人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (32): 5155-5161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013

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人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

肖建红¹，张阳春²，张常然¹，杨兴²

中山大学附属第一医院东院，¹普通内科，²下肢骨科，广东省广州市 510700

出版日期:2015-08-06 发布日期:2015-08-06
通讯作者: 张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700
作者简介:肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02)

Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification

Xiao Jian-hong¹, Zhang Yang-chun², Zhang Chang-ran¹, Yang Xing²

¹Department of Internal Medicine, ²Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China

Online:2015-08-06 Published:2015-08-06
Contact: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China
About author:Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81500091; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030310022; the Scientific Plan of Huangpu District of Guangzhou City, No. 201444-02

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。
目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。
方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 人来源的脂肪干细胞, 细胞分化, 脂肪组织, 细胞培养, 细胞鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research.
OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation.
METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).Human adipose-derived stem cells are positive for stem cell-related antigens, with low immunogenicity and the multi-differentiation potential. (4) Labeling human adipose-derived stem cells with DAPI is a simple efficient labeled method, and the labeling rate is high but the cytotoxicity is low.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: tem Cells, Subcutaneous Fat, Cell Differentiation, Cells, Cultured

中图分类号:

R394.2

肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5155-5161.

Xiao Jian-hong, Zhang Yang-chun, Zhang Chang-ran, Yang Xing. Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5155-5161.

图/表（结果） 3

2.1 人脂肪干细胞形态细胞刚接种时，培养物中混有大量的脂滴、未消化完全的脂肪组织和红细胞成分；接种24 h后首次换液，以上成分大部分被去除，显微下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，呈梭形、多角形、纺锤形成纤维样细胞，胞体较大，不透亮。接种48 h后，显微镜下可见细胞贴壁开始分裂增殖，多数细胞呈成纤维细胞样梭形，有的呈三角形，少量呈集落样生长，但也有少量圆形及卵圆形细胞生长。接种五六天时成纤维样细胞散在分布，呈集落样生长，呈同心圆状、漩涡状、放射状排列，集落中心细胞分布较密，外周较疏松。10-14 d时，可见约80%细胞融合。经过消化、传代，接种后即时观察，可见大量悬浮细胞散在分布，细胞小而圆，核透亮。接种后2 h，细胞开始贴壁，由小圆形向大圆形、多角形、梭形转变，有的有数个突起，突起个数和形态各异。接种后12 h，细胞基本贴壁。传代后，一般经过四五天细胞生长融合度可达80%，并呈漩涡状生长(图1)。细胞呈梭形，核居中，有单核或双核仁，核呈圆形或卵圆形(图2)。传代后平均扩增时间为 5 d。经一两次传代后，人脂肪干细胞形态较均一，增殖迅速，能稳定传代10代以上。 2.2 细胞生长动力学第2代及第5代细胞生长曲线形态相似，均呈S 形，人脂肪干细胞生长于第0-3天时处于起始期，第3天细胞增殖加速并进入对数生长期，第7天时生长达到高峰，以后进入平台期(图3)。根据生长曲线可知，细胞的群体倍增时间约为26 h，其平均扩增时间为5 d。

2.3 流式细胞仪检测人脂肪干细胞表面抗原标记物第2代人脂肪干细胞高表达CD29、CD44和CD105，阳性率分别为91.55%、99.22%和95.85%(图4A)。随着传代次数增加，第5代人脂肪干细胞CD29、CD44和CD105阳性表达率增加，分别为99.54%、99.78%和99.58%(图4B)。

