针刺运动性疲劳模型大鼠不同穴位后心肌和肝脏组织的相关变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：中医针灸研究发现刺激某些穴位对运动后机体抗氧化能力确有一定的影响，而穴位不同配伍对机体的影响有所不同。
目的：对大鼠力竭游泳后不同组合的相关穴位进行针刺，探索不同的穴位配伍刺激方案对提高心肌及肝脏组织抗氧化能力的效果，筛选消除运动性疲劳的最有效的穴位组合。
方法：选取雄性健康成年大鼠70只随机分为对照组(n=10)、模型组(n=15)、三阴交+后三里组(n=15)、肾俞+后三里组(n=15)和大椎+后三里组(n=15)。后4组大鼠通过为期10 d的游泳训练(在4 d的适应性游泳训练后)建立力竭模型。三阴交+后三里组、肾俞+后三里组和大椎+后三里组大鼠，每次训练结束休息15 min后，分别对其三阴交+后三里、肾俞+后三里和大椎+后三里进行穴位针刺。
结果与结论：与对照组相比，模型组大鼠心肌和肝组织中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低，心肌丙二醛含量明显增加；与模型组相比，大椎+后三里组大鼠心肌组织超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高，肾俞+后三里组大鼠肝组织中超氧化物歧化酶活性显著升高，三阴交+后三里组和大椎+后三里组大鼠心肌丙二醛含量明显降低，三阴交+后三里组大鼠肝组织丙二醛含量明显降低。提示不同穴位组合针刺对大鼠心肌、肝脏组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛有不同的影响，穴位针刺对提高大鼠心肌抗氧化能力具有一定的效果，其中针刺大椎加后三里效果最明显，而对于肝脏组织抗氧化能力，针刺肾俞加后三里和三阴交加后三里有一定的特异性效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 针刺, 针刺穴位, 抗氧化剂, 疲劳

Abstract:

BACKGROUND: According to the theory of Traditional Chinese Medicine, stimulating certain acupoints of the body after exercise may improve its antioxidant capacity, but different acupoints have different effects.
OBJECTIVE: To compare the effect of different acupuncture combinations on the antioxidant capacity of myocardial and liver tissues in rats after exhausted swimming exercise, and screen out the optimal acupoint combination for exercise-induced fatigue.
METHODS: Seventy Sprague-Dawley male rats were divided into five groups: control group (n=10), model group (n=15), Sanyinjiao + Zusanli group (n=15), Shenshu + Zusanli group (n=15), Dazhui + Zusanli group (n=15). Except the control group, rats in the other four groups were subject to exhausted swimming. In the three acupuncture groups, rats were given acupuncture at corresponding acupint combinations at 15 minutes after exercise.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the myocardial and liver tissues were significantly reduced in the model group, while the malonaldehyde content in cardiac muscle was significantly increased. Compared with the model group, the activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the cardiac muscle were significantly increased in Sanyinjiao + Zusanli group, the superoxide dismutase in liver tissue was significantly increased in Shenshu Zusanli group, the malonaldehyde content in the myocardial tissue was significantly decreased in Sanyinjiao + Zusanli group and Dazhui + Zusanli group, the malonaldehyde content in the liver tissue was significantly decreased in Sanyinjiao + Zusanli group. Different acupuncture combinations have different effects on the activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase, as well as the malonaldehyde content in the myocardial and liver tissues of fatigued rats. Acupunture could increase the antioxidant ability in cardiac muscle of rats and the best combination might be Dazhui + Zusanli; acupoint combinations of Shenshu + Zusanli and Sanyinjiao + Zusanli are specific for liver tissue.

