帕金森病模型大鼠损毁侧纹状体内移植神经干细胞的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，细胞移植治疗在帕金森病患者中广为使用，且效果理想。

目的：探索帕金森病大鼠移植的神经干细胞的增殖及分化，为帕金森病治疗提供新的理论依据。

方法：采用胶原酶消化法体外分离培养大鼠中脑组织中的神经干细胞，诱导第3代神经干细胞。采用6-羟基多巴胺单侧法制作帕金森病大鼠模型，将造模成功大鼠分为模型组和神经干细胞组，各7只。模型组大鼠在损毁侧纹状体内注入4 mL生理盐水，神经干细胞组大鼠在损毁侧纹状体内注射5 μL绿色荧光蛋白标记的神经干细胞(1×10⁹ L^-¹)。

结果与结论：神经干细胞组大鼠移植神经干细胞后酪氨酸羟化酶阳性区域面积显著低于模型组，移植神经干细胞后7，14，28 d时Ptx3 mRNA的表达水平显著高于模型组，14，28 d SHH mRNA显著高于模型组，而Nurrl mRNA的表达水平与模型组接近。结果提示神经干细胞移植模型大鼠损毁侧纹状体内可分化为多巴胺能神经元，为治疗帕金森病带来突破性进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 帕金森病, 神经干细胞, 细胞增殖, 细胞分化, 酪氨酸羟化酶, 免疫荧光染色

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, cell transplantation therapy is widely used in the treatment of Parkinson’s disease with satisfactory outcomes.

OBJECTIVE: To investigate the proliferation and differentiation of transplanted neural stem cells in Parkinson’s disease rats, thereby providing a new theoretical basis for the treatment of Parkinson’s disease.

METHODS: Neural stem cells from the brain tissues of rats were isolated and cultured in vitro using collagenase digestion method. Unilateral rat model of Parkinson’s disease was made by 6-hydroxydopamine method, and the successful rat models were divided into model group and cell transplantation group, with seven rats in each group. The rats in the model group were given 4 mL normal saline at the damaged striatum, and those in the cell transplantation group were injected 5 μL green fluorescent protein-labeled neural stem cells (1×10⁹/L) into the damaged striatum.

RESULTS AND CONCLUSION: After cell transplantation, the positive area of tyrosine hydroxylase was significantly lower in the cell transplantation group than the model group. Compared with the model group, the expression level of Ptx3 mRNA was significantly higher in the cell transplantation group at 7, 14, 28 days after cell transplantation and the expression of SHH mRNA was significantly higher in the cell transplantation group at 14 and 28 days after cell transplantation. However, there was no difference in the expression of Nurrl mRNA between the two groups. These findings indicate that neural stem cells injected into the damaged striatum of rats can differentiate into dopaminergic neurons, which bring a breakthrough in the treatment of Parkinson’s disease.

Key words: Neural Stem Cells, Parkinson Disease, Tyrosine 3-Monooxygenase, Dopamine

中图分类号:

R394.2

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Liu Zhen-hua, Wang Shi-jun. Liu Zhen-hua, Studying for doctorate, Chief physician, Department of Neurology, Shandong Provincial[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5843-5847.

