重复磁刺激右侧大脑中动脉闭塞模型大鼠脑梗死区微环境及神经功能的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外大量研究表明重复经颅磁刺激可使皮质兴奋性产生较刺激时间更加持久的改变，为磁刺激应用于脑梗死后康复治疗提供了一个新的研究方向，但其远期临床疗效与安全性尚需进一步研究。
目的：观察重复经颅磁刺激脑梗死大鼠对神经再生微环境及功能恢复的影响。
方法：将大鼠随机分为模型组、假刺激组及重复经颅磁刺激组(80%运动阈值(MT)组、100%MT组和120%MT组)，采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型。制模24 h后各重复经颅磁刺激亚组给予20 Hz相应强度磁刺激，假刺激组则给予假磁刺激，模型组制模后未给予特殊处理。
结果与结论：造模后7 d，重复经颅磁刺激组的脑梗死体积显著小于模型组及假刺激组(P < 0.05)。RT-PCR、Western blot检测显示，造模后72 h，重复经颅磁刺激组水通道蛋白4/9基因和蛋白表达均较模型组显著增高(P < 0.05)。与造模后第1天比较，造模后第15天重复经颅磁刺激组(100%MT)神经功能缺损评分得到明显改善(P < 0.05)。免疫组织化学检测结果显示，各重复经颅磁刺激亚组缺血半暗带区胶质纤维酸性蛋白表达与模型组比较均显著减少(P < 0.05)。结果证实，重复经颅磁刺激可减轻脑梗死模型大鼠神经功能缺损程度，通过诱导脑缺血耐受、减少神经细胞凋亡和降低水通道蛋白4/9基因和蛋白的表达，改善神经再生微环境。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 重复磁刺激, 脑梗死, 神经再生, 运动功能, 右侧大脑中动脉闭塞模型, 微环境, 神经功能变化, 康复, 大鼠, 功能恢复

Abstract:

BACKGROUND: At home and abroad, a large number of studies have demonstrated that repetitive transcranial magnetic stimulation can evoke changes in cortical excitability that can be sustained beyond the time of stimulation, which provides a new research direction for application of magnetic stimulation in rehabilitation treatment for cerebral infarction. However, its long-term clinical efficacy and safety deserve further investigation.
OBJECTIVE: To observe the influence of repetitive transcranial magnetic stimulation on nerve regeneration microenvironment in the infarcted cerebral area and rat neurological functional recovery after cerebral infarction.
METHODS: The rats were randomly divided into model group, sham stimulation group and repetitive transcranial magnetic stimulation group (80%, 100% and 120% motor threshold subgroups). Right middle cerebral artery occlusion models were established in rats by the intraluminal suture method. At 24 hours after middle cerebral artery occlusion, 20 Hz repetitive transcranial magnetic stimulation was performed in each repetitive transcranial magnetic stimulation subgroup at the designated motor thresholds. Rats in the sham stimulation group underwent sham stimulation, while the model group rats were not given any treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Seven days after middle cerebral artery occlusion, cerebral infarction volume in the repetitive transcranial magnetic stimulation group was significantly less than that in the model and sham
stimulation groups (P < 0.05). RT-PCR and Western blot assays showed that at 72 hours after middle cerebral artery occlusion, aquaporin 4/9 mRNA and protein expression in the repetitive transcranial magnetic stimulation group was significantly increased than in the model group (P < 0.05). Compared with 1 day after middle cerebral artery occlusion, neurological deficit scores at 15 days after repetitive transcranial magnetic stimulation was significantly improved (P < 0.05). Immunohistochemical detection results showed that glial fibrillary acidic protein expression in the ischemic penumbra in each repetitive transcranial magnetic stimulation subgroup was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). The results reveal that repetitive transcranial magnetic stimulation can alleviate rat neurological deficits and improve nerve regeneration microenvironment by inducing cerebral ischemic tolerance, reducing nerve cell apoptosis and decreasing aquaporin 4/9 mRNA and protein expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Infarction, Middle Cerebral Artery, Transcranial Magnetic Stimulation (TMS)

中图分类号:

R318

刘沛，刘宝斌. 重复磁刺激右侧大脑中动脉闭塞模型大鼠脑梗死区微环境及神经功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4333-4338.

