脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实干细胞在体内体外均可被诱导分化成多巴胺能神经元，这为干细胞移植治疗帕金森病提供了理论基础。
目的：探讨脑内移植脐血间充质干细胞治疗帕金森病模型大鼠的可行性及作用机制。
方法：SD大鼠脑内注射6-羟基多巴建立帕金森病模型，将22只造模成功大鼠随机分为脐血间充质干细胞移植组12只和对照组10只，脑内分别注射脐血间充质干细胞悬液和磷酸盐缓冲液。细胞移植后第1-8周，每周腹内注射阿朴吗啡观察大鼠旋转行为，并于第2，8周取大鼠纹状体和黑质部分行免疫组织化学染色。
结果与结论：①脐血间充质干细胞移植组大鼠转圈次数随着时间延长逐渐下降，而对照组大鼠转圈次数没有明显改变，且移植后3-8周两组旋转圈数差异有显著性意义(P < 0.05)。②移植后2周时，脐血间充质干细胞移植组大鼠纹状体针道内及附近有酪氨酸羟化酶阳性细胞存在；对照组大鼠的纹状体针道处无外源性细胞存在。移植后8周时，脐血间充质干细胞移植组鼠纹状体针道内仍有细胞存活，并有酪氨酸羟化酶阳性细胞存在，对照组大鼠纹状体处无酪氨酸羟化酶阳性细胞表达。结果表明脐血间充质干细胞移植后可在脑内存活并且表达酪氨酸羟化酶蛋白，且能改善帕金森病模型大鼠的行为学异常。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 脐血间充质干细胞, 帕金森病, 大鼠, 6-羟基多巴, 阿朴吗啡, 旋转行为

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells can be induced to differentiate into dopaminergic neurons in vivo and in vitro, which provides a theoretical basis for stem cell transplantation in the treatment of Parkinson’s disease
OBJECTIVE: To explore the feasibility and mechanism of intracerebral transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells for treatment of Parkinson’s disease rats.
METHODS: Intracerebral injection of 6-hydroxydopamine was used to make Parkinson’s disease models in SD rats. Twenty-two model rats were randomized into cell transplantation group (n=12) and control group (n=10) and respectively injected intracerebrally with umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension and PBS. At 1-8 weeks after cell transplantation, intra-abdominal injection of apomorphine was performed every week to observe the rotation behaviors of rats; at the 2nd and 8th weeks, rat’s striatum and substantia nigra were taken for immunohistochemistry staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The rotation behaviors were gradually decreased with time in the cell transplantation, but had no changes in the control group. At 3-8 weeks after transplantation, there were significant differences in the rotation behaviors between the two groups (P < 0.05). At 2 weeks after transplantation, tyrosine hydroxylase-positive cells were found within and around the striatum of the cell transplantation group; but there were no exogenous cells in the control group. At 8 weeks after transplantation,
there were still active cells and tyrosine hydroxylase-positive cells in the striatum of cell transplantation group, and there was no tyrosine hydroxylase expression in the striatum of the control group. These findings suggest that transplanted umbilical cord blood mesenchymal stem cells can survive in the brain that are positive for tyrosine hydroxylase, which can improve the behavior abnormalities of Parkinson’s disease rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Parkinson Disease, Hydroxydopamines, Rotation

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

帕金森病是中老年人较常见的中枢神经系统变性疾病，以静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直和姿势步态异常为主要特征的锥体外系疾病。帕金森病主要多发于中老年人，尤其是老年人，随年龄增高，其患病率也随着增加，而且男性患者稍多于女性。

帕金森病主要是黑质中的多巴胺能神经元细胞发生病理性改变，黑质纹状体多巴胺通路变性，黑质内部多巴胺的合成减少，导致纹状体内多巴胺能神经元严重缺失，其缺失的幅度与患者临床表现的严重程度呈正相关。纹状体内主要有多巴胺与乙酰胆碱两大递质系统，两者功能相互拮抗，其动态平衡在基底节调节过程中起着非常重要的作用。动态平衡一旦被打破就会导致皮质-基底核-丘脑-皮质环路活动紊乱，产生肌张力增高、动作减少等运动症状。通俗说就是黑质细胞像一个加工厂一样能够产生多巴胺，如果加工厂及运输路线遭到毁坏，那么脑内纹状体内的多巴胺减少，乙酰胆碱系统递质相对增多，功能亢进，脑内的另一个部位苍白球就会异常活跃，因此出现帕金森病的主要临床症状。

传统帕金森病的治疗主要依赖于药物，其治疗帕金森病的原理是增加脑内多巴胺的含量，纠正上述的递质失衡，从而减轻苍白球的过度活动，使得患者的症状减轻。从目前来看，美多巴为左旋多巴与苄丝肼按比例混合而成的成品，不仅可以阻止外周多巴脱羧成多巴胺，使血中有更多的多巴进入脑内变成多巴胺，还可减少或消除外周不良反应。当体内不能产生多巴胺这种物质时，可以通过外界给予补偿的方式来满足身体的正常需求，维持身体的正常功能。当然还有其他一些种类的药物是保护性治疗，包含金刚烷胺、单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚甲基转移酶抑制剂等，其作用机制是通过间接方式促进多巴胺的生成或者减少多巴胺的分解，增加纹状体内递质浓度，改善两种递质平衡，从而缓解症状。但药物治疗几乎都存在着不良反应多和长期应用后药效衰减(症状波动和异动症)的缺点。

