血管内皮生长因子165转染可促进脂肪间充质干细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管内皮生长因子是目前最重要的促血管新生因子之一，在脂肪移植中可促进移植物的血运重建，提高成活率。
目的：探讨血管内皮生长因子165基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的作用。
方法：利用目的片段重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒pAdEasy-1系统，包装病毒并测定滴度，同理包装空病毒。将包装成功的两种病毒液分别以100的最佳感染复数转染入脂肪间充质干细胞内，以未转染细胞为空白组。采用RT-PCR和Western blot法检测各组转染细胞中血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达，MTT法检测各组细胞的增殖情况。
结果与结论：实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白表达量高于对照组和空白组(P < 0.05)；实验组转染脂肪间充质干细胞后分裂增殖程度显著增加，与对照组和空白组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，结果表明腺病毒介导的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后可以持续表达目的蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 血管内皮生长因子165, 脂肪间充质干细胞, 脂肪移植, 血管化

Abstract:

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor is the most important pro-angiogenic factor, which can promote revascularization and survival of fat grafts during fat transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of vascular endothelial growth factor 165 transfection on the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Recombinant vascular endothelial growth factor 165 mRNA fragment was transmitted into adenovirus pAdEasy-1 systems that were packaged to measure viral titer (experimental group). Empty adenovirus was also packaged as control group. Two kinds of packaged adenovirus solution were transferred into adipose-derived mesenchymal stem cells at the best multiplicity of infection=100. Cells with no transfection served as blank group. RT-PCR and western blot methods were used to detect the expression of vascular endothelial growth factor 165 at mRNA and protein levels; MTT method was adopted to detect cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: The expressions of vascular endothelial growth factor 165 mRNA and protein were significantly higher in the experimental group than the control and blank groups (P < 0.05). The division and proliferation of transfected adipose-derived mesenchymal stem cells were increased significantly in the experimental group, which was significantly different from the control and blank groups (P < 0.05). These finding indicate that vascular endothelial growth factor 165 transfection cannot only sustain the target protein expression of adipose- derived mesenchymal stem cells, but also promote the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells remarkably.

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Vascular Endothelial Growth Factors, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

伞光，宋佳. 血管内皮生长因子165转染可促进脂肪间充质干细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(36): 5782-5788.

San Guang, Song Jia. Vascular endothelial growth factor 165 transfection promotes proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5782-5788.

图/表（结果） 4

2.1 腺病毒构建及包装结果通过基因测序显示VEGF165基因完全连入重组腺病毒载体，电泳显示Ad-VEGF165-IRES-EGFP-1和Ad-IRES-EGFP-1两种载体经PacⅠ酶切后全部出现了30 kb和3 kb大小2个条带，提示重组腺病毒载体均成功构建(图1)。经两组病毒转染的HEK293A细胞均观察到有大量绿色荧光表达(图2)，均出现相似的细胞病变效应，显示为细胞触角缩回、细胞肿胀变圆，一部分从贴壁上脱落并悬浮于显微视野中(图3)；滴度检测结果为2.9×10¹¹ pfu/L和2.4×10¹¹ pfu/L，符合转染要求。2.2 脂肪间充质干细胞培养形态接种时，含有大量的脂滴以及少量成纤维细胞和红细胞等成分，随着时间的延长及增加换液次数，这些杂质基本被清除干净。24 h后可见少数细胞开始贴壁，形态为大而扁平的单层细胞。48 h后大多数细胞均贴壁成功，并逐渐开始伸展，分裂，呈梭形。5-7 d后细胞逐渐融合成单层簇状分布。传代后的细胞多数为1个核仁(图4A)，也可双核出现(图4B)，核仁呈圆形或卵圆形。细胞平均扩增时间约为60 h。

2.3 脂肪间充质干细胞免疫组化鉴定选取第3代脂肪间充质干细胞进行免疫组化染色鉴定，结果显示：细胞CD44、CD49d抗原呈阳性表达(图5)；CD45、CD106抗原呈阴性表达(图6)。2.4 脂肪间充质干细胞成脂诱导鉴定选取第3代脂肪间充质干细胞进行成脂诱导，2周后细胞内开始有脂滴出现(图7)。成脂诱导组油红O染色阳性，对照组油红O染色为阴性(图8)。

2.5 病毒转染脂肪间充质干细胞结果实验组和对照组病毒液在荧光显微镜下均观察到较强绿色荧光表达，并且表达绿色荧光蛋白的脂肪间充质干细胞也较多，提示病毒转染效率较高；空白组在荧光显微镜下并未显现出任何荧光效应(图9)。 2.6 RT-PCR检测结果对照组、空白组脂肪间充质干细胞内VEGF165 mRNA表达的相对吸光度值为0.41±0.05和0.38±0.04，两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组VEGF165 mRNA表达的相对吸光度值为0.72±0.06，与另外两组相比差异有显著性意义(P < 0.05，图10)。2.7 Western blot检测结果实验组、对照组和空白组脂肪间充质干细胞内VEGF165蛋白表达相对吸光度值分别为1.04±0.09，0.36±0.07，0.30±0.04；其中对照组和空白组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组的相对吸光度值明显高于另外两组(P < 0.05，图11)。