第2代和第5代人脂肪干细胞均低表达或不表达造血系统及内皮系统抗原标记CD31、CD34、CD45、CD106及CD117。同时，人脂肪干细胞低表达免疫原性抗原标记CD14和CD71。以上表明，随着传代次数增加，阳性CD分子表达率越来越高，细胞愈加纯化。 2.4 人脂肪干细胞体外具有多向分化潜能 2.4.1 人脂肪干细胞成脂诱导分化第5代人脂肪干细胞贴壁生长80%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，诱导3 d后，细胞内开始有脂滴出现，光镜下可见部分细胞沿胞膜下出现环形细颗粒层。随着时间的延长，脂滴逐渐增大，颗粒逐渐增多变大，并向细胞核中央逼近，细胞仍呈梭形，但胞体变大、变宽，细胞两极变短。约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为扁圆形，诱导3周油红O染色显示有葡萄样红色脂滴(图5)。 2.4.2 人脂肪干细胞成骨诱导分化第5代人脂肪干细胞贴壁生长80%汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导培养三四天后，细胞体积开始增大，呈条索状；诱导1周后，细胞形态发生明显变化，由纺锤形逐渐转变为多角形，胞质内细胞颗粒明显增多；诱导2周后，细胞质内充满颗粒，细胞仍保持良好的增殖能力，细胞间可见钙质沉积；诱导3周后，细胞结节中心的细胞结构逐渐丧失，钙结节大量形成，经茜素红染色可见大量红色结节(图6)。 2.5 DAPI标记人脂肪干细胞荧光显微镜下，DAPI标记 1 d的人脂肪干细胞，细胞核可见明亮蓝色荧光，标记率达100%(图7)。DAPI标记细胞和未标记细胞的生长曲线无差异。

参考文献

[1] Gimble J, Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 2003;5(5):362-369.
[2] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12): 4279-4295.
[3] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001r;7(2):211-228.
[4] Cherubino M, Marra KG. Adipose-derived stem cells for soft tissue reconstruction. Regen Med. 2009;4(1):109-117.
[5] Zanetti AS, Sabliov C, Gimble JM, et al. Human adipose-derived stem cells and three-dimensional scaffold constructs: a review of the biomaterials and models currently used for bone regeneration. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(1):187-199.

[6] Kaewsuwan S, Song SY, Kim JH, et al. Mimicking the functional niche of adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Expert Opin Biol Ther. 2012;12(12): 1575-1588.
[7] Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 2012;30(5):804-810.
[8] Ong WK, Sugii S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2013;45(6):1083-1086.
[9] Torres FC, Rodrigues CJ, Stocchero IN, et al. Stem cells from the fat tissue of rabbits: an easy-to-find experimental source. Aesthetic Plast Surg. 2007;31(5):574-578.
[10] Peroni D, Scambi I, Pasini A, et al. Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells. Exp Cell Res. 2008;314(3): 603-615.
[11] Vieira NM, Brandalise V, Zucconi E, et al. Isolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Cell Transplant. 2010;19(3): 279-289.
[12] Caviggioli F, Vinci V, Salval A, et al. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. ANZ J Surg. 2009;79(11):856.
[13] Yang Q, Wang B, Yu H, et al. TLR7 promotes Th1 polarization in immune thrombocytopenia. Thromb Res. 2011;128(3): 237-242.
[14] Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochem Funct. 2008;26(6):664- 675.
[15] Chen X, Xu H, Wan C, et al. Bioreactor expansion of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2006;24(9):2052-2059.
[16] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol. 1990;143(3):420-430.
[17] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 2;284(5411):143-147.
[18] Strem BM, Hicok KC, Zhu M, et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 2005;54(3):132-141.
[19] Rubin JP, Marra KG. Adipose stem cell therapy for soft tissue reconstruction. Lancet. 2013;382(9898):1077-1079.
[20] Puissant B, Barreau C, Bourin P, et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 2005;129(1):118-129.
[21] Yañez R, Lamana ML, García-Castro J, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have in vivo immunosuppressive properties applicable for the control of the graft-versus-host disease. Stem Cells. 2006;24(11):2582- 2591.
[22] Cui L, Yin S, Liu W, et al. Expanded adipose-derived stem cells suppress mixed lymphocyte reaction by secretion of prostaglandin E2. Tissue Eng. 2007;13(6):1185-1195.

