沉默KDR基因乳腺癌MCF-7细胞的生物学特征改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (28): 4514-4519.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.016

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沉默KDR基因乳腺癌MCF-7细胞的生物学特征改变

于治灏^{1，2，3，4}，余岳^{1，2，3，4}，杨欣⁵，曹旭晨^{1，2，3，4}

¹天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市 300060；
²乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市 300060；
³天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060；
⁴天津医科大学肿瘤医院乳腺一科，天津市 300060；
⁵北京大学肿瘤医院病理科，北京市 100142

出版日期:2015-07-02 发布日期:2015-07-02
通讯作者: 曹旭晨，博士，主任医师，天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市 300060；乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市 300060；天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060；天津医科大学肿瘤医院乳腺一科，天津市 300060
作者简介:于治灏，女，1983年生，天津市人，汉族，2009年天津医科大学毕业，硕士，医师，主要从事乳腺癌临床诊疗及肿瘤干细胞研究。

KDR gene silencing effect on biological properties of breast cancer MCF-7 cells

Yu Zhi-hao^{1, 2, 3, 4}, Yu Yue^{1, 2, 3, 4}, Yang Xin⁵, Cao Xu-chen^{1, 2, 3, 4}

¹Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin 300060, China;
²Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University, Ministry of Education, Tianjin 300060, China;
³Tianin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China;
⁴the First Department of Breast Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China;
⁵Department of Pathology, Beijing Cancer Hospital, Beijing 100142, China

Online:2015-07-02 Published:2015-07-02
Contact: Cao Xu-chen, M.D., Chief physician, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin 300060, China; Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University, Ministry of Education, Tianjin 300060, China; Tianin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China; the First Department of Breast Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China
About author:Yu Zhi-hao, Master, Physician, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin 300060, China; Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University, Ministry of Education, Tianjin 300060, China; Tianin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin 300060, China; the First Department of Breast Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin 300060, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着基因工程以及肿瘤生物分子学等新兴学科的发展壮大，基因治疗肿瘤成为一种新的治疗模式。
目的：探讨KDR基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖能力和侵袭能力的影响。
方法：设计针对KDR基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列，转染人乳腺癌MCF-7细胞，应用RT-PCR及Western blot法检测沉默KDR基因后MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白的表达；应用流式细胞仪、CCK-8 增殖实验、小室侵袭实验检测沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的细胞周期、增殖能力、侵袭能力的变化。
结果与结论：KDR基因沉默48 h后，乳腺癌MCF-7细胞KDR mRNA及蛋白表达明显降低；乳腺癌MCF-7细胞停滞在G0/G1周期，S期的细胞数目减低，细胞增殖得到显著抑制，穿过滤膜的细胞数量明显减少。上述结果表明沉默KDR基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭能力得到明显抑制，说明KDR基因沉默可能成为新的有效治疗乳腺癌的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌, KDR基因, MCF-7, 肿瘤干细胞, 基因沉默, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: With the development of genetic engineering and tumor molecular biology, gene therapy for tumors has become a new treatment modality.
OBJECTIVE: To explore the effect of the KDR gene silencing on the proliferation and invasion capacity of breast cancer MCF-7 cells.
METHODS: Interfering RNA (siRNA) sequences for small molecule KDR gene was designed and transferred into human breast cancer MCF-7 cells. Then, RT-PCR and western blot assay were used to detect the KDR mRNA and protein expression. Flow cytometry, cell counting kit-8 test and Transwell test were employed to detect the cell cycle, proliferative capacity and invasion capacity of breast cancer MCF-7 cells after the KDR gene silencing.
RESULTS AND CONCLUSION: After 48 hours of KDR silencing, the mRNA and protein expressions of KDR in MCF-7 cells were decreased obviously; MCF-7 cells arrested at G0/G1 stage and the number of cells at S stage was reduced. Cell proliferation was inhibited significantly. The amount of cells passing through the filtering membrane became less. After KDR gene silencing, the proliferation and invasion of breast cancer MCF-7 cancer stem cells were inhibited remarkably, indicating that KDR gene silencing may be a new target for the effective treatment of breast cancer.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Gene Silencing, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

于治灏，余岳，杨欣5，曹旭晨. 沉默KDR基因乳腺癌MCF-7细胞的生物学特征改变[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4514-4519.

