一定强度静磁场可促进许旺细胞快速分泌神经生长因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.020

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (36): 5848-5852.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

一定强度静磁场可促进许旺细胞快速分泌神经生长因子

魏凌云，王锐英，唐际存

桂林医学院附属医院骨二科，广西壮族自治区桂林市 541001

出版日期:2015-09-03 发布日期:2015-09-03
通讯作者: 通讯作者：王锐英，博士，主任医师，桂林医学院附属医院骨二科，广西壮族自治区桂林市 541001
作者简介:魏凌云，男，1980年生，山西省阳泉市人，汉族，硕士，主要从事周围神经损伤及组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81460198)，项目名称：EZH2基因对神经干细胞修复脊髓损伤的表观调控作用及机制研究；广西卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题(Z2015400)，课题名称：静磁场对血旺细胞体外扩增的影响

A static magnetic field with certain intensity can promote the secretion of nerve growth factor from Schwann cells

Wei Ling-yun, Wang Rui-ying, Tang Ji-cun

Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Online:2015-09-03 Published:2015-09-03
Contact: Wang Rui-ying, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wei Ling-yun, Master, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460198; the Self-Funded Research Project of Guangxi Health and Family Planning Committee, No. Z2015400

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外对静磁场加载许旺细胞的研究较少，对其产生的生物学效应尚不清楚。

目的：探索静磁场对许旺细胞分泌神经生长因子水平的影响。

方法：将传代良好的许旺细胞随机分为3组，分别为0.05 mT静磁场组、0.1 mT静磁场组、空白对照组。从接种第2天即开始静磁场加载，每天曝磁12 h，空白对照组不进行静磁场加载。加载6 d后利用RT-PCR技术检测许旺细胞中神经生长因子mRNA的表达，ELISA技术检测许旺细胞分泌神经生长因子水平。

结果与结论：静磁场组培养上清中神经生长因子mRNA的表达和分泌神经生长因子水平显著高于空白对照组(P < 0.05)；0.1 mT静磁场组神经生长因子mRNA的表达和分泌神经生长因子水平虽高于0.05 mT静磁场组，但是差异无显著性意义(P >0.05)。结果表明一定强度的静磁场可以促进许旺细胞快速分泌神经生长因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 许旺细胞, 神经生长因子, 静磁场, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are less studies on static magnetic field, and its biological effects are still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the static magnetic field effect on the secretion of nerve growth factor from Schwann cells.
METHODS: Schwann cells were randomly assigned into three groups: 0.05 mT sciatic magnetic field group,
0.1 mT sciatic magnetic field group and control group. At 2 days of inoculation, the cells were exposed to the sciatic magnetic field, 12 hours per day. Cells in the control group were not exposed to the sciatic magnetic field. After 6 days of exposure, RT-PCR method was used to detect nerve growth factor mRNA expression in Schwann cells, and ELISA was adopted to detect the level of nerve growth factor secreted from Schwann cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The mRNA expression and secreted level of nerve growth factors in the culture supernatant were significantly higher in the two sciatic magnetic field groups than the control group (P < 0.05), especially in the 0.1 mT group. However, there was no difference between the 0.05 mT and 0.1 mT groups (P > 0.05). These findings indicate that the static magnetic field with certain intensity can promote the secretion of nerve growth factors from Schwann cells.

Key words: chwann Cells, Nerve Growth Factor, Electromagnetic Fields

中图分类号:

R394.2

魏凌云，王锐英，唐际存. 一定强度静磁场可促进许旺细胞快速分泌神经生长因子[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(36): 5848-5852.

Wei Ling-yun, Wang Rui-ying, Tang Ji-cun. A static magnetic field with certain intensity can promote the secretion of nerve growth factor from Schwann cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5848-5852.

图/表（结果） 2

2.1 许旺细胞的形态在倒置显微镜下观察原代许旺细胞单细胞悬液，4-6 h许旺细胞即下沉贴壁，绝大多数细胞贴附在培养瓶底部。

原代培养24 h后观察有较多小而圆、较亮折光强的贴壁细胞，胞体饱满立体感强，不随液体流动而移动，少量细胞呈双极梭形或三角形，胞核呈圆形或卵圆形。第5天起，细胞胞体开始肩并肩平行排列(图1A)，第10天呈现出“端端相对，极极相对”等网状或漩涡状规律排列，形如“地毯”。传代后，细胞均匀分布生长，培养至第5天，细胞密集、融合呈漩涡状，细胞铺满瓶底的75%(图1B)，八九天后增殖速度减慢，聚集形成漩涡状, 并且出现了特征性的突触突起。 2.2 S-100免疫荧光法鉴定许旺细胞及纯度 S-100免疫细胞组化染色阳性细胞达92%，胞质和突起呈棕褐色，胞核淡染(图2)。 2.3 许旺细胞内神经生长因子的表达自采集图像结果显示，多数神经生长因子在许旺细胞胞浆中表达(图3)。

