脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖及PDX-1、MafA表达水平的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，以胰腺β细胞选择性破坏，导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征。脐血干细胞具有多分化潜能，在体内外均可以诱导分化为胰岛细胞，发挥出一定的降糖作用。

目的：探讨脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖水平及胰腺组织PDX-1、MafA表达的影响。

方法：30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，治疗组和模型组大鼠建立1型糖尿病模型，造模成功后，治疗组尾静脉一次性注射脐血干细胞，正常组给予相同体积的生理盐水，模型组给予相同体积的脐血干细胞缓冲液。采用口服葡萄糖耐量试验评价大鼠胰岛功能，苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺形态，Western blot 和PCR 检测胰腺组织PDX-1、MafA蛋白和mRNA表达。

结果与结论：①模型组和治疗组大鼠0，30，60，90 min的血糖值均显著高于正常组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；120 min时间点模型组血糖值显著高于正常组(P < 0.05)；治疗组则与正常组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。②模型组胰岛数量出现下降，边界模糊不清，呈不规则形态，治疗组胰岛数量出现一定的减少，但尚维持清晰的结构。③治疗组PDX-1及MafA表达水平与正常组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但显著高于模型组(P < 0.05)。以上结果表明，脐血干细胞可以显著降低1型糖尿病大鼠的血糖水平，改善胰岛功能及胰腺组织形态，并具有上调PDX-1、MafA表达的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 脐血干细胞, 1型糖尿病, 血糖, PDX-1, MafA

Abstract:

BACKGROUND: Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease, which is characterized as the selective destruction of pancreatic beta cells in the body, resulting in the lack of insulin secretion. Umbilical cord blood stem cells have the potential to differentiate into islet cells in vitro and in vivo, which play a certain hypoglycemic effect.

OBJECTIVE: To explore the effects of umbilical cord blood stem cells on blood glucose levels and PDX-1 and MafA levels in the pancreatic tissue of type 1 diabetic rats.

METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups, with 10 rats in each group. In treatment and model groups, type 1 diabetes mellitus modes were established. After modeling, the treatment group was given a single tail vein injection of umbilical cord blood stem cells; the normal control group was given the same volume of normal saline; the model group was given the same volume of umbilical cord blood stem cell buffer solution. Oral glucose tolerance test was adopted to assess the islet function of rats; hematoxylin-eosin staining was used to observe the pancreatic morphology of rats; western blot and PCR methods were employed to detect expressions of PDX-1 and MafA in pancreatic tissues at protein and mRNA levels.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal control group, the levels of blood glucose in the model and treatment groups were significantly higher at 0, 30, 60, 90 minutes (P < 0.05). At 120 minutes, the blood glucose level in the model group was significantly higher than that in the normal control group (P < 0.05), but there was no difference between the treatment and normal control groups (P > 0.05). (2) The number of islets in the model group was decreased, and the boundary was unclear and irregular; in the treatment group, the number of islets was decreased, but the boundary was still clear.(3) The expressions of PDX-1 and MafA in the treatment group were similar to those in the normal control group (P > 0.05), but significantly higher than those in the model group (P < 0.05). These findings suggest that the umbilical cord blood stem cell transplantation can significantly reduce the blood glucose levels in type 1 diabetic rats, improve the function of islet and morphology of pancreas, and up-reuglate the expressions of PDX-1 and MafA.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至6月在石家庄市第一医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性SD大鼠30只，4周龄，普通级，均由华南农业大学实验动物中心提供，许可证号：粤科函社字[2014]321号，均按照标准实验室条件进行常规喂养。实验方案和实验动物处死方法、相关伦理问题等均符合要求。

1.3.2 主要细胞、试剂与仪器脐血干细胞由石家庄市血液中心提供。四氧嘧啶(上海邦景实业有限公司)，PDX-1一抗(上海弘顺生物科技有限公司)，MafA一抗(北京美科美生物技术开发有限公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(上海抚生实业有限公司)，低温冰箱(上海索莱宝生物科技有限公司)，微量血糖仪(三诺生物传感股份有限公司)，光学显微镜(深圳市海量光电有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与模型建立将30只动物随机分为3组，每组10只，分别设为正常组、模型组和治疗组。治疗组和模型组大鼠均采用多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素进行1型糖尿病模型建立，注射剂量为40 mg/kg，1次/d，连续注射5 d。末次注射之后每周检测空腹血糖、尿糖。模型建立成功的标准参照文献[6]，以血糖≥11.4 mmol/L，尿糖(+++)以上14 d视为造模成功。

1.4.2 细胞移植造模成功后，治疗组尾静脉一次性注射脐血干细胞，细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，按照10 mL/kg给药。正常组予以相同体积的生理盐水，模型组予以相同体积的脐血干细胞缓冲液。注射完毕对3组大鼠进行常规喂养，观察动物的大体情况以及体质量变化情况等。

1.4.3 口服葡萄糖耐量试验细胞移植第16天，对大鼠进行口服葡萄糖耐量试验，试验方法参考文献[7]，按照标准灌胃操作方法给予葡萄糖溶液(2 g/kg)灌胃，服糖前空腹剪尾取血测血糖(认定为0 min的血糖值)，服糖后每30 min取血测血糖，共测量5次(即0，30，60，90，120 min的血糖值)，根据各次血糖值绘制糖耐量曲线。

1.4.4 组织标本收集和观察细胞移植第17天，颈椎脱臼处死大鼠，冰上分离获得完整胰腺组织，利用甲醛进行固定，双蒸水浸泡3次，每次15 min，梯度乙醇进行脱水、石蜡包埋后切片，苏木精-伊红染色，在高倍镜下观察胰腺组织病理改变。