立体定向手术治疗帕金森病主要是通过立体定向固定苍白球靶位，手术方法降低其兴奋性，以此来达到缓解临床症状的目的。此外还可以进行脑深部核团刺激术，就是移植电极于脑内固定靶位后，刺激剩余的神经细胞来提高产生多巴胺物质的速度，增加多巴胺物质浓度，改善两种递质平衡，达到改善症状的目的。但是手术也仅是改善临床症状，不能根治帕金森病，并且术后仍需要服用药物，手术过程还存在脑组织损伤及其他不可知的风险。

目前应用于治疗帕金森病的干细胞主要有胚胎干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。胚胎干细胞因具备无限增殖与分化的能力，而且可以体外培养、扩增，但伦理学、来源缺乏等问题限制了其应用。神经干细胞因其可大量获得神经细胞而在治疗神经系统疾病方面具有绝对的优势，但同样涉及取材、培养及免疫原性等问题。间充质干细胞不仅免疫原性弱、取材方便、来源广泛，而且具有免疫调节作用，被认为是目前干细胞治疗相对首选的细胞群。在临床及动物实验中应用最多是来源于脐血和骨髓的间充质干细胞，且脐血间充质干细胞在很多方面优于骨髓间充质干细胞：首先，脐血间充质干细胞移植过程受感染概率较骨髓间充质干细胞少；其次，脐血的免疫原性弱，白细胞抗原Ⅱ(HLA-Ⅱ)类抗原表达率低，几乎没有抗体，移植后排异反应弱或基本不出现，移植物抗宿主病出现少且轻^[1-4]；另外，脐血间充质干细胞比骨髓间充质干细胞形态更为原始，其自我繁殖能力及繁殖速度都强于其他干细胞。本研究探讨脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠的可行性及可能的机制，为临床应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年7月至2011年4月在山东省交通医院再生医学实验室、聊城市人民医院神经生物学实验室完成。
材料：

脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病实验所用主要仪器：
仪器	来源
SR-6N立体定位仪	日本NARISHGE公司
95-1型磁力加热搅拌器	上海司乐仪器厂
EG-1140C自动包埋机、CM 1900型冰冻切片机	德国Leica公司
10 µL微量注射器	美国Hamilton公司
SR-6N牙科钻	日本NARISHGE公司
YP15KN电子分析天平	上海精密科学仪器公司
Miller-Q Synthesis型超纯水制备系统	法国Millipore公司
TMB4-Accuric6流式细胞仪	北京中西科技有限公司
LSZBJS-357精密光学平台	江西连胜实验装备有限公司
BX51型倒置相差显微镜	日本Olympus公司
Image-Pro Plus4.5.0.19软件图像分析系统	美国Media Cybernetics公司

实验动物：选取健康SD大鼠60只，雌雄各半，6-8周龄，体质量250-320 g，由山东省鲁抗医药股份有限公司提供。

实验方法：

建立帕金森病大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥 (4 mL/kg)麻醉大鼠，麻醉平稳后，将大鼠俯卧位固定于立体定向仪上。常规消毒头顶皮肤，剪去手术区头顶毛发，手术刀正面切开头顶皮肤，切开范围在两外耳道中线连线前后各0.5 cm，用眼科剪剪去或刀片刮除颅骨表面的结缔组织膜，少量出血时用棉棒压迫止血，稍后干燥，清晰可见前囟、后囟。以前囟为标准参考点，确定右侧黑质致密部(SNC)(前囟后4.4 mm，矢状缝右侧1.2 mm，硬膜下7.8 mm) 和中脑腹侧被盖(VTA)(前囟后4.8 mm，矢状缝右侧1.0 mm，硬膜下7.8 mm)，使用牙科钻头，钻头直径0.8 mm，用笔式小电钻小心钻透颅骨。向右侧黑质致密部和中脑腹侧被盖每点注射3 g/L的6-羟基多巴5 μL，注射速度1 μL/min，注射完毕后留置针10 min，缓慢退针1 mm/min。牙科胶覆盖钻孔，常规缝合伤口。术后大鼠连续1周腹腔注射青霉素3×10⁴U/d以预防感染。于术后第2周开始筛选造模成功大鼠，即每周腹腔注射一次阿朴吗啡(0.05 mg/kg)诱导其向健侧旋转，共筛选3周，每次记录30 min，旋转210圈以上者为帕金森病大鼠。将22只造模成功帕金森病大鼠随机分为2组，脐血间充质干细胞组12只，对照组10只。