2.8 转染后脂肪间充质干细胞增殖能力 3组细胞分别在培养24，48，72，96，120 h利用MTT法检测吸光度值，并绘制增殖曲线。结果显示，对照组及空白组的脂肪间充质干细胞生长速度较慢，两组相比较差异无显著性意义 (P > 0.05)；实验组脂肪间充质干细胞增殖程度显著增加，明显高于另外两组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明VEGF165可以显著提高脂肪间充质干细胞的生长增殖速度(图12)。

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引言

目前，由于创伤、切除术以及各种美容需求等多种原因所造成的软组织缺损修复是整形美容修复外科所面临的常见问题^[1-2]，临床上广泛应用真皮移植、胶原注射、游离脂肪组织及材料移植等多种方式治疗，但尚没有一种材料能够和人体自身的脂肪组织相媲美^[3-4]。自体脂肪移植截止到目前已经有100多年的历史，已在临床上广泛运用于美容整形和软组织缺损修复。有研究显示，在脂肪移植早期，移植物与受体之间的血供还没有完全建立，移植组织只能靠周围渗出的组织液来提供养分，而渗出的距离范围仅为100-200 μm，此时的移植物处于急性缺血缺氧环境中，移植脂肪的中央区出现大量的坏死空洞，随后坏死的脂肪组织逐渐被纤维结缔组织所取代^[5-7]。由此可见，自体脂肪移植早期及时建立血液循环对于移植脂肪的后期持续存活极其重要。为了提高移植脂肪的存活率，学者们把研究的焦点转移到干细胞方面，尤其是干细胞辅助下进行的脂肪移植^[8-9]。截止到目前，脂肪间充质干细胞辅助自体脂肪进行游离移植已经被证实可以提高移植脂肪在体内的存活率。相比于骨髓间充质干细胞来说，脂肪间充质干细胞被公认为是脂肪辅助移植的一个最佳选择。脂肪修复重建过程是脂肪细胞凋亡坏死与脂肪组织再生之间的一种动态的平衡过程，且这个过程总是伴随着毛细血管网络的改造重建。脂肪间充质干细胞可进一步分化成脂肪细胞或血管内皮细胞，同时释放部分促血管生成的生长因子，具有促进脂肪局部再生和血管新生的作用^[10-12]。有研究显示，颗粒脂肪移植存活率的提高与多种因子的作用均密切相关^[13-15]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前最重要的促血管新生的因子之一，在血管新生中起到极其重要的作用。在脂肪移植中可促进移植物的血运重建，提高成活率^[16-17]。实验拟采用VEGF165基因转染脂肪间充质干细胞，探讨其促进脂肪间充质干细胞增殖的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年6月在无锡坤如玛丽亚医院整形中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脂肪组织标本实验所需的脂肪组织样本均来自于实施腹部脂肪抽脂术者(均签署知情同意书)，性别年龄不限，无传染病及内分泌疾病病史，取脂肪抽吸物液体部分，冻存于无锡坤如玛丽亚医院整形中心实验室液氮库中。实验获得无锡坤如玛丽亚医院伦理委员会批准。

1.3.2 质粒、细胞、试剂质粒pCMV6-VEGF165(美国ATCC公司)，pAdEasy-1腺病毒系统、腺病毒滴度检测试剂盒(美国Stratagene公司)，DNA连接试剂盒、质粒小提试剂盒、切胶回收试剂盒、RT-PCR试剂盒、DNA/RNA Marker、限制性核酸内切酶(日本TaKaRa公司)，OPTI-MEM、Lipofectamine 2000、Trizol(美国Invitrogen公司)，超纯质粒提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，兔抗人VEGF165单克隆抗体、β-actin、羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，DH5α感受态细胞、HEK293A细胞(中科院细胞中心)。

1.3.3 引物实验所用引物的设计、合成及后期基因测序均由日本TaKaRa公司完成。

PCR引物序列：
名称	序列(5’-3’)
VEGF165-F	GAC GGA TCC ATG AAC TTT CTG CTC TCT TGG GTG C
VEGF165-R	TGA AAG CTT TCA CCG CCT TGG CTT GTC AC
β-actin-F	GGG ACC TGA CTG ACT ACC TC
β-actin-R	TCA TAC TCC TGC TTG CTG AT