1.4.5 Western blot法检测胰腺组织PDX-1、MafA蛋白表达对大鼠胰腺组织进行裂解和离心，收集上清，取各组蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束之后利用电转印法转移到PVDF膜上，室温环境下用5%脱脂奶粉封闭2 h。封闭结束添加兔抗小鼠PDX-1和MafA一抗，孵育过夜之后用TBST进行洗涤，添加羊抗兔lgG 抗体(辣根过氧化物酶标记)，孵育1 h之后再用TBST进行洗涤。利用化学发光液进行显色，经曝光、显影等处理之后获得胶片，妥善保存。

1.4.6 PCR法检测胰腺组织PDX-1、MafA mRNA表达^[8] 提取胰腺组织总RNA，冰上裂解，添加氯仿，混合均匀之后进行离心，添加异丙醇进行RNA沉淀。乙醇洗涤沉淀，最后溶解于经DEPC处理过的纯水中，进行反转录和PCR扩增，对扩增产物进行电泳。

各基因引物序列：
基因	引物序列(5’-3’)
β-actin	F：5’-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3’ R：5’-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3’
PDX-1	F：5’-GGT GCC AGA GTT CAG TGG TAA TC-3’ R：5’-CTT CCC TGT TCC AGC GTT CC-3’
MafA	F：5’-AGG AGG AGG TCA TCC GAC TG-3’ R：5’-CTT CTC GCT CTC CAG AAT GTG-3’

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠的一般情况。②各组大鼠不同时间口服葡萄糖耐量试验结果。③各组大鼠胰腺形态学表现。④各组大鼠胰腺组织PDX-1、MafA表达水平。

1.6 统计学分析数据录入SPSS 19.0软件，计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1型糖尿病以体内控制血糖的胰岛素完全缺乏为特征，以高血糖和酸中毒为主要临床表现^[9-10]。1型糖尿病可发生于任何年龄，儿童青少年群体尤为多见，因此1型糖尿病又被称为“儿童型糖尿病”，其发病机制与免疫失调、环境、遗传等因素相关^[11-12]。1型糖尿病患者需终身依赖胰岛素治疗，饮食和运动都受到了很大的限制^[6]。另外，对患者而言，还需要对自身血糖水平予以密切关注，定时进行监测，以维持良好的血糖控制效果^[13-15]，但是儿童患者大多年龄较小，自控能力不强，容易出现治疗依从性较低等情况，无法达到良好的血糖控制效果^[16]。干细胞理论和技术的发展为1型糖尿病的临床治疗带了新思路^[17-23]。其中，脐血干细胞可以通过分化形成胰岛样细胞，并分泌肝细胞生长因子等，达到促进机体胰岛功能增强的效果^[24-28]。本实验通过口服葡萄糖耐量试验显示模型组和治疗组大鼠0，30，60，90 min时间点的血糖值均显著高于正常组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；120 min时间点模型组血糖值显著高于正常组(P < 0.05)；治疗组则与正常组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，说明在经过脐血干细胞治疗之后，患病大鼠的血糖水平得到显著改善，并逐渐恢复至正常水平。胰腺组织经苏木精-伊红染色观察还发现，模型组胰岛数量出现下降，边界模糊不清，呈不规则形态，且可观察到少数胰岛融合，治疗组胰岛数量出现一定的减少，但尚维持清晰的结构。结果表明在经过脐血干细胞治疗之后，患病大鼠的胰腺功能均可以得到良好的改善。 PDX-1属于胰腺多基因调控网络中枢基因，与机体胰腺的发育等存在十分密切的联系^[29-31]。PDX-1的活化可以促进胰岛素细胞基因的表达，是脐血干细胞分化为胰岛素分泌细胞的重要前提条件^[32]。MafA是一个重要的转录因子，可以积极的维持胰岛素分泌以及正常的胰岛结构^[33-34]。MafA是胰岛β细胞特异性胰岛素转录调节因子，具有亮氨酸拉链结构，与胰岛素启动子上的顺式调节元件(RIPE3B)相结合，可能是胰岛素分泌、胰岛结构维护及胰岛素转录的一个重要的调节因子。慢性高血糖以及随后产生的氧化应激可降低胰岛素基因的表达及分泌，且胰岛素基因表达的下降伴随着MafA基因表达和DNA连接活性下降，抗氧化治疗也避免了因长期暴露于高血糖中造成的MafA基因表达和DNA连接能力下降。胰岛素基因转录的调节因子调节能力低下是最终造成β细胞功能减退的机制，氧化应激可减少胰岛β细胞内PDX-1和MafA的表达。通过 Western blot 和PCR检测发现，与正常组比较，模型组 PDX-1和MafA 表达水平均显著下降(P < 0.05)；治疗组PDX-1及MafA表达水平与正常组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但显著高于模型组(P < 0.05)，分析出现这一结果的原因，可能是脐血干细胞进入体内之后，可以对各种蛋白因子水平产生积极的影响^[35]。脐血干细胞具有极强的自我更新能力，在胰腺微环境下可分化为胰岛素分泌细胞，并促进内源性胰岛细胞的再生，从而重建胰岛功能，达到治疗疾病的目的。脐血干细胞在进入细胞核之后，可以与胰岛素基因启动子发生结合，通过相互作用与协调，促进胰岛素基因转录和表达的启动^[36-39]，并在协同作用下，对胰岛素的表达生成产生积极的促进作用^[40]。综上所述，脐血干细胞可以显著降低1型糖尿病大鼠的血糖水平，并上调PDX-1、MafA蛋白表达，获得一定的治疗效果，可以为临床脐血干细胞治疗糖尿病提供一定的参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程