脐血间充质干细胞制备：脐血采集自聊城市人民医院产科健康足月胎儿(产妇及家属均知情同意并签署知情同意书，并且通过医院伦理委员会审核)，每例60-120 mL，医用生理盐水洗涤3次后，制备成干细胞悬液制剂，摇匀，接种于含体积分数为15%马血清和体积分数为15%胎牛血清的低糖DMEM中，置37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，首次于5-7 d后半量换液传代，以后每两三天半量换液传代。细胞生长至融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，吹打成单细胞悬液，1 000×g离心力离心5 min，去上清，加入PBS重悬，收集细胞悬液到PCR管，1 000×g离心力离心5 min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度达1.0×10¹² L^-¹。

细胞移植：造模成功后3周，2组大鼠分别注射同体积的脐血间充质干细胞悬液及PBS，在纹状体内确定两个注射靶点：①前囟后1.0 mm，中线右3.0 mm，硬脑膜下5.0 mm。②前囟后1.0 mm，中线右3.4 mm，硬脑膜下4.5 mm。微量注射器固定于立体定向仪上，垂直注射位点，脐血间充质干细胞组每点注射5 μL(含脐血间充质干细胞1.0×10⁶)，注射速度1 μL/min，注射后留置脑内10 min，缓慢退针(1 mm/min)。对照组与脐血间充质干细胞组移植的靶点一致，注射同体积的PBS。术后实验动物在动物房内正常饲养, 连续1周腹腔注射青霉素3×10⁴ U/d预防感染，注意保暖、饮水。

行为学检测：细胞移植后第1-8周，每周1次腹内注射阿朴吗啡0.05 mg/kg诱导大鼠向健侧旋转，注射10 min后开始观察，并记录大鼠的旋转圈数，共记录30 min，计量数据进行严格的统计学处理。

组织取材及酪氨酸羟化酶的免疫组织化学染色：于细胞移植后第2，8周两组各取2只大鼠脑组织行免疫组织化学染色，大鼠过量麻醉，经心脏从胸主动脉滴入200 mL生理盐水，然后灌注40 g/L多聚甲醛200 mL进行内固定，断头取脑，浸泡于40 g/L多聚甲醛24 h以上进行外固定，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、常规石蜡切片，片厚5.0-6.0 μm，显微镜观察纹状体和黑质部分组织酪氨酸羟化酶的表达。

主要观察指标：细胞移植后大鼠旋转圈数，脑组织纹状体及黒质酪氨酸羟化酶的表达。

统计学分析：所有资料应用SPSS 17.0软件包处理，数据以x(_)±s表示，计量资料采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

帕金森病病理改变的解剖位置主要是位于黑质、苍白球、纹状体(尾状核及壳核)和蓝斑内，其中黑质致密区多巴胺能神经元变性丢失最为严重，如果出现临床症状时细胞损伤至少达50%以上，其他如蓝斑、迷走神经背核、脑干的中缝核、丘脑底核、大脑皮质和导水管周围的灰质可偶然受侵。大体可见黑质致密区色素明显消失，脑室轻度扩大。镜下可见多巴胺能神经元细胞消失，黑质致密区色素细胞中的黑色素消失。

已有研究发现干细胞不仅可以在特定的体内外环境下诱导分化为神经元细胞^[5-6]，而且可脑内移植治疗中枢神经系统疾病，因此干细胞治疗就成为目前相对理想的治疗方法。2000年，Woodbery等^[7-8]研究提示间充质干细胞在特定条件下能定向诱导分化为神经元样细胞，间充质干细胞逐渐成为神经科学领域的一个研究热点。最近发现间充质干细胞不仅存在于骨髓，还存在于外周血及胚胎实体器官组织内^[9-11]，这为骨髓外组织培养及扩增提供了理论依据。脐血来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理的限制，体现了应用脐血间充质干细胞作为干细胞来源的优越性。李晓文等^[12]在特定条件下从脐血间充质干细胞中诱导出神经元样细胞，并经免疫组化染色证实诱导后的细胞表达神经营养因子。本实验采用脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病大鼠，为进一步临床应用提供理论基础。

实验发现移植1，2周脐血间充质干细胞组旋转圈数与对照组比较差异无显著性意义，3周后直到8周脐血间充质干细胞组旋转圈数较前减少，并且与对照组有明显差异。此外，胡琦等^[13]，Chen等^[14-16]实验显示移植入脑的间充质干细胞可以分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子，在脑内能够促进残存神经元的存活及新生神经的再生。Phinney等^[17]报道移植间充质干细胞入脑可在脑内存活并刺激胶质细胞分泌脑源性神经营养因子及神经生长因子，促使神经功能的恢复及神经的再生。移植后2周，脐血间充质干细胞移植大鼠纹状体针道内及附近发现酪氨酸羟化酶阳性细胞存在；对照组大鼠的纹状体针道处无外源性细胞存在。移植后8周，脐血间充质干细胞移植组大鼠纹状体针道内有酪氨酸羟化酶阳性细胞存在，较2周时阳性细胞有所增加，但差异无显著性意义，对照组大鼠纹状体处仍无酪氨酸羟化酶阳性细胞表达。免疫组化结果显示脐血间充质干细胞可以分化为神经元，纹状体内少数细胞分化为多巴胺能神经元，表明脐血间充质干细胞在体内也具有可塑性，在脑内微环境作用下可向神经元及多巴胺能神经元分化^[18]。

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