Liu Pei, Liu Bao-bin. Repetitive transcranial magnetic stimulation in a rat model of middle cerebral artery occlusion: variation of nerve regeneration microenvironment in infarcted brain areas and recovery of rat neurological function[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4333-4338.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠65只，造模失败3只，造模后死亡2只，最终60只进入结果分析。造模流程图见图1。
2.2 脑组织病理变化 rTMS造模后对大鼠大脑中动脉闭塞后脑梗死体积的影响：实验发现SD大鼠建模后，均形成明确的不同程度的局灶性梗死灶，累及纹体区和或额颞顶叶皮质。结果显示，100%MT rTMS组的脑梗死面积(20.34±2.57) mm3显著小于模型组及假刺激组[(38.16± 2.03)，(34.60±3.16) mm³；P < 0.05]。

2.3 运动功能评定结果 Longa评分系统评价包含运动、感觉、反射等方面的综合评价，反映了神经功能损伤的严重程度，实验所有造模成功的大鼠在麻醉情醒后出现爬行时追尾、转圈；提尾悬吊时胸部向左侧扭转、左前肢屈曲等；出现体质量显著减轻，进食减少，反应迟钝、激惹，探索行为减少，再灌注3 d后进食渐恢复，体质量渐增加。实验由不了解大鼠分组的固定人员操作，得分越高，说明神经损伤程度越重。
与造模后第1天时比较，造模后第15天100%MT组神经功能缺损评分得到明显改善(P < 0.05)，模型组、假刺激组、100%MT rTMS组内各时间点神经功能障碍评分差异有显著性意义(P < 0.05)。各实验组大鼠神经功能障碍评分变化见表2。

2.4 缺血半暗带脑组织水通道蛋白4/9 mRNA表达结果显示，造模后72 h 100%MT rTMS组水通道蛋白4/9 mRNA表达高于模型组及假刺激组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.5 缺血半暗带脑组织水通道蛋白4/9蛋白的表达缺血半暗带脑组织水通道蛋白4/9蛋白表达见表4。结果显示，100% MT rTMS组较模型组、假刺激组水通道蛋白4/9蛋白表达升高(P < 0.05)，6 h开始增高，72 h达到高峰。
2.6 缺血半暗带脑组织水通道蛋白4/9的免疫组织化学染色结果各组大鼠在造模后15 d，胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学结果显示，各组大鼠缺血半暗带区胶质纤维酸性蛋白阳性信号平均吸光度值比较见图2，各rTMS亚组胶质纤维酸性蛋白阳性吸光度值均较模型组显著减少(P < 0.05)。

