同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复尺骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着医学模式的不断发展进步，人们对于骨缺损的治疗以及后期康复水平提出了更高的要求，这就使得以干细胞培养为基础的骨组织工程技术成为骨缺损治疗中较为重要的组成部分。
目的：探讨同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复兔尺骨缺损的可行性。
方法：选取成年雌性新西兰兔70只作为研究对象，其中10只用于脂肪间充质干细胞的分离培养，60只采取随机数字表法分为单纯支架组、支架材料结合自体骨组、支架材料结合异体脂肪干细胞组，每组20只，均行尺骨中段部分切除，构建12 mm的骨缺损，然后植入相应的材料。植入材料6，9，12周测量骨密度，植入材料14周后观察3组坚固融合、非坚固融合、假关节形成比例。
结果与结论：支架材料结合异体脂肪干细胞组坚固融合比例显著高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著低于单纯支架组、支架材料加自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组坚固融合比例显著低于支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著高于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。支架材料结合异体脂肪干细胞组植入材料后第6，9，12周骨密度明显高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组骨密度明显低于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。结果表明同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复尺骨缺损效果确切，骨密度较高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 骨缺损, 同种异体, 骨密度, 纳米级胶原基骨

Abstract:

BACKGROUND: With the continuous development of medical model, high-level treatment and rehabilitation for bone defects are required. Therefore, bone tissue engineering technique based on stem cell culture has become a more important component of bone defect repair.
OBJECTIVE: To explore and analyze the feasibility of allogeneic adipose-derived stem cells combined with nano collagen-based bone for repair of ulna bone defects.
METHODS: Seventy adult female New Zealand rabbits were selected, 10 of which were used to isolate and culture adipose-derived stem cells, another 60 were randomized into scaffold group, scaffold+bone autograft group, scaffold+allogeneic adipose-derived stem cells group, with 20 rabbits in each group. The middle part of the ulna was resected to construct 12-mm bone defect models in the three groups, and then, corresponding materials were implanted. At 6, 9 and 12 weeks after implantation, bone mineral density was detected; at 14 weeks after implantation, the rates of solid fusion rate, non-solid fusion, and false joint were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other two groups, the rate of solid fusion was significantly higher and the rates of non-solid fusion and false joint were lower in the scaffold+allogeneic adipose-derived stem
cells group (P < 0.05). Compared with the scaffold group, the rate of solid fusion was higher and the rates of non-solid fusion and false joint were significantly lower in the scaffold+bone autograft group (P < 0.05). The bone mineral density increased dramatically at 6, 9, 12 weeks after implantation of scaffold+allogeneic adipose-derived stem cells, which was significantly higher than that in the scaffold group and scaffold+bone autograft group (P < 0.05). Compared with the scaffold group, the bone mineral density in the scaffold+bone autograft group was significantly higher (P < 0.05). These findings indicate that allogeneic adipose-derived stem cells combined with nano collagen-based bone has exact fusion effects with a higher bone mineral density.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Ulna Fractures, Bone Density

中图分类号:

R394.2

沈凌，王锡友，陈萍，于潼. 同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复尺骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5162-5166.

Shen Ling, Wang Xi-you, Chen Ping, Yu Tong. Allogeneic adipose-derived stem cells combined with nano collagen-based bone for repair of ulna bone defects [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5162-5166.

图/表（结果） 3

2.1 兔脂肪干细胞形态培养皿中原代兔脂肪干细胞在接种24 h后逐渐由组织团块中爬出，分散贴壁生长，开始多为圆形，部分细胞成角形、多边形等多种形态，色深(图1A)。

48 h后，细胞已基本完全贴壁，细胞分布均匀，呈小多角形或者短梭形，有时可见到较多的突起(图1B)。经过两三次的换液，可以完全筛除未贴壁的细胞。贴壁细胞逐渐伸展为梭形，随着细胞数量增加，形态变为长梭形，呈成纤维细胞样改变(图1C)。

5-7 d后细胞大量增殖，呈成簇分布，排列有方向性，可呈漩涡状生长。传代后细胞倍增时间变快，呈相对均一的梭形成纤维样细胞(图1D)。 2.2 兔脂肪干细胞诱导分化结果第3代脂肪间充质干细胞体外成骨诱导2周后，碱性磷酸酶染色(图2A)与茜素红染色(图2B)阳性；成脂诱导2周后，油红O染色(图2C)阳性。 2.3 纳米级胶原基骨材料形貌大体观纳米级胶原基骨材料为立体多孔状，孔隙率和孔径大小良好。扫描电镜观察脱钙骨结构疏松，孔隙大且相互交通，呈多孔网状结构，平均孔径为(348.98±51.68) μm，孔隙率为(87.87±1.55)%，孔沟通率为85%以上(图3)。 2.4 实验动物数量分析选取成年雌性新西兰兔70只作为研究对象，其中10只用于脂肪间充质干细胞的分离培养，60只用于动物造模，无脱落现象。