Yu Zhi-hao, Yu Yue, Yang Xin5, Cao Xu-chen. KDR gene silencing effect on biological properties of breast cancer MCF-7 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4514-4519.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。
时间及地点：实验于2013年12月至2014年11月在天津医科大学中心实验室完成。
材料：
细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞采购于中国医学科学院。
实验方法：
细胞实验分组：沉默KDR基因后，乳腺癌MCF-7细胞转染时分为3组：转染pGenesil-1-KDR-siRNA载体为实验组(MCF-7/KDR-siRNA组)，转染随机对照载体为对照组(MCF-7/control组)，未转染的乳腺癌细胞株MCF-7细胞为空白组(MCF-7组)，于转染后48 h行RNA干扰效应检测。
siRNA设计、合成及MCF-7细胞的转染：参考文献[16]获取人KDR mRNA的序列全长(GI：11321596)，挑选出一条与预测的KDR mRNA较易结合的siRNA。KDRsiRNA序列的正义链为：5’-GCC ACC AUG UUC UCU AAU ATT-3’，反义链为5’-UAU UAG AGA ACA UGG UGG CAT-3’；阴性对照siRNAsca (scramble siRNA)序列的正义链为5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTI-3’，反义链为5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA TI-3’。正反义链的siRNA两段序列都进行BLAST对比，以确保与其他基因无同源性。对正义链进行氟代修饰，以便增强siRNA的稳定性，而反义链不进行修饰。

KDR基因沉默后乳腺癌MCF-7细胞特性检测所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
胎牛血清	上海宝曼生物科技有限公司
DMEM培养基、 Opti-MEM	美国Becon Dickinson公司
胰蛋白酶、BCA蛋白定量试剂盒	武汉博士德
RT-PCR两步法试剂盒	本元正阳基因技术股份有限公司
脂质体转染试剂	美国Abcam公司
cDNA合成试剂盒	华美生物工程公司
PCR 引物序列	英国RS Biotech公司
AMV反转录试剂盒	福州迈新生物技术开发公司
RNA干扰序列	大连宝生生物公司
CCK-8	北京博奥森公司
兔抗人KDR多克隆抗体、鼠抗GAPDH 单克隆抗体	中国医学科学院
PVDF膜	美国Hyclone公司
HRP 标记的兔抗羊IgG	北京天根生化有限公司
RIPA蛋白裂解液	美国KPL公司
ECL化学发光试剂盒	天津市化学试剂一厂
荧光显微镜	日本Nikon公司
超净工作台	苏州安泰空气技术公司

MCF-7肿瘤干细胞的接种、培养及转染：选择对数生长期的MCF-7细胞，用PBS洗涤，经胰蛋白酶消化后离心沉淀，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，并将细胞浓度调整到6×10⁸ L^-¹，接种12孔板中，每孔100 μL。MCF-7细胞培养于 37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中，培养至细胞贴壁后，传代。当融合率达80%时，弃去旧培养液通过脂质体法进行细胞转染。于转染后48 h将培养板于荧光显微镜下观察转染效率，并进行RNA干扰效应的检测。

