中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞对帕金森大鼠行为学及脑组织形态学的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现神经干细胞或者骨髓基质干细胞可脑内移植治疗中枢神经系统疾病，但是两种干细胞移植治疗效果的比较相对较少。

目的：观察比较中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞对帕金森大鼠行为学及脑组织形态学的影响。

方法：58只SD大鼠构建帕金森病模型，随机分为3组，分别为骨髓基质干细胞组(20只)、中脑神经干细胞组(20只)、生理盐水组(18只)。造模成功后3周，选取右侧纹状体 2 个坐标点注入骨髓基质干细胞悬液、中脑神经干细胞悬液、生理盐水5 μL。移植后5个月腹腔注射阿朴吗啡观察大鼠的行为学变化，取纹状体脑组织制备石蜡切片进行免疫组化荧光染色。

结果与结论：治疗后第5个月骨髓基质干细胞组和中脑神经干细胞组大鼠旋转次数较治疗前显著下降(P < 0.05)，且明显低于生理盐水组(P < 0.05)，骨髓基质干细胞组和神经干细胞组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后第1周，骨髓基质干细胞组纹状体内有BrdU与Nestin双重染色细胞；移植后第1个月，脑纹状体内出现BrdU/GFAP双重染色细胞和BrdU/NSE双重染色细胞；纹状体内存在TH阳性细胞，但未出现明显BrdU/TH双重染色细胞；移植1个月之后，BrdU与Nestin双重染色细胞数量逐渐减少，最终基本消失，但仍然存在一定的数量的BrdU/GFAP、BrdU/NSE双重染色细胞，BrdU/GFAP阳性细胞数量相对较多。同一时间点，中脑神经干细胞组也存在类似情况，但生理盐水组未发现双标细胞。结果表明，中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞移植均可改善帕金森大鼠的行为学，且可分化为神经元、星形胶质细胞、多巴胺能神经元。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 帕金森, 中脑神经干细胞, 骨髓基质干细胞, 细胞移植, 大鼠, 行为学

Abstract:

BACKGROUND: For treatment of central nervous system diseases, neural stem cells (NSCs) or bone marrow stromal stem cells (BMSCs) can be transplanted into the brain, but there are less reports to compare the effects of two kinds of stem cell transplantation.

OBJECTIVE: To explore the effect of midbrain NSCs and BMSCs on the behavior and brain morphology of rats with Parkinson’s disease.

METHODS: Fifty-eight Sprague-Dawley rats were enrolled to establish Parkinson’s disease models, and then randomly divided into three groups, which were treated with 5 μL midbrain NSCs (n=20), 5 μL BMSCs (n=20) and 5 μL normal saline (n=18) via two coordinate points of the right striatum at 3 weeks after modeling, respectively. At 5 months after transplantation, the rats underwent intraperitoneal injection of apomorphine to observe behavioral changes, and then, the striatum was taken for immunohistochemistry staining.

RESULTS AND CONCLUSION: The number of rotations was reduced significantly in the BMSCs and midbrain NSCs groups at 5 months after transplantation (P < 0.05), which was significantly lower than that in the normal saline group (P < 0.05). However, there was no significant difference between the BMSCs and NSCs groups (P > 0.05). In the BMSCs group, BrdU/Nestin positive cells were seen in the brain stratium at 1 week after transplantation; BrdU/GFAP and BrdU/NSE positive cells as well as TH positive cells rather than BrdU/TH positive cells were found in the brain stratium at 1 month after transplantation; after that, the number of BrdU/Nestin positive cells was reduced gradually and disappeared ultimately, but there were still a certain number of BrdU/GFAP and BrdU/NSE positive cells, especially the former ones. Meanwhile, the NSCs group also had a similar situation, but no double-labeled cells were in the normal saline group. These findings indicate that midbrain NSCs and BMSCs transplantation can both improve the behavior of Parkinson’s disease rats, and differentiate into neurons, astrocytes and dopaminergic neurons.

Key words: Parkinson Disease, Neural Stem Cells, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Neurobehavioral Manifestations

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析入组的58只帕金森病模型大鼠均进入结果分析。 2.2 中脑神经干细胞形态原代培养至24 h细胞均呈悬浮生长，圆形，大小不等，胞体透明，可见少量细胞碎片，72 h后细胞碎片增多，部分悬浮生长的细胞分裂或聚集为细胞团，即为神经球，每个神经球由几个到数十个细胞组成(图1)。2.3 骨髓基质干细胞形态原代细胞接种24 h后即有细胞贴壁，以后贴壁细胞数目不断增加，且有小的突起伸出，呈单个或多个细胞聚集。传代后的细胞生长迅速，三四天即可长满瓶底。通过传代，细胞得到进一步纯化，至3代以后，细胞形态趋于一致(图2)。