1.4 实验方法

1.4.1 重组腺病毒载体的构建及包装利用设计完成的引物以含人VEGF165基因的质粒pCMV6-VEGF165为模版行PCR扩增反应(条件：98 ℃-10 s，55 ℃-10 s，72 ℃- 30 s，共进行30个循环；72 ℃-10 min，共进行1个循环)。切胶回收约580 bp的产物片段后利用SalⅠ/PstⅠ进行双酶切，经乙醇沉淀纯化后保存备用。以pAdEasy-1腺病毒系统中的pShuttle载体为底物模板建立一个双酶切的反应体系，切胶回收约8.9 kb的pShuttle载体大片段产物，将上述保存的片段利用连接酶与之相连，经重组后进一步筛选阳性克隆并测序，构建穿梭重组体(pShuttle-VEGF165- IRES-EGFP-1)；产物经PmeⅠ酶切后与BJ5183感受态细胞充分混合，放置电穿孔仪中电击1次，电击条件：200Ω，2.5 kV，25 μF，构建成pAd-VEGF165-IRES-EGFP-1重组体；经PacⅠ酶切后提纯大片段产物，通过Lipofectamine 2000作为媒介转染HEK293A细胞7 d进行包装操作，以EGFP作为示踪因子观察转染效果，反复冻融并离心获取Ad-VEGF165-IRES-EGFP-1病毒液，检测滴度后-80 ℃保存。同理包装对照病毒Ad-IRES-EGFP-1。

1.4.2 人脂肪间充质干细胞的培养及传代将通过抽脂术所获得的脂肪组织用PBS反复冲洗3次，再用0.25%Ⅰ型胶原酶于37 ℃水浴消化30 min，期间反复振荡3次。用与混悬液等体积的完全高糖DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清+1%双抗)终止消化，200目滤网过滤，去除尚未消化掉的纤维结缔组织，再用1 200×g离心5 min去除悬浮的杂质，弃掉上清液。1 mL完全培养基重悬细胞沉淀，另加入6倍体积的红细胞裂解液，室温孵育6 min，1 200×g离心5 min，弃掉上清，计数细胞，再以适量的培养基重悬沉淀，以1×10⁶/皿的密度接种于直径为10 cm的细胞培养皿中。每3 d换液1次，待细胞长至80%左右以1︰3的比例传代。传代时，吸走培养皿中的完全培养基，用PBS反复冲洗2次，加入适量的胰蛋白酶观察，待80%-90%的细胞触角回缩并变圆后，加入含有体积分数为10%胎牛血清的完全培养基终止消化反应，吹落贴壁的细胞，将混悬液全部移入15 mL离心管中，1 200×g离心5 min，弃掉上清液，重悬沉淀后再次接种于培养皿中。实验后续采用的均为第3代脂肪间充质干细胞。

1.4.3 脂肪间充质干细胞的免疫组化染色鉴定选取上述培养完全的第3代脂肪间充质干细胞，接种于置有盖玻片的6孔板内，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养至贴壁。PBS漂洗培养基3次；加入40 g/L多聚甲醛1 mL，室温下固定20 min (勿摇)；1 mL含0.5% Trinton-100的PBS渗透 5 min(勿摇)；加入体积分数为3%过氧化氢 50-100 μL，静止10 min；加入5% BSA 50-100 μL，封闭30 min；加入按1︰300比例稀释的一抗(CD45用于检测造血干/祖细胞及成纤维细胞，CD106用于排除骨髓干细胞)，4 ℃湿盒中孵育过夜；加入1︰300 稀释的二抗，室温静止30 min，37 ℃温箱内静止30 min；加入新鲜配制的DAB显色试剂(三抗)，室温静止20 min；苏木精复染后封固观察。

1.4.4 脂肪间充质干细胞成脂诱导分化鉴定选取培养的第3代脂肪间充质干细胞，接种到置有盖玻片的6孔培养板内，在37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下培养过夜。待细胞完全贴壁后，更换成脂诱导培养基(含谷氨酰胺、双抗、胰岛素、罗格列酮、地塞米松)，待细胞长至80%密度时换液，并设立对照组。培养2周后，取对照组和诱导组细胞进行油红O染色。

1.4.5 实验分组将包装成功的两种病毒液分别以100的最佳感染复数进行转染，24 h后观察转染效果，见表1。

1.4.6 RT-PCR检测VEGF165 mRNA表达分别提取各组细胞的总RNA，检测A₂₆₀/A₂₈₀的比值，均在1.8-2.0之间，然后进行RT-PCR反应(条件：50 ℃-30 min，94 ℃- 2 min，1个循环；94 ℃-30 s，60 ℃-30 s，72 ℃-1 min，30个循环)。反应结束后行琼脂糖凝胶电泳验证，凝胶成像系统分析各条带吸光度值，重复实验3次，分别计算相对吸光度值。