RT-PCR检测转染MCF-7细胞KDR mRNA的表达：参考文献[17]采用TRIzol法提取总RNA后，以0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳并观察RNA的完整性。根据cDNA合成试剂盒说明书反转录合成cDNA，反转录进行条件：42 ℃， 60 min，95 ℃，5 min，AMV反转录酶灭活后冰浴，保存-20 ℃冰箱待用。分别扩增KDR 和内参照GAPDH引物。KDR上游引物为：5’-CTG GCA TGG TCT FCT GTG AAG CA-3’，下游引物为：5’-AAT ACC AGT GGA TGT GAT GCG G-3’，扩增产物182 bp；内参照GAPDH的上游引物为：5’-CGT GGA AGG ACT CAT GAC CA-3’，下游引物为：5’TCC AGG GGT CTT ACT CCT TG-3’，扩增产物为265 bp。PCR的反应条件为94 ℃行预变性3 min，94 ℃变性45 s、62 ℃退火50 s、72 ℃延伸1 min进行反应，经35次循环后，又经72 ℃延伸8 min。2%琼脂糖水平板电泳，100 V电压电泳45 min。用凝胶自动成像及分析系统，结果以KDR/GAPDH条带的吸光度比值作为KDR mRNA表达的相对强度。

Westem blot检测转染MCF-7细胞KDR蛋白的表达：融解Western细胞裂解液5 mL，细胞弃去培养液后，PBS洗涤1遍，吹打细胞使细胞充分接触到裂解液，离心4 min后20 ℃保存。提取总蛋白经BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，入等体积2×上样缓冲液调整蛋白浓度至1 g/L，99 ℃变性10 min，离心30 s；同时加入蛋白质分子质量标准品进行电泳；电转移印迹到PVDF膜上，观察膜上有蛋白分子质量标准条带，标记正反面；封闭液中孵育1 h，加入1∶1 000稀释的KDR一抗 4 ℃过夜，TBST洗膜5 min，共3次，加入1∶5 000 HRP标记的二抗及GAPDH，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤，并采用ECL法检测。暗室曝光X射线片，用凝胶成像系统摄像并扫描进入电脑，用Image-Pro Plus 7.0软件分析，结果数值以目的蛋白与GAPDH蛋白条带平均比值代表KDR蛋白的相对表达量。

流式细胞仪检测细胞周期：于转染48 h后收集各组MCF-7细胞，4 ℃预冷，PBS冲洗2次，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，加入预冷的4 ℃体积分数为70%无水乙醇固定24 h，洗涤细胞，再用PBS重悬细胞5 min，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，置入含50 mg/L RNA 酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中共同孵育30 min。用含RNase的PI染液重悬细胞， 4 ℃暗室中避光放置1 h后流式细胞仪检测，并采用其附带软件对MCF-7细胞的DNA含量分布进行分析，并计算出各个周期细胞的百分率，实验重复进行3次，根据公式计算其平均值，MCF-7细胞增殖指数=(S+G₂+M期细胞数)/(G₀+ G₁+S+G₂+M期细胞数)×100%。

CCK-8增殖实验检测MCF-7细胞的增殖能力：于转染后收集各组处于对数生长期MCF-7细胞，胰酶消化，利用有血清培养皿配制成单细胞悬液。以1×10³/孔接种细胞于96孔板中，并设6个复孔，培育24 h后，于转染后1-4 d，每天各取一个96孔板经CCK-8试剂室温融化，每孔加入20 μL CCK-8，培养基温育4 h后，行CCK-8法检测细胞增殖情况。以只加培养液和CCK-8溶液不加细胞空白孔为对照，其余实验步骤均一致。采用酶联免疫法检测每孔的吸光度值，并记录结果。绘制细胞生长曲线图，并计算出细胞的生长抑制率。

Transwell小室侵袭实验检测MCF-7细胞侵袭能力：Transwell小室的上室接种细胞，下室加入胎牛血清或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，在聚碳酸酯微孔滤膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质。在Transwell小室下室中加入体积分数为10%胎牛血清，以便做条件培养液。将上述3组处理过的MCF-7细胞悬液100 μL(3×10⁵ L^-¹)加入上室中，经培育箱中培育24 h，利用棉签轻轻刮除滤膜上室面未穿过的MCF-7细胞，采用体积分数为95%乙醇固定5 min，PBS清洗3次后经苏木精染色10 min。然后用PBS清洗小室，等待其自然凉干后，用眼科剪刀把上室的聚碳酸酯滤膜沿边缘小心取下，利用树脂胶固定到玻片上(膜内面向上)，封固；等待干燥，于200×光镜下在每膜的上、下、左、右、中计数5个视野的侵袭细胞数，并计算出其平均值。每组设3个平行小室，实验重复进行3次。