2.4 治疗前后大鼠行为学变化骨髓基质干细胞组和中脑神经干细胞组大鼠旋转次数较治疗前均显著下降(P < 0.05)，但治疗后第3，5个月骨髓基质干细胞组和神经干细胞组大鼠的旋转次数差异无显著性意义(P > 0.05)；生理盐水组大鼠的旋转次数较治疗前也出现一定的下降，但经比较差异无显著性意义(P > 0.05)；且治疗后第3，5个月生理盐水组大鼠的旋转次数显著高于同期骨髓基质干细胞组和神经干细胞组(P < 0.05)，见表1。 2.5 免疫组化染色结果分析移植后第1周，对骨髓基质干细胞组进行脑组织切片观察，可见移植的纹状体内有BrdU与Nestin双重染色细胞；移植后第1个月，被BrdU标记的细胞中，有部分在脑纹状体内出现星形细胞特异性标记物GFAP染色和神经元特异性标记物NSE染色；纹状体内存在TH阳性细胞，但经观察未出现明显BrdU/TH双标细胞；移植第1个月之后，BrdU与Nestin双重染色细胞数量呈现出逐渐减少的情况，最终基本消失，但仍然存在一定数量的BrdU/GFAP、BrdU/NSE双重染色细胞，BrdU/ GFAP阳性细胞数量则相对较多。同一时间，中脑神经干细胞组也存在类似情况，但生理盐水组经观察未发现双标细胞(图3)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至6月南阳市中心医院实验室完成。

1.3 实验动物及材料成年雄性SD大鼠68只，其中58只用于造模，10只用于骨髓基质干细胞分离培养，昆明小鼠10只用于中脑神经干细胞分离培养，均由南京君科生物工程有限公司提供。

中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞治疗帕金森病大鼠所用药品、试剂与仪器：
药品、试剂与仪器	来源
阿朴吗啡	国药控股湖南有限公司
40 g/L多聚甲醛	北京索莱宝科技有限公司
DMEM培养液	上海威奥生物科技有限公司
胶质细胞源性酸性蛋白(GFAP)小鼠单克隆抗体	武汉博士德生物工程有限公司
Nestin小鼠单克隆抗体	上海信裕生物技术有限公司
罗丹明	上海常斤生物科技有限公司
神经元特异性烯醇化酶(NSE)小鼠单克隆抗体	北京中山生物技术有限公司
溴尿嘧啶(BrdU)小鼠单克隆抗体	上海晶天生物科技有限公司
BrdU小鼠异硫氰酸荧光素抗体	上海士锋生物科技有限公司
酪氨酸羟化酶(TH)小鼠单克隆抗体	上海微蒙生物科技有限公司
荧光显微镜	上海蔡康光学仪器有限公司
石蜡切片机	大连光耀辉科技有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 帕金森病动物模型制作建立6-羟基多巴偏侧帕金森大鼠模型，具体方法参考Chen等^[9]的报道，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，头颅水平位固定于大鼠脑立体定向仪上，上切牙平面比耳间线平面低2.2 mm，保证前、后囟处于同一水平面，各个方向轻轻摇动证明头部固定可靠后进入下一步。剃除大鼠头顶部毛发，手术区消毒，于颅中部正中切开头皮和筋膜，剥离骨膜，使前囟充分暴露，参照包新民《大鼠脑立体定向图谱》确定右侧黑质致密部、中脑腹侧被盖部三维坐标位置，用牙科钻小心钻透颅骨，用微量注射器抽取6-羟基多巴溶液4 μL，每个坐标点各注射2 μL，注射速度1 μL/min，注射完毕停留10 min，缓慢拔针，明胶海绵覆盖钻孔，缝合皮肤、筋膜。于术后第2，3周，每周腹腔注射一次阿朴吗啡进行行为学检测，每次记录30 min，如果平均旋转圈数在7 r/min以上则视为造模成功。

1.4.2 实验分组将造模成功大鼠随机分为3组，分别设为骨髓基质干细胞组(20只)、中脑神经干细胞组(20只)、生理盐水组(18只)。

1.4.3 骨髓基质干细胞的分离培养参考Sanchez- Ramos等^[10]的报道，获取SD大鼠股骨和胫骨，剪去骨两端，PBS冲洗骨髓腔，将洗出的细胞悬液移入离心管，离心沉淀后用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液悬浮，接种于培养瓶内置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱进行孵育。待培养七八天细胞长满瓶底时进行传代培养，传至第3代时，用含BrdU培养液培养24 h，0.25%胰酶消化后收集于离心管中，离心之后弃上清，用PBS洗涤2次，收集于离心管中，用PBS重悬制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10¹¹ L^-¹备用。