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中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析对照组10只大鼠无意外死亡发生，均正常生长。模型组在游泳训练阶段的第2，3，8，10天各死亡1只，剩余11只。三阴交+后三里组在适应性训练和正式训练中的第5，7天各死亡1只，剩余12只。肾俞+后三里组在适应性训练和正式训练中的第6天各死亡1只，剩余13只。大椎+后三里组在适应训练和正式训练中的第1天各死亡1只，剩余13只。进入结果分析的实验动物数量为对照组10只；模型组11只；三阴交+后三里组12只；肾俞+后三里组13只；大椎+后三里组13只(图1)。

2.2 不同穴位配伍针刺对运动性疲劳模型大鼠体质量的影响表1可见，造模前各组大鼠体质量接近(P > 0.05)，而2周后各组大鼠体质量均比造模前增加，但造模后各组大鼠体质量亦接近(P > 0.05)。

2.3 不同穴位配伍针刺对运动性疲劳模型大鼠心肌及肝组织中超氧化物歧化酶活性的影响与对照组相比，模型组大鼠心肌、肝组织超氧化物歧化酶活性显著降低(P < 0.05)；而与模型组相比，大椎+后三里组大鼠心肌组织超氧化物歧化酶活性显著升高(P < 0.05)，且大鼠心肌组织超氧化物歧化酶活性：大椎+后三里组>三阴交+后三里组>肾俞+后三里组，而肾俞+后三里组大鼠肝组织中超氧化物歧化酶活性明显高于模型组(P < 0.05)，三阴交+后三里组和大椎+后三里组大鼠肝组织中的超氧化物歧化酶活性与模型组接近(P > 0.05)，见表2。

2.4 不同穴位配伍针刺对运动性疲劳大鼠模型心肌及肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响与对照组相比，模型组大鼠心肌、肝组织谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，大椎+后三里组大鼠心肌谷胱甘肽过氧化物酶活性升高(P < 0.05)，且大鼠心肌谷胱甘肽过氧化物酶活性：大椎+后三里组>三阴交+后三里组>肾俞+后三里组，而三阴交+后三里组、肾俞+后三里组和大椎+后三里组大鼠肝组织谷胱甘肽过氧化物酶活性与模型组接近(P > 0.05)，见表3。

2.5 不同穴位配伍针刺对运动性疲劳模型大鼠心肌及肝组织中丙二醛含量的影响与对照组相比，模型组大鼠心肌和肝组织丙二醛含量明显增加(P < 0.05)；与模型组相比，三阴交+后三里组和大椎+后三里组大鼠心肌丙二醛含量明显降低(P < 0.01)，且大鼠心肌丙二醛含量：大椎+后三里组<三阴交+后三里组<肾俞+后三里组；与模型组相比，三阴交+后三里组大鼠肝组织丙二醛含量明显降低(P < 0.05)，而肾俞+后三里组和大椎+后三里组大鼠肝组织中丙二醛含量没有发生明显变化(P > 0.05)，见表4。

