早期稳定型动脉粥样硬化斑块模型兔损伤区拉曼光谱特征及旋转手法的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.014

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (27): 4339-4344.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.014

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早期稳定型动脉粥样硬化斑块模型兔损伤区拉曼光谱特征及旋转手法的影响

谌祖江¹，黄学成¹，向孝兵²，陈超¹，李义凯¹

1南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；
2广州市正骨医院运动医学科，广东省广州市 510045

出版日期:2015-06-30 发布日期:2015-06-30
通讯作者: 李义凯，博士，教授，博士生导师，南方医科大学中医药学院骨伤教研室，广东省广州市，510515
作者简介:谌祖江，男，1987 年生，江西省宜春市人，汉族，在读硕士，主要从事骨伤科推拿手法学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81273871，30700893)；广东省科技计划项目(2012B031800323)

早期稳定型动脉粥样硬化斑块模型兔损伤区拉曼光谱特征及旋转手法的影响

Chen Zu-jiang¹, Huang Xue-cheng¹, Xiang Xiao-bing², Chen Chao¹, Li Yi-kai¹

1College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China;
2Guangzhou Orthopedic Hospital, Guangzhou 510045, Guangdong Province, China

Online:2015-06-30 Published:2015-06-30
Contact: Li Yi-kai, M.D., Professor, Doctoral supervisor, College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Chen Zu-jiang, Studying for master’s degree, College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81273871, 30700893; a grant from Science and Technology Planning Project of Guangdong Province of China, No. 2012B031800323

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究普遍认可颈椎旋转手法可增加颈动脉粥样硬化不稳定型斑块脱落的风险，然而该手法对颈动脉粥样硬化早期稳定型斑块的影响研究甚少。
目的：探索颈椎旋转手法对动脉粥样硬化斑块模型兔脂质含量的影响。
方法：将30只雄性新西兰兔经普通饲料喂养15 d后，随机选取10只作为对照组，继续以普通饲料喂养至18周。剩余20只改用含2%胆固醇、10%猪油和88%普通颗粒饲料的高脂饲料喂养至18周，建立早期稳定型动脉粥样硬化斑块动物模型。高脂饲料喂养14周时，将高脂饲料喂养实验兔随机分为颈椎旋转手法组和模型组，各10只。颈椎旋转手法组兔施行颈椎旋转手法，左右各旋转1次(手法以兔子颈椎旋转至极限即止)，1次/3 d，共5次。
结果与结论：对照组兔拉曼光谱图上未见明显的1 450 cm-1及1 660 cm-1脂质特征峰，颈椎旋转手法组和模型组兔动脉粥样硬化斑块均有明显的1 450 cm-1及1 660 cm-1脂质特征峰，但颈椎旋转手法组和模型组特征峰的相对强度差异无显著性意义(P > 0.05)。说明在颈动脉粥样硬化病变早期，短期内施用颈椎旋转手法并不会增加模型兔颈动脉粥样硬化斑块的脂质含量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤动物模型, 颈部推拿, 颈椎旋转手法, 动脉粥样硬化, 早期病变, 稳定斑块, 拉曼光谱, 稳定性, 脂质含量, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is generally recognized that cervical rotation manipulation can increase the risk of detachment of unstable plaques in carotid atherosclerosis, but few studies are reported on the influence of cervical rotation manipulation on the stable plaque in early carotid atherosclerosis.
OBJECTIVE: To explore the influence of the cervical rotation manipulation on the lipid contents in carotid atherosclerotic plaque in a rabbit model of early carotid atherosclerosis.
METHODS: After being fed for 15 days with normal diet, 30 male New Zealand White rabbits were further fed for 18 weeks with normal diet (n = 10; control group) or a high-fat diet containing 2% cholesterol, 10% lard and 88% normal granules to build rabbit models of early carotid atherosclerosis with stable carotid plaque (n = 20). At 14 weeks of feeding with high-fat diet, the experimental rabbits fed with high-fat diet were randomly divided into a cervical rotation manipulation group (n = 10) and a model group (n = 10). The rabbits in the cervical rotation manipulation group underwent cervical rotation manipulation to the left and right sides, once each side, with the maximal range of rotation. Total five cervical rotation manipulations, once every 3 days, were performed.
RESULETS AND CONCLUSION: The 1 450 cm-1 and 1 660 cm-1 peaks of the Raman spectrum of lipid in the carotid atherosclerotic plaque of rabbit models were not distinctly present in the control group, however, they
were obviously observed in the cervical rotation manipulation group and model group. Nevertheless, the relative intensity differences at spectrum characteristic peaks were not significant between cervical rotation manipulation group and model group (P > 0.05). The environmental findings indicate that the lipid content in carotid atherosclerotic plaque of rabbit models of early carotid atherosclerosis cannot be increased after short-term administration of cervical rotation manipulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Manipulation, Spine, Atherosclerosis, Raman Spectroscopy, Lipidoses

中图分类号:

R318

谌祖江，黄学成，向孝兵，陈超，李义凯. 早期稳定型动脉粥样硬化斑块模型兔损伤区拉曼光谱特征及旋转手法的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4339-4344.