主要观察指标：①MCF-7细胞KDR mRNA的表达。②MCF-7细胞KDR蛋白的表达。③MCF-7细胞周期变化。④MCF-7细胞的侵袭能力。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

乳腺癌的发生和发展是一个多因素的复杂过程。临床治疗后的高复发率及转移率严重威胁乳腺癌患者的寿命^[18-20]。近几年来的研究发现，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质瘤、胰腺癌和头颈部等肿瘤中均发现了肿瘤干细胞的存在^[21-23]。有研究表明肿瘤起始的源泉就是肿瘤干细胞，肿瘤干细胞在维持肿瘤的生长、转移及促进血管生成中发挥了决定性作用，肿瘤干细胞可以在化疗后继续存留，且不受外界影响进行恶性增殖和多向分化，最终发展为新的肿瘤进而致使癌症复发^[24-25]。有研究报道称乳腺癌干细胞的迁移性增强是导致乳腺癌转移的重要原因。而传统的放化疗虽然能够杀死大部分普通乳腺癌细胞但对乳腺癌干细胞的作用较弱^[26-28]。

乳腺癌干细胞对传统常用的化疗方法并不敏感，针对乳腺癌单一因素的治疗方法，往往不能实现理想的治疗效果。近些年来基因技术的发展进步，为彻底根除乳腺癌细胞带来了新的希望^[29]。研究发现采用基因联合方法协同作用，能够极大地提高肿瘤基因治疗的疗效^[30-32]，为此，本研究观察沉默KDR基因对乳腺癌MCF-7细胞特性影响。有研究发现将含有hTERT的腺病毒载体转入腹膜癌扩散的小鼠体内，发现hTERT的RNA量下降4倍^[33]。实验采用设计、合成的siRNA对MCF-7细胞进行转染，KDR mRNA和蛋白的表达量下降。Song等^[33]将构建的VEGF和hTERT siRNA表达载体转染到患有鼻咽癌的裸鼠体内，结果表明基因联合促肿瘤细胞的凋亡作用较单一基因具有更优效果。这些研究结果均证明了基因修饰的siRNA转染后能有效抑制细胞靶基因的表达，为乳腺癌患者指引出新的治疗手段。

KDR在细胞生长和分化中起重要作用，其高表达于增生活跃的肿瘤血管内皮细胞及大部分肿瘤细胞内，而在正常组织不表达或表达甚微，它是介导血管内皮生长因子在肿瘤新生血管形成过程中发挥功能的特异性受体^[34-36]。KDR还通过自分泌作用于自身的血管内皮生长因子受体，直接促进肿瘤细胞的生长。因此，以KDR为靶点的抗肿瘤措施可适应于多种肿瘤治疗^[37-38]。实验以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，利用肿瘤与正常组织中血管内皮间KDR的表达差异性，设计及合成KDR的siRNA序列，转染细胞后检测结果表明乳腺癌MCF-7细胞的增殖得到显著抑制。Transwell小室侵袭实验结果表明，实验组穿过滤膜的细胞数量明显减少，说明KDR基因沉默可能成为新的有效治疗乳腺癌的靶点。

综上所述，KDR siRNA能够有效下调KDR mRNA和蛋白的表达水平，可以明显抑制MCF-7细胞增殖，且细胞的活力下降，相信在不久的未来能发展成为一种新型抗肿瘤药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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KDR gene silencing effect on biological properties of breast cancer MCF-7 cells

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