心肌缺血再灌注损伤模型大鼠经艾塞那肽预处理后心肌细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明艾塞那肽可改善心肌梗死和心力衰竭等过程发挥心血管保护作用，但其对缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的作用尚未阐明。
目的：艾塞那肽预处理心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，观察其对心肌组织细胞凋亡及对凋亡因子Bcl-2、Bax表达的影响。
方法：建立心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，用艾塞那肽进行预处理，并设缺血再灌注组和假手术组作对照。
结果与结论：免疫组织化学染色、原位末端标记检测RT-PCR检测显示，与缺血再灌注组比较，艾塞那肽组Bcl-2的mRNA和蛋白表达显著升高(P < 0.05)，Bax mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.05)，心肌细胞凋亡指数显著降低(P < 0.05)。结果证实，艾塞那肽对大鼠心肌缺血再灌注有保护作用，其机制可能是通过上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，从而抑制心肌细胞凋亡有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤动物模型, 艾塞那肽, 心肌缺血再灌注, 细胞凋亡, Bax, Bcl-2, RT-PCR, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Exendin can regulate blood glucose, blood lipid and blood pressure, exert anti-inflammation and anti-oxidative stress effects, improve myocardial infarction and heart failure, and protect heart vessels. However, the effect on the apoptosis of cardiac muscle cells after ischemia/reperfusion injury remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the effects of Exendin-4 pretreatment on the cardiomyocyte apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury.
METHODS: The myocardial ischemia/reperfusion injury model was established in rats and then received Exendin-4 pretreatment. Ischemia/reperfusion group and sham operation group were set.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemical staining, TUNEL and reverse transcriptase-polymerase chain reaction results showed that Bcl-2 protein and mRNA expression levels in the Exendin-4 group were significantly increased (P < 0.05), while Bax protein and mRNA expression levels were significantly decreased compared with ischemia/reperfusion group (P < 0.05). In addition, apoptosis index was more significantly decreased in the Exendin-4 group than in the ischemia/reperfusion group (P < 0.05). Exendin-4 can protect rat heart muscle against ischemia/reperfusion injury and effectively inhibit the apoptosis of cardiomyocytes, and the underlying mechanism is mediated by up-regulating Bcl-2 expression and down-regulating Bax expression.

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Key words: Tissue Engineering, Myocardial Ischemia, Apoptosis, Genes

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

设计：随机对照动物模型实验。
时间及地点：实验于2013年7月至2014年10月在山西医科大学第二医院心胸外科实验室完成完成。
材料：健康雄性SD大鼠24只，体质量(250±50) g，购于山西医科大学动物实验中心。

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型艾塞那肽预处理后心肌细胞凋亡及 Bcl-2、Bax的表达所用主要试剂：
试剂	来源
艾塞那肽注射液	美国礼来公司
Bcl-2，Bax兔抗鼠多克隆抗体；过氧化物酶标记羊抗兔IgG；TUNEL法原位细胞凋亡检测试剂盒；DAB显色试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
RNA提取试剂Trizol试剂盒	大连TaKaRa生物公司

