端粒酶反转录酶基因电转染人羊膜间充质干细胞移植治疗糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：羊膜是胎儿出生后的废弃物，羊膜间充质干细胞具有取材方便、增殖能力强、无伦理学争议、免疫原性低等优势。

目的：通过端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因电转染人羊膜间充质干细胞移植到大鼠糖尿病模型，探讨其对糖尿病大鼠的疗效。

方法：分离培养人羊膜间充质干细胞，经hTERT基因电转染羊膜间充质干细胞，从50只SD大鼠中随机取10只作为对照组，剩余40只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素，建立糖尿病模型后，将建模成功的36只SD大鼠随机分为糖尿病组、人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组，每组各12只；人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组分别通过大鼠舌下静脉注射移植人羊膜间充质干细胞和经hTERT基因电转染羊膜间充质干细胞。移植后各组进行动态血糖水平监测，于移植后每周检测各组大鼠血浆胰岛素的浓度，胰腺切片苏木精-伊红染色观察病理变化。

结果与结论：移植后4周，与糖尿病组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组血糖水平明显下降(P < 0.05)，尤其是hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组的空腹血糖水平接近于对照组水平(P > 0.05)，而糖尿病组空腹血糖维持在较高水平；移植后6周，与糖尿病组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组的血浆胰岛素含量增加(P < 0.05)，胰腺病损程度减轻(P < 0.05)，hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组更明显(P < 0.05)。结果证实，提示hTERT转染的羊膜间充质干细胞移植能明显降低糖尿病大鼠血糖和减轻胰岛损伤，可以有效治疗大鼠糖尿病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 人羊膜间充质干细胞, 糖尿病, 空腹血糖, 胰岛素, 端粒酶反转录酶基因, 血糖监测, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: The amniotic membrane is the rejected material after birth. Amniotic mesenchymal stem cells are characterized as easy harvesting, strong proliferation ability, no ethical controversy, and low immunogenicity.

OBJECTIVE: To electrotransfer human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene into amniotic mesenchymal stem cells transplanted into diabetic rats and to explore its effect on diabetic rats.

METHODS: Human amniotic mesenchymal stem cells were isolated, cultured and electrotransferred by hTERT gene. Ten of 50 Sprague-Dawley rats were randomized selected as controls, and the remaining rats were used to establish diabetic models through injection of 45 mg/kg streptozotocin. Thirty-six model rats were randomized into model group, cell transplantation group and hTERT-transfected cell transplantation group, with 12 rats in each group. In the latter two groups, human amniotic mesenchymal stem cells and hTERT-transfected amniotic mesenchymal stem cells were injected via sublingual veins, respectively. After transplantation, blood glucose levels were monitored dynamically, and plasma insulin concentration was detected every week. Pancreas tissues were taken and cut into sections for histological observation using hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after transplantation, the blood glucose levels were significantly lower in the two cell transplantation groups than the model group (P < 0.05), and especially in the hTERT-transfected cell
transplantation group, the blood glucose level was close to the normal value (P > 0.05). However, the model group still had a higher blood glucose level. At 6 weeks after transplantation, compared with the model group, the plasma insulin concentration was significantly increased in the two cell transplantation group (P < 0.05), and the severity of pancreatic injury was also eased in these two groups (P < 0.05), especially in the hTERT-transfected cell transplantation group (P < 0.05). These findings indicate that hTERT-transfected amniotic mesenchymal stem cell transplantation can dramatically decrease blood glucose level and relieve pancreatic injury in diabetic rats, which is an effective method for treatment of mellitus diabetes in rats.

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Blood Glucose, Diabetes Mellitus

中图分类号:

R394.2

付建茹. 端粒酶反转录酶基因电转染人羊膜间充质干细胞移植治疗糖尿病[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(36): 5827-5832.

Fu Jian-ru. Telomerase reverse transcriptase gene transfection of human amniotic electrical mesenchymal stem cell transplantation for treatment of diabetes mellitus [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5827-5832.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠50只，随机取10只作为对照组，36只参与造模，死亡和感染4只剔除，最终计入结果分析的数量46只。 2.2 培养的羊膜间充质干细胞的形态起初培养的羊膜间充质干细胞呈贴壁生长，形态多样，呈梭形、多边形、星形、纺锤形或多角形等(图1A)。传至第2代后羊膜间充质干细胞贴壁速度加快，8 h几乎完全贴壁，细胞呈现均匀一致的成纤维细胞样，细胞多呈单层放射形状、长梭形或旋窝状生长，倒置显微镜下观察到，羊膜间充质干细胞平均直径约为15 μm，胞浆内含有丰富的中间丝，含有中等量的高尔基复合体、线粒体和致密体，胞浆周围有自噬空泡和胞饮小泡，细胞或细胞突起之间可见到细胞连接结构，见图1B。培养的羊膜间充质干细胞经流式细胞仪鉴定后可表达相应的标记物，确认培养细胞为羊膜间充质干细胞。2.3 hTERT基因转染后在羊膜间充质干细胞中的表达RT-PCR检测显示，电转染法介导hTERT基因转染羊膜间充质干细胞48 h后，结果显示出2条清晰条带，表明RNA质量好，利用紫外线分光光度仪器检测RNA在A_{260 nm}，A_{280 nm}处的吸光度值，结果显示A_{260 nm/280 nm}=1.8-2.0，表明RNA纯度较好，PCR产物检测鉴定结果表明：hTERT-羊膜间充质干细胞转染组在750 bp可见特异性条带，而人羊膜间充质干细胞移植组、糖尿病组检测中未见特异性条带表明无hTERT mRNA的表达，见图2。

2.4 羊膜间充质干细胞移植后各组大鼠血糖及血清胰岛素水平变化移植后4周，对照组血糖保持约4.0 mmol/L；糖尿病组血糖22-26 mmol/L可见明显升高；hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组血糖保持约7.01 mmol/L、人羊膜间充质干细胞移植组血糖保持约12.03 mmol/L均有降低，且hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组较人羊膜间充质干细胞移植组的血糖降低更明显(P < 0.05)，见表1。移植后6周，与糖尿病组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组的血浆胰岛素水平增加，胰腺病损程度减轻，与人羊膜间充质干细胞移植组相比较，hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组更明显 (P < 0.05)，见表2。 2.5 羊膜间充质干细胞移植后大鼠胰岛组织病理变化羊膜间充质干细胞移植后6周，各组大鼠胰岛组织有不同程度的损害，胰岛细胞坏死，胰岛边缘炎性细胞浸润，胰岛严重破坏，胰岛细胞见少，3组相比较而言，hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组的胰岛细胞反应可见明显减轻，且结构完整，胰岛细胞较多，移植后6周，与糖尿病组比较，人羊膜间充质干细胞移植组和hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组胰腺病损程度减轻，尤其是hTERT-人羊膜间充质干细胞移植组更明显些(P < 0.05)，见图3。

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