2.4 静磁场对许旺细胞神经生长因子mRNA水平的影响静磁场组神经生长因子 mRNA特异性条带灰度值显著高于空白组(图4)，说明一定强度的静磁场能够促进许旺细胞中神经生长因子mRNA的产生。 2.5 静磁场中许旺细胞分泌神经生长因子的水平许旺细胞置静磁场中培养72 h后，采用ELISA法检测培养基上清中神经生长因子水平，0.1 mT和0.05 mT静磁场组培养上清中神经生长因子质量浓度分别为(110.06±9.57)，(93.79±11.05) ng/L，显著高于空白对照组[(52.86± 3.19) ng/L]，差异有非常显著性意义(P < 0.01，P= 0.002 7)；0.1 mT组神经生长因子水平虽高于0.05 mT组，但是差异无显著性意义(P > 0.05)，说明一定强度的静磁场可以促进许旺细胞分泌神经生长因子。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年2月至2014年5月在桂林医学院科学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物出生3-5 d的新生SD大鼠20只，雌雄各半，体质量20-35 g，平均29.6 g，来源于桂林医学院实验动物中心。

1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，L-多聚赖氨酸、阿糖胞苷、鼠抗人S-100多克隆抗体(Sigma公司)，SABC免疫组化试剂盒、鼠抗人NGF多克隆抗体、反转录试剂盒、神经生长因子ELISA测试盒(Boster公司)，共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)，钕铁錋永磁体(N35，北京金丰源科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 许旺细胞的分离、纯化及原代培养出生3-5 d的SD大鼠20只处死后浸入体积分数为75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下取出双侧坐骨神经，显微镜下尽量去除神经外膜及粘连组织，PBS洗涤2遍，眼科剪剪碎成0.5 mm³大小，加入0.25%胰蛋白酶和0.06%胶原酶，于37 ℃水浴混合消化30 min，摇匀后沉淀5 min，吸取上清单细胞悬液移入盛有含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化，吸管轻轻吹打使组织块分散，然后离心(1 000 r/min，5 min)，加入适量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液吹打呈混悬状，吹打后无明显肉眼可见的组织，调整细胞浓度至1×10⁸ L^-¹，种植于预先涂布有多聚赖氨酸的25 mL培养瓶中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中30 min，然后以双30 min差速贴壁贴走部分纤维母细胞。细胞培养24 h后，全量换液并去除未贴壁的杂细胞，加入阿糖胞苷(终质量浓度为2 mg/L)对成纤维细胞进行抑制，放置于 37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中，48 h后首次换液，后每隔3 d换液1次，每日在倒置显微镜下观察其生长情况。

1.4.2 许旺细胞的传代培养待细胞长满瓶底90%后，用PBS洗涤细胞2次，再用0.125%胰蛋白酶反复吹打2.0-3.0 min，去除胰酶，加入培养液，反复吹打后计数，以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度传代接种于25 mL培养瓶中。

1.4.3 S-100免疫荧光法鉴定许旺细胞及纯度选取第4代长势较好的细胞，用0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA进行消化，血球计数板计数后以5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到预先涂布有多聚赖氨酸的盖玻片上，置于体积分数为5% CO₂、37 ℃条件下培养24 h，取出盖玻片，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)漂洗2次，体积分数为4%甲醛/PBS固定10 min，玻片上加入鼠抗人S-100多克隆抗体150 μL，置4 ℃过夜；PBS冲洗2次，加入羊抗鼠IgG，室温20 min，PBS冲洗2次，最后滴加SABC数分钟，PBS冲洗，脱水后以荧光封固剂封固，整个过程避光。在荧光显微镜下观察摄片，S-100阳性细胞为许旺细胞。在荧光显微镜下随机选取10个视野，镜下计数许旺细胞数(S-100阳性细胞)和细胞总数，计算许旺细胞纯度= S-100阳性细胞数/细胞总数×100%^[9]。

1.4.4 许旺细胞内神经生长因子的表达选取生长良好的第4代许旺细胞消化后，稀释成细胞悬液，按 1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于放有盖玻片的6孔培养板中，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养48 h。测定时取出盖玻片，先使用0.1 mol/L PBS充分冲洗，冷丙酮固定20 min，再加入0.1% Triton-X100浸泡8 min，加入5% BAS封闭液，室温下孵育25 min，弃掉液体，滴加配置好的鼠抗人神经生长因子多克隆抗体150 μL，在37 ℃湿盒中孵育1 h，再滴加配置好的羊抗鼠IgG，阴性对照使用0.1 mol/L PBS。随后0.1 mol/L PBS充分冲洗，滴加SABC，37 ℃湿盒中孵育30 min，再次0.1 mol/L PBS充分冲洗，加入PI工作液，室温避光复染15 min。PBS彻底冲洗，DABCO封固，置4 ℃湿盒避光保存，用共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