Chen Zu-jiang, Huang Xue-cheng, Xiang Xiao-bing, Chen Chao, Li Yi-kai. 早期稳定型动脉粥样硬化斑块模型兔损伤区拉曼光谱特征及旋转手法的影响[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4339-4344.

图/表（结果） 4

参考文献

引言

现代社会的繁荣，生活节奏的加快，潜移默化的改变了人们的饮食结构和生活习惯，同时也不可避免的衍生出许多让人们叫苦不迭的疾患。诸如，对肥甘厚味的不加节制，高血压^[1]、高血脂^[2]、高胆固醇人群增多，直接或间接导致了动脉粥样硬化患者数量的“井喷”^[3]；伏案工作过久、夜生活频繁及老龄化社会结构形成等，成为颈椎疾患发病率居高不下的重要原因。与此同时，高血压等与颈椎病的发病亦相互关联。如颈椎及周围软组织结构的病理改变，使椎动脉及交感神经受到刺激和压迫可造成椎-基底动脉缺血及交感神经功能紊乱，导致大脑缺血缺氧，引起血管运动中枢性兴奋性增高和周围血管痉挛，引起血压升高；而高血压病及脑血管病患者血液流变学改变(如血黏度增高)及周围血管痉挛，使颈椎及周围结构血供受到影响，促使或加重颈椎退行性变。尤其对于中老年人，动脉硬化、颈椎病、高血压病等都是该人群的常见病^[4]。许多老年往往同时患有颈动脉粥样硬化和颈椎疾患。相关研究显示在综合医院日常门诊和住院患者中，颈动脉粥样硬化发生率约为44.9%，并与年龄呈正相关，即颈动脉粥样硬化的发生率随年龄的增长而增加^[5]。另有相关文献统计，颈椎病发病率在成人中占10%-15%，40岁以上的颈椎病患者可达到80%^[6]。
临床治疗方面，颈部推拿手法以其“简便效捷”著称，外加患者对药物不良反应的心有疑虑，故当患者颈椎疾患出现或发作时，颈部推拿等物理治疗方式往往备受亲睐，而中老年患者对其更为推崇备至。据统计，在美国每年约有8百万人因颈部疼痛求医，而其中1百万人会选择推拿治疗。然而，手法操作的不规范、过度暴力、过度牵拉等，均可能撕裂神经纤维和血管，引起椎动脉局部原有的动脉粥样硬化斑块等栓子脱落，若脱落栓子经血流至大脑细小动脉如大脑后动脉的枕叶分支血管，则易造成缺血性脑卒中等相关脑血管病变。相关数据显示，早在1995年美国因颈部推拿造成脑血管损伤的事故已占全部推拿事故的6.2%。有研究显示，颈动脉粥样硬化不稳定斑块破裂是导致脑血管病的重要原因之一^[7]。所以进行推拿时一定要注意手法力度，避免该并发症的发生，特别是对于中老年高血压和动脉硬化的患者，血管本身就有动脉粥样硬化斑块，容易脱落，更需谨慎。
研究表明决定斑块稳定性的并非斑块的面积大小及狭窄程度，而是斑块的主要组织形态学特点和基本组成成分。斑块的脂质核心包括富含黏稠状粥样脂质物质的泡沫细胞、退化的血液成分、坏死组织碎片及胆固醇结晶等^[8-11]。脂类物质(如胆固醇结晶、脂核及泡沫细胞)成分在斑块中的大量存在预示斑块具有不稳定性^[12]。大的脂核被认为是不稳定斑块的一个主要特征，较小斑块内的脂质核心，可以控制斑块局部炎症的进一步发展^[13]。正常动脉组织中脂质的质量分数为6.9%，而斑块中的脂质质量分数达30%-65%^[14]。研究显示破裂斑块中脂核比例多处于32%-40%水平。认为脂核比例大于40%时斑块易于破裂^[8-11]。
拉曼光谱的分析方法是针对入射光的频率不同的散射光谱进行分析从而得到分子振动和转运方面的信息，并在分子结构的研究上得以应用的一种分析方法。由于分子中的不同化学键的振动方式分别导致拉曼光谱特征峰的强度、位置和线宽等不同，因而从不同物质得到的拉曼光谱就可以推断出物质所含分子的结构与组成等[15]。James等^[16]通过大量斑块的拉曼光谱及病理检测，对斑块病变程度与斑块成分结构进行的相关性研究成果，认为1 450及1 660 cm-1处特征峰于斑块中胆固醇结晶、脂质核心及泡沫细胞有关。因此，当颈部推拿造成局部稳定性斑块的脂质成分增多，则可推测斑块的稳定性受到影响。
由于不稳定动脉粥样硬化斑块的不稳定性的高的风险性，因此，目前相关研究多集中于对不稳定动脉粥样硬化斑块稳定性的影响^[17-25]，针对早期动脉粥样硬化病变的研究相见匮乏。但对于动脉硬化早期，斑块还具有一定稳定性时，是否适合进行颈部推拿手法治疗这一问题，临床大部分医生仍无法回答。动脉硬化是一个慢性发展的进行性疾病，稳定性斑块长期受到各种因素的刺激，可能逐渐向不稳定斑块方向发展。因此，确定颈部推拿手法对早期颈动脉粥样硬化病变的稳定斑块稳定性的影响，指导临床医生鉴别手法治疗适应证是本实验的主要目的。
实验拟通过微区拉曼光谱观察颈椎旋转手法治疗颈动脉粥样硬化早期伴有稳定斑块动物模型，分析颈椎旋转手法是否会造成颈动脉粥样硬化斑块的化学组织结构改变，使稳定性斑块逐渐向不稳定性斑块转变？