图/表（结果） 2

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引言

帕金森病是临床上常见的慢性神经系统退行性疾病，发病率较高，且随着人们生活节奏的加快其发病率出现上升趋势^[1]。研究显示帕金森病在65岁以上老年人中发生率为1%，并患者发病后平均生存期为15年^[2]。患者发病后主要以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死以及纹状体多巴胺水平减少为主。对于一个正常人而言，黑质致密部多巴胺能神经元能够在细胞外摄入左旋酪氨酸，并且细胞能够通过酪氨酸羟化酶将左旋酪氨酸转化为左旋多巴，从而进一步转化为纹状体区多巴胺，并将其进行信号的传递^[3]。当患者脑内致密部多巴胺能神经原在一定条件下减少时，则能够有效的抑制乙酞胆碱的输出，从而引起禁止性震颤、肌肉僵直等^[4]。但目前，临床上对于帕金森病尚缺乏理想的治疗方法，常规方法虽然能够改善患者症状，但是长期疗效欠佳，患者治疗后并发症发生率较高^[5]。近年来，细胞移植治疗在帕金森病患者中广为使用，且效果理想。早在1988年时，已有研究使用胚胎中脑移植治疗帕金森病，这开创了细胞移植的先河，随后细胞移植方法也得到了飞速的发展，该治疗方法能够在相关因素作用下定向诱导分化并形成胚胎干细胞，从而能够发挥正常细胞功能^[6]；移植进入脑内的神经干细胞能够分泌神经营养因子，对病灶神经细胞发挥其保护和营养作用，促进细胞重新恢复功能，并且也能够促进内源性多巴胺神经发生^[7]。但神经干细胞定向分化仍是制约干细胞移植治疗的瓶颈。如何促使移植入脑内的神经干细胞增殖并分化为更多的多巴胺能神经元是实现细胞移植、修复的关键^[8-9]。因此，临床上研究帕金森病大鼠神经干细胞增殖及分化作用机制具有重要意义。实验拟探索帕金森病大鼠中移植的神经干细胞增殖及分化的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料成年实验大鼠24只，鼠龄5.0-6.0周，体质量为(200±10) g，雌雄不限，由南方医科大学动物实验中心提供，合格证号为SCXK(粤)2007-0010。实验中，大鼠饲养严格遵守相关标准进行饲养，培养温度为22 ℃，光线12 h交替、自由饮水、进食，且对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关规则^[10]，实验经过山东大学附属省立医院动物实验伦理委员会批准同意。

帕金森病大鼠神经干细胞培养与检测使用的主要仪器和试剂：
试剂及仪器	来源
胎牛血清	杭州四季青公司
绿色荧光蛋白慢病毒载体	复旦大学上海医学生命学院
戊巴比妥钠溶液(国药准字H31021847)	上海新亚药业有限公司
阿朴吗啡(国药准字H21022436)	东北制药集团沈阳第一制药有限公司
流式细胞仪	COULTEREPICSALTR
电子天平	上海求精实验设备厂
倒置显微镜	上海跃进医疗器械厂
脑立体定向仪	NARISHICEZSN，日本
PCR仪	Falcon公司
高效液相色谱仪	日本岛津公司
图像分析系统(Q500IW)	LEICA公司

1.2 造模方法参照文献[11]制作大鼠帕金森病模型，大鼠采用1%戊巴比妥钠(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，将其固定在立体定向仪上，左侧黑质注射6-羟基多巴胺，2周后在颈部皮下注射浓度为0.1%的阿朴吗啡0.2 mL。

1.3 造模成功检测标准检测大鼠向健侧旋转的圈数，圈数超过7 r/min为模型成功，可用于后续实验^[12]。

1.4 神经干细胞的分离培养、鉴定及标记选取10只大鼠，分离出中脑相关组织，机械消化成5%单细胞悬液，并将其种植在塑料培养瓶中，体积分数5%二氧化碳37 ℃培养，待原代克隆出现后(一般为7-10 d)，采用离心收集神经球，胰酶消化，并进行吹打成单细胞悬液，控制细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，将其种植在新的培养液中，每7 d传代1次，离心收集成形的神经球，经过甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，干燥固定后进行免疫细胞染色，检测神经干细胞的特异性蛋白表达水平^[13-14]；采用免疫细胞化学方法对星形胶质细胞标记物胶原原纤维酸性蛋白进行检测，证实培养出的神经干细胞的分化能力等^[15-16]。

在神经干细胞培养皿中加入绿色荧光蛋白慢性病毒载体，在荧光显微镜下观察到神经干细胞标记上绿色荧光蛋白后，进行离心，吹打，并将其配置成为1×10⁹ L^-¹浓度^[17]。

1.5 动物分组及干预将造模成功大鼠分为模型组和神经干细胞组，各7只。模型组大鼠模型损毁侧纹状体内注入4 mL生理盐水，生理盐水灌胃2次/d；神经干细胞组大鼠损毁侧纹状体注射5 μL神经干细胞(1×10⁹ L^-1)^[17]，生理盐水灌胃2次/d^[18]。