1.4.4 中脑神经干细胞的分离培养参考叶民等^[11]的报道，取新生昆明小鼠中脑，剥离脑膜后将组织剪碎，用火焰刨光的玻璃吸管机械分离制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，添加含B27、碱性成纤维细胞生长因子的 DMFM/F12(1∶1)培养基置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱进行孵育，每3 d换液 1 次，每六七天传代1次。传至第3代时，用含BrdU培养液培养24 h，0.25%胰酶消化后收集于离心管中，离心之后弃上清，用PBS洗涤2次，收集于离心管中，用PBS重悬制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10¹¹ L^-1备用。

1.4.5 细胞移植

骨髓基质干细胞组：造模成功后3周，帕金森病大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，固定于脑立体定位仪上，选取右侧纹状体2个坐标点注入制备的骨髓基质干细胞悬液5 μL，注射速度为0.5 μL/min。注射结束后留针10 min，之后缓慢退针，明胶海绵覆盖钻孔，缝合皮肤、筋膜，常规注射抗生素预防感染。

中脑神经干细胞组：采用上述相同的方法，向两坐标点分别注入中脑神经干细胞悬液5 μL。

对照组：采用上述相同的方法，向两坐标点分别注入生理盐水5 μL。

1.4.6 行为学检测移植前和移植后3，5个月，大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿朴吗啡诱发向左侧旋转，记录每分钟内大鼠的旋转次数。

1.4.7 免疫组化荧光染色移植后第1周、第1，3，5个月，每组各取3只大鼠，处死后制作脑冰冻切片，片厚5 μm，依据实验目的对纹状体移植区脑切片和黑质区脑切片行组织学鉴定。

1.5 主要观察指标 ①行为学改变。②免疫组化荧光染色结果。

1.6 统计学分析利用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

帕金森病是一种临床较为常见的神经系统变性疾病，在中老年群体中具有较高的发病率^[12-13]。患者临床大多表现出不同程度的静止性震颤、肌强直、动作迟缓、姿势及步态异常等运动症状，并伴有各种非运动症状，包括焦虑、抑郁、痴呆、睡眠障碍、体位性低血压等^[14]。帕金森病起病时多为一个或一侧肢体发病，随时间推移波及对侧^[15-16]。常规治疗帕金森病方法包括保护神经、改善微循环，以及左旋多巴治疗等^[17-19]，但大多无法获得理想的治疗效果。随着干细胞技术的不断发展，临床开始积极尝试利用不同干细胞对帕金森患者进行治疗^[20-21]。目前，应用较多的两种干细胞分别为骨髓基质干细胞和神经干细胞^[22]。神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力^[23-25]，对于神经系统的发育、神经组织稳态的维持和损伤的修复起着重要的作用，其功能失调与许多神经退行性疾病的发生和发展密切相关^[26-28]。骨髓基质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具有多向分化的特点，在一定的体外环境下，可以发生分化和扩增^[28]。以往有学者对骨髓基质干细胞与神经干细胞移植治疗帕金森病相关问题进行了研究^[29-36]。Sevndsen等^[37]通过表皮生长因子和成纤维生长因子2联合诱导人神经干细胞移植单侧帕金森病大鼠模型的患侧纹状体中，移植20周后能减轻大鼠的运动障碍。本次研究发现，骨髓基质干细胞组和中脑神经干细胞组大鼠的旋转次数较治疗前均显著下降(P < 0.05)，但治疗后第5个月骨髓基质干细胞组和神经干细胞组大鼠旋转次数差异无显著性意义(P > 0.05)；生理盐水组大鼠的旋转次数较治疗前出现一定的下降，但经比较差异无显著性意义(P > 0.05)；且第5个月生理盐水组大鼠的旋转次数显著高于同期骨髓基质干细胞组和神经干细胞组 (P < 0.05)，结果表明，骨髓基质干细胞和中脑神经干细胞均可以对帕金森大鼠的行为学产生十分明显的影响，显著改善其临床症状。通过免疫组化荧光染色还发现，移植后第1周，骨髓基质干细胞组纹状体内有BrdU与Nestin双重染色细胞，移植后第1个月，被BrdU标记的细胞中，有部分在脑纹状体内出现星形细胞特异性标记物GFAP染色和神经元特异性标记物NSE染色；纹状体内存在TH阳性细胞，但经观察未出现明显BrdU/TH双标细胞；移植第1个月之后，BrdU与Nestin双重染色细胞数量逐渐减少，最终基本消失，但仍然存在一定的数量的BrdU/GFAP、BrdU/NSE双重染色细胞，BrdU/GFAP阳性细胞数量则相对较多。同一时间，中脑神经干细胞组也存在类似情况，但生理盐水组经观察未发现双标细胞。这一结果也提示，骨髓基质干细胞以及神经干细胞均可在大鼠脑内发生分化，形成神经元和神经元样细胞以及星形胶质细胞等^[38]。以上结果表明骨髓基质干细胞和神经干细胞积极的参与多巴胺神经的环路重建过程，从而影响大鼠相关行为学指标，达到减少其旋转次数的效果^[39-40]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程