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引言

脑梗死为脑供血功能障碍而引起的缺血、缺氧性脑组织坏死和软化^[1-3]。具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点，近些年来其发病率呈递增趋势，已严重威胁着人类的健康^[4-6]，因此如何改善和促进梗死后神经功能恢复是目前研究的重点。
重复磁刺激是现代神经生理学中的一项无创脑刺激技术^[7-9]，大量动物和临床研究均证实磁刺激对脑梗死具有保护作用，有助于改善脑梗死患者继发性神经功能损伤^[10]。自1985年Barker等^[11]首次将该技术应用到中枢神经系统以来，其无创、无痛、操作简便、可深部刺激及不良反应小等优势便在中枢和周围神经运动传导通路的基础和临床研究中凸显。研究显示，健康人的大脑运动核心区在同侧大脑半球和双侧大脑半球之间存在着内在的兴奋和抑制平衡^[12]。
脑卒中后，两半球运动区之间的经胼胝体抑制性环路的平衡可能受到了影响，使大脑半球间的兴奋性失衡，可能阻碍了运动的恢复。在大脑半球间竞争抑制的观点支持下，通过皮质兴奋性的调节可能诱导神经可塑性与或干扰脑卒中向假定的不合适的方向发展的进程。另有研究发现，脑梗死后康复与导致中枢神经系统重组的各种可塑性改变相关，包括突触连接、病灶周围和远隔组织残存细胞以及对侧未受损半球兴奋性的变化。
脑可塑性是指脑可以为环境和经验所修饰，具有在外界环境和经验的作用下塑造大脑结构和功能的能力，分为结构可塑性和功能可塑性。结构可塑性主要是指脑内部的突触和神经元之间的连接可以受学习、训练、环境等因素的影响建立起新的连接，从而影响个体的行为，主要包括突触可塑性及神经元可塑性；而功能可塑性则是通过学习和训练，脑内某一代表区域的功能可以由邻近的脑区代替，也表现为脑损伤患者在经过学习、训练后脑功能在一定程度上的恢复。
一些神经生理和神经影像实验结果也支持运动恢复与受累半球重组相关这一理论。许多实验证明，经过训练和改变外界环境，通过失神经过敏、轴突侧支长芽、潜伏通路和突触的启用、邻近代偿等可使脑功能得到一些恢复，这些就是脑功能重组的结果。
重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)可使皮质兴奋性产生较刺激时间更加持久的改变，是抑制或促进皮质兴奋性非常有效的方法，皮质兴奋性调节可能在瞬间引起的感觉运动区神经网络的可塑性变化，通过影响一些神经递质的释放、激活相应基因和蛋白表达等来改善脑卒中后的神经功能^[13]。rTMS为磁刺激应用于脑梗死后康复治疗提供了一个新的研究方向^[14]。
脑梗死后的康复建立在中枢神经系统能够发生可塑性改变的基础上，这种可塑性改变对病侧脑组织丢失的活性进行补偿。一侧大脑半球的梗死可使病灶对侧未受损半球失去它的抑制。通过增强皮质重组能在康复中获得部分神经功能的改善。rTMS是一种有效改善皮质兴奋性的无创方法。因此，最近提出应用rTMS诱导神经可塑性改变来改善脑梗死患者的神经功能康复。
实验以脑梗死模型大鼠为研究对象，探讨重复磁刺激治疗对大鼠脑梗死的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物模型实验。
时间及地点：于2013年8月至2014年9月在天津医科大学动物实验室完成。
材料：

重复磁刺激治疗对脑梗死模型大鼠影响的实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
水通道蛋白4/9兔抗大鼠多克隆抗体	美国Gibco BRL公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体	美同KPL公司
2.5%氯胺酮	北京协和医院药剂科提供
TUNEL凋亡试剂盒	大连宝生物工程公司
RT-PCR试剂盒	美国Santa Cruz公司
Western blot蛋白检测试剂盒	KPL公司，美国
重复经颅磁刺激仪CCY-I 型	武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司
肌电图仪	美国 Cadwell 公司

Western blot检测：造模后6，24，72 h，将RT-PCR提取后剩余物离心30 min(1 500 r/min)，用 Bradford法测定蛋白浓度。用5%的浓缩胶40 V衡压1 h后再用10%分离胶60 V恒压3.5 h，然后又湿转14 V、恒压14 h，再经37 ℃摇床封闭2 h，又经10 min洗膜3次后，将水通道蛋白4/9多克隆抗体以1∶500稀释溶于TBST中，孵育在室温中澡 60 min；经TBST洗膜10 min、洗3次后，加入1∶500稀释的辣根酶标记的二抗。孵育在室温中60 min；TBST洗膜 10 min、3次再用TBS洗膜10 min DAB显色，用Quantity one图像分析，通过目的条带与β-actin条带吸光度的比值来评定蛋白表达水平。
免疫组织化学染色：100%MT rTMS组、模型组、假刺激组在建模后第2，4周各处死5只大鼠取缺血半暗带脑组织，做免疫组织化学染色。取梗死处组织学检查以证实恢复程度，经心脏灌注40 g/L多聚甲醛，固定10 min后行常规冰冻切片，室温干燥后，光学显微镜下先低倍后高倍观察。细胞胞核为苏木精蓝染，免疫组织化学染色为细胞浆着色，阳性细胞胞浆呈棕黄色，阴性细胞胞浆不着色。在每个盖玻片的中心和四周随机选择5个视野，进行CM-Dil细胞计数并镜下拍照记录，计算阳性细胞数的平均值。为检测抗体的特异反应，实验阴性对照不加一抗，以PBS代替。实验采用Image-Pro Plus 5.0图像处理与分析系统进行图像分析，NF-200免疫组织化学染色，每块组织在400倍光镜下随机取20个视野。
统计学分析：所得数据以x±s表示，实验数据用SPSS 16.0软件分析，采用方差分析和t 检验进行统计学检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