引言

干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透，干细胞组织工程已经成为最有影响力及最有应用前景的生命科学研究领域，其基本含义是指在体外对干细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成型等。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层。目前大部分的实验和临床前研究多集中在骨髓来源的间充质干细胞，但骨髓来源有限，抽取时给供者造成巨大痛苦，故有必要找到一种新的间充质干细胞来源。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞^[1-3]。研究表明，脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的生物学性质，它们在细胞形态、生长动力学、表面标志、多向分化潜能等方面无明显区别。脂肪干细胞还具有取材容易、并发症少、对机体损伤小及增殖能力强等优点，而且其来源广泛、体内储备量大、组织相容性好，逐渐成为近年来干细胞研究的新热点^[4]。此外，DAPI作为近年出现的一种标记物，其可与细胞核dsDNA稳定结合，掺入细胞的核酸序列中，且对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长，具有操作简便、安全、敏感等特点，目前被广泛用于标记移植干细胞。国内外对脂肪干细胞的研究开展较晚，其体外培养扩增和诱导成骨、成脂分化程度，及DAPI标记脂肪干细胞的效果如何，目前尚缺乏相关报道。本研究拟通过原代培养技术，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养，并进行成骨、成脂分化鉴定及DAPI标记，旨在为脂肪干细胞的进一步临床应用提供基础实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年5月至2014年1月在中山大学附属第一医院及中山大学医学院•公共卫生学院完成。

材料：选取中山大学第一附属医院整形外科行外科手术的健康志愿者5名，年龄20-35岁，女性，取其脂肪组织。

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定实验所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
L/H-DMEM培养基，青、链霉素双抗及0.25%胰酶(含0.02%EDTA)	美国Gibco公司
Ⅱ型胶原酶、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)及4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)	美国Sigma公司
二甲基亚砜	美国Amresco公司
抗人CD14，CD29，CD31，CD34，CD44， CD45，CD71，CD105，CD106，CD117抗体及同型对照抗体	美国BD Biosciences Pharmingen公司
苏木精、伊红、油红O	广州速聚生物公司
CCK-8试剂盒	上海同仁
CO₂培养箱	美国Thermo公司
倒置荧光显微镜	日本Nikon公司
Purifier class Ⅱ biosafety超净工作台	美国Terra Universal公司
低温离心机、ELITE流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司
-80 ℃超低温冰箱	美国Forma公司

实验方法：

人脂肪干细胞分离、体外培养：外科手术室无菌条件下取脂肪组织，迅速送至实验室，去除包膜和血管组织，无菌PBS冲洗3次以洗去红细胞，用显微剪剪成约1 mm³大小的碎块，加0.1%的Ⅱ型胶原酶于37 ℃摇床消化60 min，然后加入适量的L-DMEM完全培养基终止消化。将消化后的液体移至离心管中，200×g离心10 min，弃上清，用PBS重悬细胞，离心，去掉漂浮的脂肪细胞和脂滴，连续清洗2次，用L-DMEM完全培养基重悬细胞，接种于25 cm²培养瓶中，置体积分数为5%CO₂、饱和湿度、37 ℃培养箱培养，24 h后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3 d换液1次。待细胞生长至80%-90%融合后，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，按1︰3比例传代。传代后的细胞为第1代细胞，当细胞生长至80%-90%融合时，用上述方法再次传代，使细胞不断纯化和扩增。在倒置显微镜下对不同生长时期的贴壁细胞直接拍照，进行细胞形态学观察。

活细胞计数：①准备细胞计数板及制备待测细胞悬液。②染色：根据预计的细胞数不同，用0.4%锥虫蓝稀释细胞悬液至2×10⁵-2×10⁶ L^-¹，稀释后总量为1 mL。如稀释10倍，则取100 μL的细胞悬液+900 μL锥虫蓝，放入EP管内。③加样：用吸管轻吹打混匀细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加10 μL细胞悬液，加样时注意不要带有气泡，也不要溢出盖玻片。④计数：用10×物镜观察计数板四角大方格中的活细胞数(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)，细胞压线则只计左侧和上方者。⑤细胞浓度=(4大格细胞数之和/ 4)×稀释倍数×10⁷ L^-¹。