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2013年1至12月在南方医院动物实验中心及华南理工大学分析测试中心完成。
材料：
实验动物：雄性新西兰兔30只，兔龄4个月，体质量2.0-2.5 kg，购自南方医院动物实验中心，实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[26]。
高脂饲料：由广州市白云区穂北实验动物养殖场加工配制，含2%胆固醇(广州斯佳生物科技有限公司)、10%猪油(自制)和88%普通颗粒饲料的饲料。
方法：
建立早期稳定型动脉粥样硬化斑块动物模型及分组：由于兔对外源性胆固醇的高吸收率，所以喂养法建立的兔动脉粥样硬化模型在一定时间内是稳定的，且单纯高脂饲料喂养所建立的动脉粥样硬化模型多以脂质沉积为主要特征。故将30只成年雄性新西兰兔以普通饲料(南方医科大学附属南方医院动物实验中心)喂养15 d后，随机抽取10只作为对照组，继续以普通饲料喂养至18周。剩余20只改用高脂饲料喂养至18周，建立早期稳定型动脉粥样硬化斑块动物模型[27]。14周时，将高脂饲料喂养实验兔随机分为颈椎旋转手法组和模型组，各10只。
手法干预：14周后，予颈椎旋转手法组兔施行颈椎旋转手法，左右各旋转1次(手法以兔子颈椎旋转至极限即止)，1次/3 d，共5次。
兔血脂代谢检测：于造模第6，10，14周时，每次从高脂饲料喂养实验兔中选取5只实验兔进行血脂生化检验。抽血前1 d下午，给待抽血的家兔禁食，次日清晨(空腹大于12 h)从兔耳缘静脉采集血液2.5 mL，将其注入含有抗凝剂(肝素)的普通试管中，静置1 h后，将试管置于离心机中进行离心10 min，速度为1 500 r/min。抽取上层血清，送至检验(南方医院检验科)，采用全自动生化仪测定血清中三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白含量。
苏木精-伊红染色：于造模6，10，14周后，从高脂饲料喂养的实验兔中每次随机选取1只处死，取颈动脉全长，纵行切开，将其置于体积分数为4%的甲醛溶液中固定，逐级脱水，透明，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，观察病理变化。
样本处理：18周后处死所有兔子，游离颈动脉，纵行切开，再将动脉放入PBS(pH7.4)溶液中，于-80 ℃冰箱保存。
拉曼光谱检测：检测前解冻标本，于取出的2组动脉中选出12条有较明显的斑块的动脉(颈椎旋转手法组6处，模型组6处)，对照组随机选6条，生理盐水洗净，以显微拉曼光谱仪检测标本。显微拉曼光谱仪(LabRAM Aramis型，法国H.J.Y公司)以633 nm的激发光作为激发光源，激光器输出功率：10.4 mW，光斑直径：1 μm；各物质光谱的拉曼位移范围旋转为1 100-1 900 cm-1，信号被收集并校正，信号收集时间为15-60 s。
特征峰相对强度统计学分析：采用以零点为基数，运用Origin 6.0软件算出每个特征峰(1 450 cm-1及1 660 cm-1处)信号的相对强度。拉曼光谱的谱线强度与入射光的强度及样品分子的浓度有关[5]，在保证入射光的条件下，则其强度只与分子的浓度有关。
主要观察指标：拉曼光谱光谱图特征峰的变化。
统计学分析：计量资料运用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析处理，数据以x±s表示，两两之间的比较采用T检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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