1.4.7 Western blot检测VEGF165蛋白表达提取各组细胞总蛋白并检测浓度；分别配制5%的浓缩胶与8%的分离胶，以60 V×30 min，150 V×1 h的条件进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后取下分离胶以100 mA×30 min进行转膜操作，转膜后以1︰1 500比例孵育一抗，4 ℃过夜，继续孵育二抗及显影液，室温避光孵育30 min，洗脱液终止显色，成像系统分析目的条带与内参照的吸光度值。重复实验3次，分别计算相对吸光度值。

1.4.8 MTT法检测各组脂肪间充质干细胞的增殖情况培养24 h后胰酶消化各组细胞，以2×10³/孔接种于96孔培养板上，每组细胞设10个复孔，培养24 h待细胞贴壁后每孔加入20 μL(5 g/L)MTT溶液，继续培养4 h，弃上清液，然后每孔加 200 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度值，并计算细胞生长增殖率。

1.5 主要观察指标 ①VEGF165 mRNA及蛋白的表达。②脂肪间充质干细胞的增殖情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件包对所得结果进行统计学处理，计量资料用x(_)±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义

讨论

3.1 种子细胞的来源随着基因转染、细胞移植和组织工程等技术的快速进步，基因治疗方法促进血管新生的研究已经取得了较大的进展。组织工程学的核心就是建立由种子细胞和支架载体构成的三维空间复合体并附有生长因子。其中，种子细胞的选择非常重要^[18-20]。有研究证实从骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞在体外条件下可持续大量的扩增并表现出了广泛的多向分化潜能。而鉴于脂肪组织与骨髓同属于中胚层组织，因此有研究者提出脂肪组织中也应该含有类似的干细胞成分，该假设被随后一系列的细胞实验所证实^[21-22]。近来有研究表明，脂肪间充质干细胞易于外源性基因的导入，可作为基因治疗的种子细胞，不管是腺病毒载体、质粒载体还是反转录病毒载体，均可携带目的基因转染脂肪间充质干细胞，并且在体内能够持续长期并且高效表达，而不影响其干细胞的特性^[23-24]。

3.2 生长因子的选择生长因子作为构建组织工程的三大要素之一，在促进缺损组织修复过程中起到极其重要的作用，其中促进局部血运重建的细胞因子显得尤为重要。在己发现的促血管新生的细胞因子中，VEGF是已知作用最强的血管形成因子之一。VEGF家族具有4种亚型存在，分别为VEGF121、165、189和206，其中VEGF165的活性最强，分布最为广泛，是在体内发挥生理作用的主要形式^[25-26]。 VEGF165通过旁分泌机制特异性的作用于血管内皮细胞，促进分裂，抑制凋亡，同时促进新的血管形成。首先，VEGF165通过肝素样分子的调节，与相应受体结合引起受体自身磷酸化，激活丝裂原活化的蛋白激酶，选择性增强内皮细胞的有丝分裂活性，刺激内皮细胞的进一步增殖并促进新血管的生成；此外，可以提高血管尤其是微小血管的通透性，为细胞的生长和新生侧支循环网的建立提供养分^[27-29]。综上考虑，实验选用VEGF165作为生长因子来促进脂肪组织的血管形成。由于VEGF165具有促进新血管再生的作用，使得许多学者考虑用VEGF165来作为生长因子治疗组织缺血性疾患。也有部分学者试图直接使用VEGF165蛋白来促进组织愈合，实验结果也显示了一定的疗效，但VEGF165蛋白半衰期很短，使得蛋白剂用于体内治疗受到了诸多的限制。若将外源基因导入种子细胞并使其在细胞内异位持续表达则可望避免上述的一些缺点。因此，多数学者提出应用局部组织表达VEGF165蛋白的基因疗法来达到促进组织血管的再生，加速组织的修复过程^[30-31]。 3.3 VEGF165联合脂肪间充质干细胞的共赢实验通过腺病毒载体介导把目的基因VEGF165转染到种子细胞内，研究结果显示，转染腺病毒载体后，脂肪间充质干细胞中VEGF165的mRNA和蛋白水平就已经有了显著表达，可保持在一个可检测出的水平之上，由此可以推测，目的基因在体内的表达时间持续数周或数月后消失，虽不适合于遗传病及肿瘤等慢性病的治疗，但对于组织缺损修复来说却比较合理，在一段时限内所表达的细胞因子对组织修复己足够，而又不必担心其过度表达引起组织过度再生、改建异常以及可能出现的致畸性和致瘤性。同样，当转染腺病毒24 h后，可发现脂肪间充质干细胞的增殖水平相对于对照组以及空白组来说有了一个明显的飞跃，可以由此推测出腺病毒承载的VEGF165基因转染脂肪间充质干细胞不仅可以持续的表达该目的蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖，达到一种双赢的效果，为后期将VEGF165联合脂肪间充质干细胞移植治疗组织缺损奠定了良好的体外实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程