人脂肪干细胞的冻存：细胞生长融合度达80%-90%时，吸去上层培养基，PBS洗涤两三次。用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化细胞，1-3 min后用适量完全培养基中止消化。用吸管轻轻吹打细胞，使其从培养瓶壁上脱落。1 000 r/min离心5 min，弃掉上清，用PBS洗涤两三次，离心后弃上清，用细胞冻存液重新悬浮细胞，充分混匀，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，移入细胞冻存管，再将其移入细胞冻存盒中，于-80 ℃低温冰箱放置24 h后，最后移入液氮罐冻存。

细胞生长曲线的绘制：选取第2代及第5代细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，加入96孔培养板中，100 μL/孔，每个时间段设12个复孔，同时设6个调零孔(只加入等量培养基，无细胞)。分别于培养第1-7天轻轻吸取上清液20 μL，同时每孔加入CCK-8 20 μL，轻轻振荡混匀，继续培养4 h。用酶联免疫检测仪于波长570 nm处测定各孔吸光度值，复孔平均值与调零孔平均值的差值即为最终吸光度值。根据最终吸光度值绘制生长曲线。

流式细胞仪检测细胞表面抗原标记：选取第2代及第5代细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，取1 mL置于1.5 mL EP管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清后用300 μL流式洗液重悬细胞，按照说明书在不同的EP管加入抗人CD14-PE、CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PerCP、CD71-PE、CD105-PE、CD106-PE、CD117-PE抗体及同型对照抗体，4 ℃避光孵育30 min，离心后弃上清，用流式洗液1 mL洗2次，离心后弃上清，用500 μL流式洗液重悬细胞，上机检测。

人脂肪干细胞成脂诱导分化及鉴定：①人脂肪干细胞成脂诱导分化：选取第5代细胞，以4×10³/cm²的接种密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%时，吸去孔内培养液，成脂诱导组加入成脂诱导液2 mL，置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养。诱导分化3 d后，再用成脂诱导保持液处理1 d。如此循环3次后，用成脂保持液处理7 d，每隔3 d换液1次。对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM培养基。19 d后应用油红O染色法检测脂滴形成。②油红O染色：诱导至第19天时吸去成脂保持液，细胞爬片用PBS清洗3次，每次5 min。40 g/L多聚甲醛固定15 min。PBS洗涤3次，每次5 min。油红O染色15 min。60%异丙醇漂洗30 s，除去多余的染料。PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。

人脂肪干细胞成骨诱导分化及鉴定：①人脂肪干细胞成骨诱导分化：选取第5代细胞，以4×10³/cm²的接种密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%时，吸去孔内培养液，成骨诱导组每孔加入成骨诱导液2 mL，置37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，隔天换液1次，持续诱导3周。对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。3周后应用茜素红染色法检测钙沉积。②茜素红染色：诱导至第21天时吸去成骨诱导条件培养基，细胞爬片用PBS洗涤3次，每次5 min。40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS洗涤3次，每次5 min。茜素红染色液染色30 min。双蒸水洗涤5-10 s，洗3次。茜素红分化液洗涤15 s，洗1次。PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。

DAPI标记人脂肪干细胞：取第5代细胞，待细胞生长至80%融合时，更换新鲜培养基，将无菌的DAPI储存液加入培养的人脂肪干细胞上清中，至终质量浓度为50 mg/L，37 ℃培养箱中避光孵育1 h，弃去含有DAPI的培养液。加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基，常规培养24 h后，PBS洗涤细胞6次，以去除未与细胞结合的DAPI。荧光显微镜下计数视野中DAPI阳性细胞，同视野相差镜下计数视野中全部细胞，计算标记率=DAPI阳性细胞数/全部细胞数。离心收集细胞，用无血清的L-DMEM悬浮至移植所需浓度，置于冰上至少1 h备用。