2.5 各组手触实验结果比较支架材料结合异体脂肪间充质干细胞组坚固融合比例显著高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著低于单纯支架组、支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组坚固融合比例显著低于支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著高于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)，见表1。

2.6 各组材料植入后骨密度对比支架材料结合异体脂肪间充质干细胞组植入材料后第6，9，12周骨密度明显高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组植入材料后第6，9，12周骨密度明显低于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年2月至2015年1月在北京中医药大学东直门医院中医内科学重点实验室完成。

材料：

同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复兔尺骨缺损实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
LG-DMEM	Gibco 公司
Ⅰ型胶原酶	Washington Biochemical 公司
ascorbate-2-phosphate、 β-glycerophosphate、地塞米松、茜素红	Sigma 公司
利多卡因	Merck 公司
TE300 型倒置相差显微镜	Nikon 公司
精密天平	Mettler Toledo 公司
超净工作台	北京医疗器械公司
恒温摇床	太仓市华美生化仪器厂
64 排螺旋 CT	中国中医科学院广安门医院骨科

实验动物：成年雌性新西兰兔70只，由中国中医科学院动物中心提供，其中10只用于脂肪间充质干细胞的分离培养，60只采取随机数字表法分为单纯支架组，支架材料结合自体骨组，支架材料结合同种异体脂肪间充质干细胞组，每组20只。

单纯支架组兔龄3-5个月，平均(4.2±0.7)个月，体质量2.5-5.0 kg，平均(3.4±0.5) kg。

支架材料结合自体骨组兔龄3-5个月，平均(4.4±0.6)个月，体质量2.5-5.0 kg，平均(3.5±0.6) kg。

支架材料结合同种异体脂肪间充质干细胞组兔龄3-5个月，平均(4.6±0.5)个月，体质量2.5-5.0 kg，平均(3.6±0.4) kg。

3组新西兰兔一般资料差异无显著性意义，具有可比性。

实验方法：

同种异体脂肪干细胞分离与培养：在新西兰兔耳缘静脉输注戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉成功后于腹部做正中切口，严格无菌操作下切下两肩胛骨旁的脂肪垫，缝合切口，纱布覆盖。将切下的脂肪组织放入含抗生素的PBS中，仔细剔除小血管，然后将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，连同Ⅰ型胶原酶一起加入旋转瓶中消化25 min，转速设置300 r/min^[5]。脂肪组织变成匀浆后吸出，用300目钢网过滤，在DMEM培养基中重悬，接种于培养瓶中。72 h后换液，去除未贴壁细胞，待细胞生长至70%-80%汇合时传代^[6]。

脂肪干细胞成骨、成脂诱导分化：取第3代脂肪干细胞进行成脂、成骨诱导分化。①成骨诱导：以3×10³/cm²的密度接种于6孔板中，24 h后换成骨诱导液(生长培养液，0.01 μmol/L 1，25-dihydroxyvitamin D3，50 μmol/L ascorbate- 2-phosphate，10 mmol/L β-glycerophosphate)进行培养，每周换液2次。诱导2周后进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，倒置相差显微镜对染色结果进行观察、拍照。②成脂诱导：以3×10³/cm²的密度接种于6孔板中，24 h后换成脂诱导液(生长培养液，0.5 mmol/L isobutyl- methylxanthine (IBMX)，1 µmol/L 地塞米松，10 µmol/L insulin，200 µmol/L indomethacin)进行培养。每周换液 2次，成脂诱导2周进行油红O染色，倒置相差显微镜对染色结果进行观察、拍照。

纳米级胶原基骨材料的制备：实验所用的纳米级胶原基骨材料由上海国家组织工程中心提供，为髂骨脱钙处理后所得，脱钙率为75%-85%。大体观为立体多孔状，孔隙率和孔径大小良好。扫描电镜观察脱钙骨结构疏松，呈网状。将所得的脱钙骨修剪成5 mm×5 mm×15 mm的长方体，置于培养皿中备用。临用时将该支架材料用紫外线照射30 min，体积分数为75%乙醇浸泡消毒过夜，PBS漂洗3遍，在生长培养液中37 ℃孵育过夜。接种细胞前在倒置相差显微镜下观察培养液中无细菌或真菌生长后，即可用于接种细胞。

