且β-神经生长因子基因在不同种属间保持高度同源性^[17]，本研究选择β-神经生长因子基因作为目的基因构建载体。内皮祖细胞起源于中胚层的卵黄囊血岛^[18]，是一种前体细胞，不表达出成熟内皮细胞的细胞表型，它具有较强的自我增殖能力，且能够分化为功能完整的成熟血管内皮细胞^[19]。内皮祖细胞不仅参与胚胎期的血管生成，而且在出生后也参与血管新生。在缺血性、创伤性疾病的病理过程中，被动员并定向归巢到缺血或损伤处分化为成熟的内皮祖细胞，参与血管发生和血管生成^[20]。Taguchi等^[21]和Zhao等^[22]的研究提示造血干细胞和内皮祖细胞移植有促进神经系统修复与再生的作用。Chen等^[23]的研究发现大鼠脑缺血模型经静脉注射脐血来源的内皮祖细胞，缺血区域出现大量内皮祖细胞聚集，供血明显改善。内皮祖细胞还可通过抗炎作用减轻脊髓损伤促进损伤修复。研究显示，

脊髓损伤和脑损伤后，内皮祖细胞可以改善内环境，减少肿瘤坏死因子α的表达，提高白细胞介素10和锰超氧化物歧化酶的表达，发挥抗氧化应激作用，减少细胞凋亡，减轻炎症反应，减少胶质细胞生成，促进神经功能恢复^[24-26]。皮祖细胞还可分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子、色素上皮衍生因子、Ⅳ型胶原等^[27]，这些细胞因子多为神经营养因子，对神经生发起促进作用^[28-31]。近年来对脑组织的研究发现，神经生发常常出现在血管生发之后^[32-33]，且沿血管路径出现，同时伴有明显的血管内皮分化，血管内皮细胞还表现出明显的神经保护作用。血管生发为神经生发提供平台，他们所处的环境被称作神经血管微环境。神经干细胞修复脊髓损伤研究的最新观点认为：移植外源性神经干细胞的方法在本质上仅仅是使脊髓损伤处的内环境条件得到改善，而不是直接使内源性神经干细胞产生神经生发作用，起到促进损伤神经修复的作用，其对脊髓损伤的修复作用最终还是通过受损部位内环境的改善来起效^[34-36]，因此，利用神经干细胞修复脊髓损伤的关键问题在于设法改善局部微环境以利于神经干细胞的神经生发。杜公文等^[37]发现将神经干细胞与内皮祖细胞共培养后，单位面积神经干细胞球的数量高于单独培养的神经干细胞，且干细胞球平均直径也大于神经干细胞单独培养时的测量结果，提示内皮祖细胞有促进神经干细胞增殖的作用。 AAV作为基因治疗载体具有一定优势，AAV无明显致病性，与人类疾病无任何相关性，是可用于人类疾病治疗的安全载体；其宿主范围广，能够感染分裂细胞和非分裂细胞，且插入突变的危险性低；不引起明显的炎症和免疫反应；可长效稳定表达介导基因^[38]。鉴于以上特点，本实验采用重组腺相关病毒介导目的基因的转染。

实验从大鼠骨髓中分离培养出内皮祖细胞，并通过表面抗原CD34、CD133和VEGFR2行免疫荧光鉴定，结果均符合内皮祖细胞特征，并成功进行了重组腺相关病毒(rAAV-GFP-β-NGF)介导的β-神经生长因子基因转染，发现被转染内皮祖细胞能够持续高表达β-神经生长因子蛋白，MTT法检测细胞增殖能力发现：与空载病毒转染组和空白组比较，rAAV-GFP-β-NGF转染组增殖活性增高(P < 0.05)，空白组和空载病毒转染组增殖活性差异无显著性意义(P > 0.05)，提示重组腺相关病毒转染对内皮祖细胞的增殖能力没有明显影响，β-神经生长因子基因转染可提高内皮祖细胞的增殖活性，为下一步利用携带β-神经生长因子基因的骨髓源内皮祖细胞应用于脊髓损伤修复提供实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程