实验动物：成年雌性SD大鼠65只，体质量200-250 g，动物质量合格证号：SCXK(津)20050002。动物在恒温下饲养，自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。
实验方法：
构建大脑中动脉闭塞模型大鼠及重复磁刺激治疗：取雌性SD大鼠65只，以体积分数2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，逐层分离右侧颈总、颈内和颈外动脉，并暴露，结扎颈总动脉和颈外动脉，颈总动脉近分权处剪1个“v”字形切口，用1.8号鱼线(多聚赖氨酸处理过)经切口插入右颈内动脉，阻塞右侧大脑中动脉起始段及其所有血液供应，固定外端的鱼线，缝合皮肤，腹腔注射青霉素预防感染，观察神经症状和体征^[15]。依据Zea Longa 5分制评分标准^[16]，神经缺损评分大于2分者判为造模成功。剔除造模失败的3只及造模后死亡的2只，剩余60只纳入实验。
将60只大鼠随机分为3组：模型组、假刺激组及rTMS组，每组各20只，rTMS组的各亚组为：100%MT rTMS组10只，80%MT rTMS组5只，120%MT rTMS组5只。
rTMS组和假刺激组大鼠于造模24 h后给予rTMS治疗，模型制作第1天起将模型组、假刺激组及rTMS组清醒状态的大鼠置于自制、大小适当的透明容器内，固定大鼠头部，将圆形刺激线圈(直径为60 mm)磁场边缘置于大鼠梗死侧大脑上方，并与右侧大脑半球相切。假刺激组大鼠同上固定方法，但磁刺激线圈平面与头皮垂直。磁刺激参考参数如下：磁刺激频率20 Hz，距离为7-10 cm，刺激脉冲持续5 s，间歇60 s，磁场峰值强度为3.5 T，共10个序列，每个序列100个脉冲，刺激1次/d，连续7 d；各rTMS亚组分别给予相应强度的磁刺激，假刺激组大鼠磁刺激参数同100%MT组。模型组大鼠于造模后未给予特殊处理，期间自由饮水、摄食。
运动功能评定：于造模后1，8，15 d，各组大鼠按照Longa的5分法进行神经功能行为学评分^[3]。0分：无神经缺损症状；1分：左前肢不能完全伸直；2分：向左旋转；3分：向左侧倾倒；4分：不能行走或昏迷。分数越高，神经功能障碍越严重。
脑梗死面积计算：造模后7 d，迅速断大鼠头部取脑，在冰台上将脑组织距额极2 mm处开始切成冠状切片(2 mm厚)，于三苯氯化四氮唑磷酸盐缓冲液下(质量浓度 20 g/L)、37 ℃避光温育30 min，显示梗死区为白色，正常脑组织区为红色。采用图像分析软件拍照提取图像进行梗死面积的分析测量，梗死面积(V)计算：根据公式V=t(A1+A2+……+An)-(A1+An)t/2，t为切片厚度，n为切片数目，An为第n个切面的梗死面积。
RT-PCR检测：造模后6，24，72 h分别取100%MT rTMS组、模型组和假刺激组各时间点5只实验动物缺血半暗带脑组织后外部分50 mg进行RT-PCR分析。用Trizol提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，利用RT-PCR两步法试剂盒(TaKaRa公司)说明将mRNA反转录成cDNA，再将cDNA进行RT-PCR分析。按AMV反转录试剂盒的操作说明介绍的方法提取组织总RNA，以总RNA为模板、Oligo (dT)为引物，通过RT-PCR两步法试剂盒将mRNA反转录成cDNA，反应参数为：30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→5 ℃，5 min。将cDNA-20℃保存。以反转录所得cDNA为模板，用以下引物对水通道蛋白4/9及β-actin的cDNA进行扩增^[7]。引物序列见表1。取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带吸光度分析，计算水通道蛋白4/9产物与β-actin产物的吸光度值的比值，作为水通道蛋白4/9 mRNA表达的指标。