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引言

研究者们普遍认为运动性疲劳可能与能量大量消耗、代谢物堆积、内环境紊乱、自由基产生等有关^[1-3]。Dillard于1978年最早将自由基应用到运动科学领域，而运动过程中疲劳与自由基的关系也引起运动人体科学研究人员的注意。在平静正常的机体内，自由基浓度较安全，但是在剧烈运动时，机体会产生大量的自由基，当机体原来具有自由基防御体系不能够及时清除时，自由基便有可能攻击机体内的生物大分子，破坏机体细胞、组织以及生物膜系统，进而引发运动性疲劳，导致运动能力下降。因此，自由基的大量产生被认为可能是导致运动性疲劳的原因之一^[4]。研究显示，剧烈运动时心率提高，心输出量加大，心肌的功能提高、代谢加快，氧化磷酸化过程也随之加剧，使心肌细胞本身产生较多的自由基，从而造成心肌细胞内蛋白质变性，膜脂质过氧化，这样的变化进而引起心肌能量相关酶的活性降低，使能量再生成的过程产生障碍，而导致运动性疲劳^[5-8]。另有研究发现，剧烈运动后处于疲劳状态的机体，其心肌、肝脏组织抗氧化指标会发生敏感的、相应的变化，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，丙二醛含量升高等^[9-12]。
中医针灸作为中国传统文化的瑰宝，以独特的医疗手段，对于运动导致的机体变化可以通过平衡阴阳、舒筋通络、补气养血的机制来减轻和消除^[13-15]。某些穴位对运动后机体生理生化指标确有一定恢复作用，但也有发现穴位不同配伍，对机体的影响有所不同^[16-19]。基于作者所在课题组的前期研究^[17，20-22]，通过对力竭游泳训练后大鼠的足三里(ST36)和三阴交(SP6)、大椎(GV14)、肾俞(BL23)等穴位不同配伍后的穴位组合进行针刺，观察各组大鼠心肌细胞及肝脏组织抗氧化能力指标超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性高低和丙二醛含量的变化，探索不同的穴位组合刺激方案对运动性疲劳恢复的效果，以筛选出一组更为有效的、可应用于训练实践的、消除运动性疲劳的穴位和穴位组合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2013年12月在上海中医药大学动物实验室完成。
材料：清洁级健康成年雄性SD大鼠70只，体质量(200±30) g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物许可证号为SCXK(沪)2004-0003。在上海中医药大学实验动物中心饲养，国家标准啮齿动物饲料喂养，自由饮食。室温(20±2) ℃，相对湿度为45%-50%，光照时间为10 h。实验得到上海中医药大学动物伦理学委员会批准。
方法：
实验动物分组：大鼠随机分为对照组(n=10)、模型组(n=15)、三阴交+后三里组(n=15)、肾俞+后三里组(n=15)和大椎+后三里组(n=15)。各组大鼠初始体质量差异无显著性意义(P > 0.05)。
力竭模型的建立：对模型组、三阴交+后三里组、肾俞+后三里组和大椎+后三里组大鼠进行为期10 d的游泳训练(在4 d的适应性游泳训练后)。泳池为内壁光滑铁皮水槽，水深约80 cm，水温在(28±1)℃。第1-4天，训练时间为连续不间断100 min/d，第5-10天训练时间为连续不间断 120 min/d。参照McArdle等^[23-24]的标准，使所有大鼠出现力竭。对照组大鼠不运动，采用常规方式饲养。
针刺：三阴交+后三里组、肾俞+后三里组和大椎+后三里组大鼠，每次训练结束休息15 min后，俯卧姿势将其固定在大鼠台上，对其做穴位针刺。以相互协同增强疗效的原则进行配穴，以后足三里(膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm 处，左右各一穴，直刺 7 mm)搭配三阴交(后肢内踝尖直上10 mm，左右侧各一穴，直刺4.0-5.0 mm)、肾俞(第2腰椎下两旁，左右侧各一个，直刺6 mm)、大椎(第7颈椎与第1胸椎，背部正中，直刺5 mm)3个穴位^[25]。采用手针刺激，采用0.3 mm×25.0 mm 的不锈钢针灸针。刺激大椎、肾俞不留针，足三里、三阴交针刺时间1 min，在30 s时行针1次(捻转法行针，以右手拇指和中、食二指夹持针柄，来回旋转捻动180°(3次)。针刺治疗均由同一针灸医生操作。模型组大鼠也被固定在治疗台上，固定的时间和针刺治疗时间相同。对照组大鼠不加任何干预。
标本取材：在最后一次训练并针刺治疗后，把各组大鼠称体质量并立即取样。乙醚麻醉，取肝脏、心肌组织置于生理盐水中洗净血污后，用滤纸吸干后迅速切取2 cm3的心、肝的组织块立即置于预先备好的锡纸中，最后置于-20 ℃冰箱中保存以备测定。
氧化还原指标的分析：对样本进行超氧化物歧化酶(黄嘌呤氧化酶法)、谷胱甘肽过氧化物酶(二硫对硝基苯甲酸法)活性及丙二醛(硫代巴比妥酸法)含量测定^[26]。
主要观察指标：大鼠心肌及肝组织中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛含量。
统计学分析：所有实验数据均用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理，对各组数据的均数进行单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