同种异体脂肪干细胞与纳米级胶原基骨材料的复合：纳米级胶原基骨材料用PBS漂洗数次，去除表面粉末后用体积分数为75%乙醇浸泡30 min，然后用含体积分数为20%胎牛血清的培养基预湿24 h，增加细胞间黏附。取第3代或者第4代脂肪干细胞，胰酶消化，在旋转瓶中用120 mL完全培养基重悬^[7]，以3×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于纳米级胶原基骨材料中，培养箱孵育4 h后加入生长培养液，第2天换成骨诱导液诱导2周。

尺骨缺损模型制备：术前禁食水6 h，戊巴比妥钠进行静脉麻醉，腰骶部以体积分数为75%的乙醇浸泡消毒、固定、剪毛、敷无菌手术粘贴巾，沿尺骨中断切开，显露尺骨并在尺骨中段构建12 mm的骨缺损并确保骨膜剔除完全。按照分组的不同，分别植入不同的材料，逐层缝合切口。术中给予青霉素静脉滴注，抗感染，补充血容量。

主要观察指标：①植入材料14周后，手触实验检测活动度，按Boden的标准，评价融合程度。②植入材料6，9，12周后，动物麻醉后固定于骨密度仪上，运用小动物骨密度测量软件测量骨密度。

统计学分析：采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ²检验，计量资料采取t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

作为目前临床骨外科十分常见的疾病，临界大小的骨组织缺损发病率逐年增加，占骨外科门诊的15%，其高发病率与高致残率给患者以及患者家属带来了极大的社会负担^[8]。通常由于严重创伤、感染以及肿瘤因素引起骨组织失去连续性，使得机体无法得到保护与支撑，对人体的健康造成了严重危害^[9-10]。对于骨组织缺损的临床治疗，目前临床上多以自体骨移植融合术为主，自体肩胛骨、髂骨移植是主要的骨来源，自体骨移植虽然可以避免各类免疫排斥反应的发生，但是例如供应区疼痛、感染、出血等多种并发症在所难免^[11-12]。有国外研究指出同种异体脂肪间充质干细胞复合纳米级胶原基骨材料应用于临界大小的骨组织缺损的融合效果较以往传统治疗方法效果较佳，可能是一种代替传统治疗方法的理想治疗方式^[13-14]。脂肪干细胞在人体内广泛存在，且通过简单的抽脂手术很容易获得大量的种子细胞，取材部位无明显并发症，因而患者很容易接受^[15-19]。脂肪干细胞的分离培养方法也较为简单易行，而且其多系分化潜能也较佳，能够向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞甚至是心肌细胞分化，因而脂肪干细胞已成为组织工程中常见的种子细胞^[20-21]。纳米级胶原基骨材料是在仿生学原则下指导合成的一种以磷灰石、胶原等材料制成的仿骨材料，抗压能力强同时排斥反应较轻，是目前新兴的骨伤治疗材料。研究表明成骨细胞可以在这种材料上可以实现良好的黏附、增殖及迁移。本院针对同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料应用于临界大小的骨组织缺损展开研究，已取得一定成果^[22-24]，研究结果显示，支架材料结合脂肪干细胞组坚固融合比例显著高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著低于单纯支架组、支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组坚固融合比例显著低于支架材料结合自体骨组，非坚固融合及假关节比例显著高于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)，提示脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料治疗可以显著提高坚固融合率，较以往治疗方法骨融合更好，效果更佳。另外，研究结果显示，支架材料结合脂肪干细胞组植入材料后第6，9，12周骨密度明显高于单纯支架组、支架材料结合自体骨组(P < 0.05)。单纯支架组植入材料后第6，9，12周骨密度明显低于支架材料结合自体骨组(P < 0.05)，提示异体脂肪间充质干细胞复合纳米级胶原基骨材料治疗后新生骨质骨密度亦提升明显，对患者今后生活质量提高有重要帮助^[25-27]。在以后研究中应进一步对其在临界大小骨组织缺损的治疗机制进行研究，通过更为广泛深入的研究以确切了解此种治疗方式的效果^[28-30]。综上所述，同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料细胞应用于新西兰兔尺骨缺损，骨生成良好，融合效果确切，骨密度较高，可作为一种理想方法应用于临床工作中。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程