讨论

rTMS的作用机制可能通过改变神经可塑性来发挥的。rTMS是抑制或促进皮质兴奋性非常有效的方法，也是现代神经生理学中的一项无创脑刺激技术^[17]，近些年来，磁刺激在治疗大鼠脑梗死中的作用也越来越受到人们的关注^[18]。
大量研究证实，应用rTMS诱导神经可塑性改变可以改善大鼠脑梗死区域的微环境，保护神经细胞功能，促进脑梗死患者的神经功能康复^[19-20]。其作用机制可能通过：①减少神经细胞氧消耗，维持内环境稳定。②抑制Ca²⁺超载，降低脊髓神经死亡。③抑制内源性毒素对神经组织毒害；④抑制微环境中自由基的产生，抑制脊髓的炎症反应。⑤改善脊髓缺血再灌注后神经功能的恶化^[21-22]。
脑梗死的关键机制是增加脑血流量^[23-25]，而rTMS不需进入人体的这种特有干预方式，可通过交变磁场的影响而直接对脑部细胞进行兴奋性的改变。这样可以很好的激发脑部的自我保护系统，刺激脑循环的自动调节能力，提高脑血流量，增加神经元对缺血损害的耐受性。相关研究报道中证明了rTMS在脑卒中发挥的作用，但其作用机制还远不为所知^[26-28]。
实验结果显示，rTMS组在损伤1周后的神经功能评分显著低于模型组及假刺激组，同时也观察到rTMS组动物的精神状态、活动能力、反应速度等均优于模型组。RT-PCR检测结果表明模型组、假刺激组及rTMS组水通道蛋白4/9 mRNA的表达3组间有显著性差异。在造模后72 h，rTMS组水通道蛋白4/9 mRNA表达升高最为显著，表明20 Hz rTMS 有助于促进大鼠脑梗死区的超微结构恢复和水通道蛋白4/9 mRNA的表达，这可能是其治疗大鼠脑梗死的机制之一。rTMS的生物学效应可因所选的刺激参数、位置以及皮质生理状态的不同而产生的效应也不同^[29-31]。
rTMS可能通过诱导脑缺血耐受而减轻缺血后脑梗死体积和神经功能障碍程度。尤其是100%MT低中强度 20 Hz的rTMS刺激能显著促进急性期脑梗死大鼠神经功能的改善，其治疗机制可能与减少脑梗死灶周边胶质纤维酸性蛋白表达有关^[32-34]。
脑组织的损伤和可塑性改变同样可以通过脑组织中蛋白表达量来反映。胶质纤维酸性蛋白是常用的星形胶质细胞标志蛋白，在脑梗死早期活化的星形胶质细胞对脑组织具有一定保护作用，胶质纤维酸性蛋白蛋白表达量可反映脑组织损伤及可塑性改变^[35-37]。
实验结果示，在造模后15 d时于模型组比较各rTMS亚组胶质纤维酸性蛋白表达均减少，尤以100%MT组神经功能改善最为明显，表明rTMS有可能通过减少胶质瘢痕的形成来促进大鼠神经功能恢复，与马玉娟等^[29]的研究结果一致。
综上所述，rTMS刺激治疗能显著促进大鼠脑梗死后神经再生微环境的改善，可减轻患者的神经功能缺损程度。其治疗机制可能与减少脑梗死灶周边胶质纤维酸性蛋白表达有关，可作为大鼠脑梗死后的一种有效治疗手段，其优点是无创、安全、不良反应少。
随着医疗技术的发展进步，相信在不久的将来，rTMS技术会被越来越多的学者接受，也会为人类研究和治疗脑血管疾病提供更多的帮助。实验如能进一步深入、完善，并开展相关临床方面研究，将对脑梗死患者选择最佳的治疗参数提供指导，并能对促进其神经功能恢复发挥重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程