DAPI标记后细胞活性检测：采用CCK-8方法观察DAPI标记后细胞活性。取第5代DAPI标记后细胞和未标记细胞，用L-DMEM完全培养基调细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，加入96孔培养板中，100 μL/孔，每个时间段设12个复孔。同时设6个调零孔(只加入等量培养基，无细胞)。分别于培养第1-7天轻轻吸取上清液20 μL，每孔同时加入CCK-8 20 μL，轻轻振荡混匀，继续培养4 h。用酶联免疫检测仪在波长570 nm处测定各孔吸光度值，复孔平均值与调零孔平均值的差值即为最终吸光度值。比较DAPI标记后细胞和未标记细胞每天吸光度值的变化。

主要观察指标：人脂肪干细胞形态、生长曲线、表面抗原标记物阳性率、成骨成脂诱导分化能力、DAPI标记后细胞活性。

统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。计量资料以x(_)±s表示，进行两独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，骨髓来源的间充质干细胞已经成为干细胞生物学领域的最重要细胞来源。但是，骨髓的抽取往往给供者造成较大痛苦，并且来源有限。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，由于其来源广泛、分离培养方法简单、扩增能力强等特点使其逐渐成为种子细胞的新来源^[5-7]。脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可继续扩增，易于大量获取，对供区组织的损伤也较小。目前取材多集中于脂肪含量较多的动物，尤其是对兔和大鼠皮下脂肪的分离培养^[8-9]。人体脂肪干细胞研究材料主要来源于吸脂术得到的液化脂肪^[10]，但抽脂术对皮下脂肪的加热液化过程可能会破坏组织的完整性，而且抽脂术有一定的危险性和死亡率。本实验通过外科手术获取脂肪组织应该更有利于干细胞的分离培养，也更具安全性，并且在取材时尤其应注意对脂肪组织的保护，如将其置于低温条件中，迅速送至实验室进行分离培养，保证了细胞的活力。脂肪干细胞的分离效率较其他干细胞高，平均300 mL脂肪组织可获得(2-6)×10⁸个有核细胞。在消化脂肪组织时，现有的实验方法常采用胶原酶或胶原酶与胰酶共同消化，消化时间从30 min-3 h不等。本研究采用单纯胶原酶消化、离心和换液来分离培养人脂肪干细胞，在实验过程中用显微剪将脂肪组织尽量剪碎成1 mm³，选用0.1%胶原酶Ⅱ37 ℃摇床消化60 min，不仅增加了脂肪组织与胶原酶接触面积，提高消化效率，而且缩短了胶原酶的作用时间，减少胶原酶的毒性，增加了消化后细胞的数量和活性。另外，传统的分离方法中通常加入了氯化胺(NH₄Cl)溶液裂解红细胞，然后再进行贴壁培养^[2]，但考虑NH₄Cl裂解红细胞的同时，可能会不同程度地影响目标细胞，故本实验未采用NH₄Cl溶液对分离出细胞预处理。为避免裂解液对脂肪干细胞的损伤，直接进行贴壁培养，用换液的方法去除红细胞和其他杂细胞。结果表明，细胞获得率与文献报道基本一致^[11]。体外增殖能力是评价干细胞的一个重要参数。实验分别检测了第2，5代人脂肪干细胞的生长曲线，结果显示在体外培养条件下人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律。研究结果显示，传代细胞比原代细胞增殖速度加快，但也存在1-3 d的潜伏期，第3天后细胞增殖快速，平均倍增时间为26 h，约7 d达到生长平台期，这与以往的文献报道一致^[12-13]。细胞扩增至第5代，仍然能够稳定保持快速增殖的能力，具有第2代细胞类似的生长曲线，细胞在体外可连续稳定传代10代以上，说明使用本实验的分离方法及扩增方法，能够维持人脂肪干细胞的增殖能力，易于获得大量有分化能力的细胞。