超氧化物歧化酶以氧自由基为底物，研究发现其具有对抗氧化、炎症、辐射衰老等重要作用。当组织中超氧化物歧化酶含量和活性减少或者降低的时候，组织内大量的自由基就会引起堆积，进而攻击组织细胞。超氧化物歧化酶在机体内活性的变化有时可间接反映自由基的生成量和体内物质代谢情况。在许多运动生化研究中，学者常选用超氧化物歧化酶指标来反映机体内脂质过氧化反应的变化。有研究表明，强度较低的有氧运动可不同程度的提高组织超氧化物歧化酶活性^[27-30]。但剧烈运动大多引起超氧化物歧化酶活性下降。张钧等^[31]研究发现大鼠力竭运动后心肌超氧化物歧化酶活性显著性降低。Ji等^[32]报道经过大负荷运动后发现肝脏组织中的超氧化物歧化酶活性显著下降。王文信等^[33]发现力竭运动后心肌超氧化物歧化酶活性下降。张蕴琨等^[34]实验发现，大负荷力竭性游泳训练后，小鼠心脏、肝脏组织超氧化物歧化酶水平下降，而脑组织超氧化物歧化酶活性升高。金其贯等^[12]研究，大鼠8周运动训练后，过度训练组心肌超氧化物歧化酶活性显著下降。
实验发现超氧化物歧化酶活性变化规律和大部分文献吻合，且针刺大椎加后足三里可使心肌抗氧化能力的提高，而针刺(肾俞+后三里)对肝组织超氧化物歧化酶活性有特异性。从中医角度分析肾俞，是肾的背俞穴，为肾之精气输注于背腰部的输穴。有实验研究表明，针刺肾俞穴甚至可以激活机体类固醇物质的再生[35]。足三里穴，增强机体应激能力、增强免疫功能、提高机体抗病能力等作用，现代医学研究也证实，针灸刺激足三里穴，可以改善心肺功能，增加红细胞、白细胞、血色素和血糖量。这对穴位组合使血流循环得到有效的的改善^[36]。“肝藏血”、“肝主筋”，当肝脏中的血液充足的时候，血液就能够补充与肌肉和肌腱当中，使肌肉和肌腱在运动中发挥更好的运动功能，导致了肝脏中的自由基水平下降，减轻或者缓解了运动产生的疲劳。
丙二醛是机体氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应而产生的脂质过氧化物^[37]，是衡量机体自由基代谢水平的敏感指标，而且由于丙二醛在机体内存在的时间较长，所以在运动生化的实验中常常用测定各组织中丙二醛的含量来间接反应机体受损程度及体内自由基代谢的情况。自由基增多会造成机体脂质过氧化和蛋白质、DNA等分子的损伤，可对生物膜系统造成危害，导致有机体运动机能下降。伏育平[38]认为，大负荷力竭运动后心肌丙二醛含量明显增加可能是力竭训练后心肌损伤的主要机制。张钧等^[31]也发现，大鼠力竭性游泳训练后，心肌线粒体丙二醛含量显著升高。乔玉成^[9]研究发现，大鼠力竭性游泳后18 h，心肌丙二醛含量比对照组增加44.12%。时庆德等^[39]实验表明，大鼠进行中等强度力竭性跑台跑训练后，肝脏中线粒体超氧阴离子生成量显著增加，同时，脂质过氧化水平也显著提高。郭世炳等^[40]研究得出，小鼠在动物跑台上以25 m/min的速度运动90 min和120 min时，发现肝脏及肌肉组织中丙二醛含量均增高，间接反应了体内肝脏和肌肉组织的自由基显著增多。崔勋等^[41]报道大鼠进行游泳训练60 min后，血浆、肌肉和肝细胞线粒体中的丙二醛含量明显的的高于安静状态。虽有相反的研究案例，如史亚丽等^[42]发现小鼠经游泳训练后，安静时心肌、肝脏中丙二醛与对照组小鼠相比显著降低。王安利等^[43]实验发现小鼠经7周游泳训练后，安静时肝内丙二醛与未训练鼠相比显著降低。但大多数报道支持第一种结果^[10-12]，即力竭运动后机体的丙二醛含量较安静时明显增高，本实验结果与大多数报道相同。
针灸穴位对心肌、肝脏组织丙二醛有良性影响。这一现象可能反映了，针刺三阴交结合后足三里穴位组对肝脏组织的抗氧化能力有特异性，可以抑制力竭运动所致肝脏组织脂质过氧化水平的增加，能有效地保护肝脏组织细胞免受自由基的损伤，增强肝脏组织的抗氧化能力，减轻了细胞的损伤。从中医角度分析：三阴交为足太阴、少阴、厥阴经交会穴，有温中补虚、健脾益气、兼利水湿的功效，针刺三阴交穴可以增加心脑血流量，对心脑血管及血液循环系统产生良好影响。同时，针刺三阴交穴能使患者获得正常睡眠，身体机能更快恢复，提高了免疫机能和抗病能力^[44]。谷胱甘肽过氧化物酶主要作用是清除H₂O₂和脂质过氧化物，是机体抗氧化系统中的一种重要的酶，还具有诸如防止畸变，预防衰老，参与前列腺素合成等众多生理作用。