1.4.5 静磁场加载当第3代细胞长至细胞瓶底的90%时，按上述方法处理后，以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度传代接种于25 mL培养瓶中，随机分为3组，分别为0.05 mT静磁场组、0.1 mT静磁场组、空白对照组。从接种第2天即开始静磁场加载，共加载6 d，每天曝磁12 h，强度分别为0.05，0.1 mT^[10]，空白对照组不进行静磁场加载。

1.4.6 RT-PCR 检测神经生长因子基因表达静磁场加载6 d后，用Trizol提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明进行反转录PCR仪扩增产物(选择β-actin作为内参)。RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计，神经生长因子：Sense，5’-GAC TAT CCT TCT CCC CCG AC-3’，antisense，5’-CCC ATG TCC TGT GTG AGG TT-3’，扩增产物长度152 bp；β-actin：Sense，5’-CCG CAG CTA GGA ATA ATG GA-3’，antisense：5’-CAA ATG CTT TCG CTC TGG TC-3’，扩增产物长度为222 bp。结果分析：PCR产物在1.5%的琼脂糖上电泳，电泳条件为：电压80 V，电流400 mA，时间20 min。电泳完毕，EB染色，紫外灯下观察并用凝胶成像系统照相^[11]。

1.4.7 ELISA检测许旺细胞分泌神经生长因子水平静磁场加载6 d后，取各组对数生长期的许旺细胞，用胰蛋白酶- EDTA混合液消化，制成细胞悬液，以5×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板，每组6孔，培养液为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每孔1 mL，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养48 h，离心(1 000 r/min)5 min取上清，将上清移入无菌EP管，再次离心5 min(1 000 r/min)，取上清，-20 ℃冷藏待测。样品收集完全后，根据神经生长因子ELISA测试盒说明书进行检测，于450 nm处以空白对照孔调零后测各孔吸光度值，所得吸光度值大小与各组细胞上清液中神经生长因子水平成正比^[12]。

1.5 主要观察指标 ①许旺细胞的形态。②S-100免疫荧光法鉴定许旺细胞及纯度。③许旺细胞内神经生长因子的表达。④RT-PCR法检测神经生长因子基因表达。⑤ELISA法检测许旺细胞分泌神经生长因子水平。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示，各组间比较采用SPSS 13.0软件进行方差分析LSD(ANOVA)法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经生长因子是由许旺细胞分泌的一种重要的神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用^[13-16]，但许旺细胞体外扩增缓慢，限制了神经生长因子的应用。随着现代生物磁学的发展，越来越多的实验证明一定强度的静磁场可以促进许旺细胞分泌神经生长因子^[17-20]。Godinho认为任何生物体内自身都存在着顺磁性物质和反磁性物质，这些物质在外加磁场的影响下会对生物组织和生命活动产生影响，即磁场的生物学效应^[21-24]。这种效应作用在生物体，尤其是体外增殖培养的细胞，会表现出以下一些特点：①磁场强度必须达到一定大小才会产生效应(阈值效应)。②磁场作用必须经过一段时间才能表现出来(滞后效应)。③磁场作用的能量虽然很小，但引起的生物作用却很大(生物放大效应)^[25-26]。Feng等^[27]通过实验结果显示一定强度的静磁场会影响细胞膜上电压门控性钾离子通道的失活特性，从而使膜变形，影响了通道的物理性质，进一步影响与之相关的各项细胞活动。一定强度的静磁场可以作用于细胞膜上的某些受体，通过一系列的反应可以引起细胞内CAMP水平的改变，继而触发一系列蛋白磷酸化反应，改变细胞内信号通路，将刺激信号传递至核内，引起细胞增殖作用，影响蛋白合成和基因的表达^[28-29]。本实验通过将许旺细胞置于0.05，0.1 mT两种不同强度的静磁场加载下经过一段时间的体外培养，观察到神经生长因子水平较空白组增加，且随着磁场强度的不断增加，许旺细胞分泌神经生长因子的速度逐渐增快，但并不表现出倍数性增长。研究认为静磁场强度倍数性的改变可能并不会使细胞膜上离子通道的开放比例与之表现出类似的改变，究其原因可能与静磁场的细胞生物学效应既涉及到静磁场的强度大小、均匀性、方向性、作用时间等因素，还会受到细胞自身种类、磁性、敏感性、作用部位等因素的影响，是多种因素共同作用的结果^[30-32]。本实验在一定程度上加深了人们对静磁场的认识，提出了体外扩增许旺细胞的新方法，为今后静磁场应用于周围神经损伤治疗提供指导意义。当然，目前的研究对于静磁场作用的量效关系和时效关系等尚无较好的解释和判断，还需要进一步探索和研究二者的关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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