方法：
分组及干预：将SD大鼠24只随机分为3组，每组8只。假手术组：游离冠状动脉左前降支后只穿线不结扎，腹腔注射生理盐水。缺血再灌注组：腹腔注射生理盐水，结扎30 min后松扎，再灌注120 min。艾塞那肽组：于术前5 d开始腹腔注射艾塞那肽[40 mg/(kg•d)]，结扎左前降支前30 min再腹腔注射1次，结扎30 min后松扎，再灌注120 min。
构建心肌缺血再灌注损伤模型大鼠：在张元恒等[13]的方法并加以改进，术前禁食12 h，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射，麻醉后仰卧固定于操作台，记录标准Ⅱ导联心电图，胸部剃毛，常规消毒，气管切开后连动物呼吸机行机械辅助通气。左侧三四肋间开胸暴露心脏，于冠脉左前降支据左心耳下缘2 mm处穿线结扎。成功阻断冠状动脉左前降支的标志为：ECGⅡ导联S-T段呈弓背向上抬高；再灌注成功的标志为：抬高的S-T段逐渐下降50%以上。假手术组仅穿线不结扎，30 min后剪开结扎线，使左前降支再通，120 min后处死大鼠，取心脏受损心肌，部分甲醛固定，脱水透明后石蜡包埋，部分-80 ℃保存，用于检测RT-PCR相应指标。
免疫组织化学法检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达：取缺血区心肌，石蜡包埋切片预处理脱蜡至水，过氧化物酶阻断(体积分数3%H2O2室温15 min)，蒸馏水洗 2 min×2，PBS浸洗3 min×3次；柠檬酸盐缓冲液中抗原修复2 min，PBS浸洗3 min×3次，封闭20 min；滴加一抗Bcl-2，Bax兔抗鼠多克隆抗体(1∶100)，4 ℃过夜，PBS浸洗3 min×3次；滴加二抗过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗3 min×3次；DAB显色5-10 min，PBS浸洗5 min×3次；苏木精复染1 min，流水冲洗，脱水，透明，封固，光镜下观察Bcl-2阳性细胞为胞浆及胞膜内侧呈现棕黄色，Bax阳性细胞为胞浆呈现棕黄色。每组分别随机观察每例高倍镜下5个视野(×400)，采用BI-2000图像分析系统测定其阳性表达平均吸光度值，平均吸光度值高则Bcl-2和Bax的蛋白阳性表达高^[15]。
TUNEL检测大鼠缺血心肌细胞凋亡：在董小莉等[14]的TUNEL方法上加以改进，取缺血区心肌，石蜡包埋切片预处理脱蜡至水，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗 5 min×2次，蛋白酶K工作液20 mg/L溶于Tris/HCL(pH 7.4-8.0)中常温20 min，PBS浸洗5 min×3次，50 μL TUNEL反应液37 ℃ 60 min，PBS浸洗5 min×3次，50 μL POD   37 ℃ 30 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB显色5-10 min，PBS浸洗5 min×3次，苏木精复染1 min，流水冲洗，脱水，透明，封固，观察；以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照。在光学显微镜下观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡的心肌细胞核呈棕褐色或棕黄色。每张切片随机选择5个高倍镜视野(×400)，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%，取均值。
缺血心肌细胞bcl-2和bax mRNA的测定：取缺血再灌注区域心肌组织-80 ℃保存，用于RT-PCT。取缺血再灌注区域心肌组织100 mg，采用Trizol抽提心肌总RNA，反转录PCR反应，进行PCR扩增，检测缺血心肌组织中bcl-2、bax mRNA表达水平。RT-PCR仪进行PCR循环检测，扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，    72 ℃ 1 min，40个循环；终末72 ℃延伸10 min。以GAPDH为内参基因，采用相对定量方法2-ΔΔCt法进行统计分析。

引物信息：
基因	引物序列	片段长度
bcl-2	上游：5’-ATA CCT GGG CCA CAA GTG AG-3’ 下游：5’-TGA TTT GAC CAT TTG CCT GA-3’	207 bp
bax	上游：5’-CGA GCT GAT CAG AAC CAT CA-3’ 下游：5’-CTC AGC CCA TCT TCT TCC AG-3’	191 bp
GAPDH	上游：5’-AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3’ 下游：5’-CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3’	207 bp

主要观察指标：各组Bcl-2和Bax蛋白阳性表达水平、心肌细胞凋亡比例、bcl-2和bax mRNA的表达。
统计学分析：计量资料以x±s表示，应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，各组间数据比较采用单因素方差分析，并用Bonferroni 校正，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

探讨胰高血糖素样肽1在心肌保护中的作用与其是否与抑制心肌细胞凋亡有关[16-18]，Kavianipour等[19]在猪心肌梗死模型的研究中，胰高血糖素样肽1对心脏动力学和梗死面积并无影响，艾塞那肽作为一种胰高血糖素样肽1受体激动剂，因此，对于艾塞那肽对缺血再灌注心肌是否存在保护作用，及相关机制仍需要进一步研究探讨。
Bcl-2家族蛋白作为线粒体途径凋亡信号通路中关键的家族蛋白[20]，而线粒体转导的细胞凋亡信号通路是众多的细胞凋亡信号转导路径之一，凋亡抑制因子Bcl-2通过影响线粒体释放细胞色素C来调节细胞凋亡，Bax通过促进细胞色素C的释放从而促进细胞凋亡[21-24]，起到共同调控的作用[25-27]，所以Bcl-2/Bax比值可反映Bcl-2和Bax在细胞凋亡中的作用，比值升高，则抑制细胞凋亡，反之促进细胞凋亡[28-30]。
艾塞那肽干预缺血再灌注后心肌细胞凋亡结果发现，缺血再灌注组和艾塞那肽组Bcl-2和Bax蛋白表达水平明显高于假手术组；和缺血再灌注组比较，艾塞那肽组Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平升高，而Bax的mRNA和蛋白表达水平降低，细胞凋亡明显降低，提示艾塞那肽抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡与上调Bcl-2的表达，降低Bax的表达有关。TUNEL检测结果发现缺血再灌注组和艾塞那肽组细胞凋亡指数比假手术组明显升高，表明心肌缺血再灌注可导致心肌细胞凋亡；和缺血再灌注组比较，艾塞那肽组细胞凋亡指数降低，提示艾塞那肽可以改善缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。
综上所述，艾塞那肽对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其抗凋亡机制可能与上调Bcl-2的表达，降低Bax的表达有关。

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