通过流式细胞仪检测细胞表面抗原表明，第2代与第5代人脂肪干细胞均高表达CD29、CD44和CD105，显示其具有干细胞抗原的特性；而脂肪干细胞不表达CD31、CD34、CD45及CD117，证明其为非造血内皮类细胞，这与以往的文献报道一致^[10^，^14-15]。同时，人脂肪干细胞低表达免疫原性抗原标记CD14和CD106，表明它们具有极少量与移植排斥相关的抗原分子，提示脂肪干细胞具有低免疫原特性，可以进行异体移植。另外，随着连续传代，第5代细胞比第2细胞更纯，增殖能力更强。多向分化潜能是干细胞最重要的生物学特性，由于成体干细胞目前尚无特异性的表面抗原标记物，故需进一步进行多向分化潜能的鉴定。实验着重研究了人脂肪干细胞的成骨成脂分化潜能，对分离的人脂肪干细胞(第5代)分别进行了成骨和成脂诱导分化。成骨过程大致可分为3个阶段^[16]，即细胞增殖及基质分泌期、细胞外基质成熟期、细胞外基质矿化期，其中Ⅰ型胶原为早期骨形成的标志物，碱性磷酸酶常出现在基质成熟期，而细胞外基质矿化期最突出的表现为大量钙盐沉积^[2]。钙沉积是成骨细胞分泌的功能指标。茜素红钙结节染色可检测细胞内的钙沉积情况，可作为成骨细胞成熟的鉴定指标。本研究所用的骨诱导培养液，含有维生素C、β-甘油磷酸钠及地塞米松的成分，已经用于骨髓间充质干细胞的诱导成骨^[17]。与成骨过程相对应，在地塞米松对脂肪干细胞的增殖以及成骨分化全程调控下，维生素C参与早期Ⅰ型胶原的合成，β-甘油磷酸钠被细胞分泌的碱性磷酸酶水解而释放出无机磷从而参与细胞外基质矿化。最终经上述3者的联合干预，成骨过程基本完成。在成骨诱导3周后细胞基质矿化物形成明显，茜素红染色证实钙化结节形成，证实脂肪干细胞经诱导后能够分化为成骨细胞。除了进行成骨分化潜能研究以外，还对所分离获得的细胞进行了成脂诱导。成脂诱导的培养液里包含地塞米松、牛胰岛素、吲哚美辛和IBMX。高浓度的地塞米松 (1 μmol/L)和胰岛素、IBMX共同作用能激活细胞表面糖皮质激素受体，使其分化为脂肪细胞^[18]。诱导约3 d后，细胞体积增大，显微镜下可观察到胞质内有小的透亮脂滴，随着诱导时间延长，脂滴逐渐增多、增大融合，折光性增强，细胞核由细胞中央被挤到细胞的边缘位置。3周后油红O染色显示强阳性，可见细胞内含有大量的成葡萄样紫红色脂滴，证明脂肪干细胞经诱导后实现了向成脂分化，从而证实脂肪干细胞具有多向分化的潜能。综上所述，利用原代培养技术从人脂肪组织中成功分离培养出脂肪干细胞，其具有干细胞特性、低免疫原性，且具有多向分化潜能，并在多次传代后仍保持遗传稳定性。与文献报道一样，再次证实了脂肪干细胞无论从细胞形态、生长动力学、分离培养条件，还是从表面标志、多向分化潜能等方面均与骨髓来源干细胞无明显区别^[19]，更重要的是同样具有免疫调节作用^[20-22]。这种免疫调节能力在慢性炎症和自身免疫疾病的治疗中具有重大意义。与骨髓间充质干细胞相比较而言，脂肪干细胞具有以下优点：①取材方便，对供区影响小，并发症少。②分离培养简单，容易获得，增殖能力强，细胞移植不需在体外长期培养扩增。③来源相对充足，体内储备量大。④在诱导因子作用下具有定向分化能力。⑤组织相容性好，能适应体内环境，保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等。脂肪组织是人体内含量十分丰富的组织。随着肥胖症患者的增多，人类脂肪开始富余并渐成为累赘，利用脂肪抽提术提取脂肪分离干细胞，作为免疫治疗的种子细胞来源，具有重大的临床价值。因此，脂肪干细胞正逐渐成为干细胞在免疫治疗领域的研究热点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.