1.6 取材造模后7 d，采用1%戊巴比妥钠溶液(5 mL/kg)将大鼠麻醉，处死，取脑组织。

1.7 神经干细胞移植后分化的情况采用免疫组化法检测移植细胞中多巴胺能神经元特异性的功能酶酪氨酸羟化酶的表达水平，图像分析系统计算标记阳性区域占整个照面的面积比例^[19]。

1.8 大鼠脑内神经干细胞分化相关因子的表达水平采用反转录PCR方法检测大鼠脑内神经干细胞分化相关因子的表达水平，相关操作步骤必须严格遵循试剂盒说明进行操作^[20]。

1.9 主要观察指标 ①神经干细胞分化为多巴胺能神经元的情况。②大鼠神经干细胞分化相关因子的表达水平。

1.10 统计学分析数据以x(_)±s表示，利用SPSS 18.0软件进行统计学分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，对于不符合数据进行单一统计学处理，存在显著性意义予以LSD法两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，临床上对于帕金森病机制并不完全知晓，其主要病理改变为脑黑质致密部色素脱失和多巴胺能神经元的大量丧失，从而造成患者锥体外系统丧失。常规方法虽然能够改善患者症状，但是长期疗效欠佳，患者治疗依从性较差，药物不良反应也相对比较多，影响治疗预后。因此，临床上研究大鼠模型神经干细胞增殖及分化作用具有重要意义^[21-22]。6-羟基多巴胺则属于是一种非脂溶性物质，不能够通过血脑屏障，能够在大鼠纹状体或黑质区可被多巴胺转运体结合而形成超氧化物及其相应的物质，能够直接抑制线粒体呼吸酶复合物的活性，从而能够破坏细胞膜的稳定性以及DNA的完成性，促使多巴胺能神经元坏死^[23-24]。同时，实验中采用损伤法造成多巴胺能神经元进行性变性，缺损，能够有效的模拟人类帕金森病中晚期患者出现的行为及其相应的病理改变，能够为帕金森病大鼠模型神经干细胞增殖、分化研究提供良好的平台^[25]。近年来，干细胞移植在帕金森病患者中广为使用，且效果理想。随着神经干细胞技术体外培养以及纯化技术的不断提高，神经干细胞移植成为了比较有前途的治疗帕金森病的方法之一^[26]。成功的细胞移植包括了移植细胞的存活，获得特定的神经细胞表型并能够整合受体组织中发挥作用。因此，无论是将体外培养的神经干细胞直接移植或是在体外诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元后移植入脑中有2个问题需要解决，一是如何促进神经干细胞分化为足够多的多巴胺能神经元；二是如何促使移植入脑内的细胞能够在长时间损伤区存活下来，这些问题的解决将使得帕金森病细胞移植治疗带来突破性的进展^[27-28]。本实验结果显示大鼠模型神经干细胞能够有效的使得干细胞向多巴胺能神经元分化，在部分时间点增殖速度相对较高^[29]。目前，临床上对于神经干细胞移植治疗帕金森病疗效还不够理想，出现这种现象的原因是多方面的，可能和神经干细胞移植后不稳定分化成为多巴胺能神经元或其他分化程度角度有关。移植区域内微环境诱导信号在神经干细胞定向分化中发挥重要的作用^[30]。目前，已经知道患者大脑内微环境中的神经细胞、胶质细胞、细胞外基质以及其他的因子或基因，如Nurrl、Ptx3、SHH等指标在多巴胺能神经元的分化成熟过程中都具有一定的作用^[31]。本实验中，神经干细胞组大鼠移植神经干细胞后7，14，28 d时Ptx3 mRNA的表达水平显著高于模型组，14，28 d SHH mRNA显著高于模型组，而Nurrl mRNA的表达水平与模型组接近。综上所述，神经干细胞移植后可分化为多巴胺能神经元，为治疗帕金森病带来突破性进展。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程