有报道称超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶具有一定的正相关性，但此观点没有得到运动科学领域其他学者的进一步的认证^[45]。伏育平^[38]研究中，急性运动后大鼠心肌组织的谷胱甘肽过氧化物酶活性也有明显下降，且48 h内仍不能完全恢复。胡红梅等^[10]研究发现，大鼠游泳至力竭时，谷胱甘肽含量下降。Lew等[46]报道大鼠跑台跑至力竭时，肝脏、骨骼肌谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽还原酶活性升高。郭海英等^[47]对大鼠进行长期的定量负荷训练后，其肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性增加。Kanter等[48]报道大鼠9周游泳训练后血液和肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著增高。赖红梅^[49]报道，SD成年大鼠力竭运动后即刻，血液和肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，均比安静时显著上升。本实验中模型大鼠心肌谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低。结合大多数学者的研究结果，其原因可能是大负荷运动使大鼠自由基的产生超出了谷胱甘肽过氧化物酶的清除能力，堆积的自由基与体内多种物质等发生反应，使机体细胞功能和结构损伤和破坏，从而造成谷胱甘肽过氧化物酶失活，阻断了其对H₂O₂的催化还原反应，使心肌收缩力下降，出现疲劳症状。针刺大椎+足三里对心肌谷胱甘肽过氧化物酶活性影响较大。但对于肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性，3种穴位组合的刺激方法都没有显著性差异，提示针灸对肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性影响不大。
作者发现，穴位针刺后，大鼠心肌超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶活性均有良性变化，这一结果和大部分文献的研究也是一致的；如徐兰凤等^[50]发现保健灸对提高机体超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量的积极作用。朱梅菊等^[51]对游泳训练小鼠进行针刺足三里的实验，发现刺激足三里穴能提高运动后小鼠血浆、肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛含量，增强小鼠运动时的耐力，他们认为其机制与纠正运动小鼠自由基代谢失衡有关。李晓全等[52]研究发现，针刺补法和隔姜灸足三里穴均能明显提高超氧化物歧化酶的活性，从而有效地增强了机体清除自由基和脂质过氧化物的能力，达到延缓衰老的目的。李艳慧[53]研究发现，针灸对机体内超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶的活性的提高有一定的效果。
综上，①极限游泳对大鼠心肌、肝脏组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛有一定的影响；提示大负荷运动可能引起机体组织抗氧化能力降低。②穴位针刺对大鼠心肌、肝脏组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛有不同的影响，穴位针刺对提高大鼠心肌抗氧化能力具有一定的效果，其中针刺大椎加足三里效果最明显。而对于肝脏组织抗氧化能力，针刺肾俞加足三里和三阴交加足三里有一定的特异性效果。③针刺特定穴位或穴位组合也许可以通过提高机体抗氧化能力减轻大负荷运动后机体疲劳的症状，以后应进一步结合其它的生理生化指标的研究，以获得更多的证据。

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