脐带沃顿胶干细胞移植对脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.021

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (23): 3729-3735.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.021

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脐带沃顿胶干细胞移植对脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响

马珊珊¹，渠瑞娜¹，田毅²，姚宁¹，崔渊博¹，韩康¹，邢衢¹，杨波²，关方霞^1，2

1郑州大学生命科学学院，河南省郑州市 450001；
2郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052

出版日期:2015-06-04 发布日期:2015-06-04
通讯作者: 关方霞，教授，博士生导师，郑州大学生命科学学院，河南省郑州市 450001；郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052
作者简介:马珊珊，女，1984年生，河南省开封市人，汉族，2011年浙江大学毕业，博士，副教授，主要从事干细胞和再生医学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171177；U1404313)；河南省高校科技创新团队(15IRTSTHN022)

Effects of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cell transplantation on the expression of inflammatory factors in rats with spinal cord injury

Ma Shan-shan¹, Qu Rui-na¹, Tian Yi², Yao Ning¹, Cui Yuan-bo¹, Han Kang¹, Xing Qu¹, Yang Bo², Guan Fang-xia^{1, 2}

1School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China;
2Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Online:2015-06-04 Published:2015-06-04
Contact: Guan Fang-xia, Professor, Doctoral supervisor, School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China; Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Ma Shan-shan, M.D., Associate professor, School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171177; U1404313; a grant from Science & Technology Innovation Foundation for Higher Education Institutes of Henan Province of China, No. 15IRTSTHN022

摘要/Abstract

摘要：

背景：免疫炎症反应促使大量炎症因子的产生和释放是继发性脊髓损伤的其对主要原因。
目的：探讨脐带沃顿胶干细胞移植对急性脊髓损伤大鼠的神经修复作用及其对炎症因子单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素10表达的影响。
方法：81只健康成年雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组和脐带沃顿胶干细胞移植组(n=27)，后两组以脊髓半切方法建立急性脊髓损伤模型，造模后脐带沃顿胶干细胞移植组经尾静脉移植1×10⁶个脐带沃顿胶干细胞。移植后不同时间通过BBB评分评价各组大鼠的运动功能；ELISA检测不同时间点各组大鼠血清中单核细胞趋化蛋白1的含量；qRT-PCR和Western分析不同时间点损伤脊髓组织中单核细胞趋化蛋白1及白细胞介素10的表达；免疫组织化学检测损伤组织中脐带沃顿胶干细胞的迁移和神经分化情况。
结果与结论：与假手术组和模型组相比，脐带沃顿胶干细胞移植组大鼠的神经功能明显恢复(P < 0.05)。脐带沃顿胶干细胞移植组大鼠血清中单核细胞趋化蛋白1水平显著低于模型组(P < 0.05)。脐带沃顿胶干细胞移植组脊髓组织单核细胞趋化蛋白1 mRNA和蛋白表达显著低于模型组(P < 0.05)，白细胞介素10 mRNA和蛋白表达显著高于模型组(P < 0.05)。移植组中脐带沃顿胶干细胞可迁移至损伤部位，并表达神经胶质纤维酸性蛋白。这些结果提示脐带沃顿胶干细胞可能通过调控脊髓损伤组织的炎症反应，促进神经修复，这也可能是脐带沃顿胶干细胞治疗脊髓损伤的机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 脊髓损伤, 沃顿胶干细胞, 移植, 神经修复, 单核细胞趋化蛋白1, 白细胞介素10, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The production and release of a large amount of inflammatory factors caused by immune system inflammatory response mainly contributes to secondary spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effects of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cell transplantation on repair of injured neurological function and expression of inflammatory factors monocyte chemoattractant protein 1 and interleukin 10 in rats with acute spinal cord injury.
METHODS: Eighty-one healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly and equally divided into sham operation, model and cell transplantation groups, with 27 rats per group. Rats in the latter two groups were subjected to hemisection of the spinal cord to establish acute spinal cord injury models. Rat models in the cell
transplantation group received umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cell injection (1×10⁶) via the tail vein. Rat neurological function was evaluated using the BBB score at different time points after spinal cord injury. The expression of monocyte chemoattractant protein 1 and interleukin 10 in injured spinal cord tissue was detected using ELISA assay at different time points after spinal cord injury. Migration and neuronal differentiation of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells in the injured spinal cord tissue were determined using immunohistochemical staining method.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation and model groups, rat neurological function was significantly recovered in the cell transplantation group (P < 0.05). Compared to the model group, monocyte chemoattractant protein 1 level in the serum and monocyte chemoattractant protein 1 mRNA and protein expression in the injured spinal cord tissue were significantly lower (P < 0.05), but interleukin 10 mRNA and protein expression in the injured spinal cord tissue was significantly higher (P < 0.05), in the cell transplantation group. In the cell transplantation group, umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells could migrate to the injured region and express glial fibrillary acidic protein. These findings suggest that umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells promote rat neurological function recovery by regulating the inflammatory response in the injured spinal cord tissue, which is likely to be one of mechanisms by which transplantation of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells treats spinal cord injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中图分类号:

R394.2

马珊珊，渠瑞娜，田毅，姚宁，崔渊博，韩康，邢衢，杨波，关方霞. 脐带沃顿胶干细胞移植对脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3729-3735.

Ma Shan-shan, Qu Rui-na, Tian Yi, Yao Ning, Cui Yuan-bo, Han Kang, Xing Qu, Yang Bo, Guan Fang-xia. Effects of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cell transplantation on the expression of inflammatory factors in rats with spinal cord injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3729-3735.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 81只SD大鼠纳入实验并进行结果分析，中途脱落2只，重新造模进行补充。
2.2 大鼠后肢运动情况及行为学评分 BBB评分结果显示(图1)，假手术组大鼠左后肢运动功能于1 d后基本正常恢复21分；模型组在14 d以后趋于稳定，大约6分；沃顿胶干细胞移植组在14 d以后仍然升高，28 d时评分达到约10分。假手术组与模型组和移植组在各时间点差异均有显著性意义(P < 0.05)，7 d后移植组与模型组间差异也有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 苏木精-伊红染色检测各组大鼠脊髓组织的形态变化如图2所示，假手术组大鼠的脊髓组织结构完整，神经细胞形态正常；模型组损伤区出现软化灶，细胞杂乱无章的排列并产生空泡；而沃顿胶干细胞移植组中损伤部位呈现大量规则排列的细胞，空洞变小，而且部分细胞与脊髓组织融合，该结果说明沃顿胶干细胞移植能够促进损伤脊髓组织结构的恢复。

2.4 ELISA检测各组大鼠血清中单核细胞趋化蛋白1水平如图3所示，假手术组中单核细胞趋化蛋白1一直处于稳定表达水平；损伤后模型组和沃顿胶干细胞移植组中单核细胞趋化蛋白1的表达开始增高，沃顿胶干细胞移植组相对滞后于模型组，12 h时两组血清中单核细胞趋化蛋白1的表达均达到峰值，并且沃顿胶干细胞移植组的表达量显著低于模型组(P < 0.05)，随后逐渐趋于正常水平。

2.5 各组不同时间点脊髓组织中单核细胞趋化蛋白1 mRNA及蛋白表达变化 qRT-PCR结果显示(图4)，模型组与假手术组相比，单核细胞趋化蛋白1 mRNA于伤后即表达增加，损伤24 h后达到峰值(P < 0.05)，随后逐渐降低，约168 h后降至正常水平(P > 0.05)。沃顿胶干细胞移植组中单核细胞趋化蛋白1的表达在伤后3 h开始增加，且显著低于模型组的表达，二者之间差异有显著性意义(P < 0.05)。Western Blot也有相似的表达趋势。该结果说明沃顿胶干细胞移植可显著抑制损伤部位单核细胞趋化蛋白1在转录水平和蛋白水平的表达。

2.6 术后各组不同时间点脊髓组织中白细胞介素10 mRNA及蛋白表达变化 qRT-PCR结果显示，模型组和沃顿胶干细胞移植组中白细胞介素10 mRNA的表达均高于假手术组，达到峰值后逐步降低至正常水平。相较于模型组，沃顿胶干细胞移植组中白细胞介素10的表达明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05，图5)。该结果说明沃顿胶干细胞移植可以促进损伤区域白细胞介素10的表达。
2.7 免疫组化检测沃顿胶干细胞的迁移和分化 MAB1281为人细胞核抗体，可以用来检测人源性沃顿胶干细胞移植入大鼠体内的迁移和存活。脊髓损伤后28 d损伤脊髓MAB1281-神经胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色结果显示，沃顿胶干细胞移植组损伤区出现棕黄色的MAB1281阳性细胞，且MAB1281阳性细胞胞浆中呈神经胶质纤维酸性蛋白阳性表达(图6)，阳性细胞率大概为25.83%；而假手术组和模型组呈现阴性结果。该结果说明移植组中沃顿胶干细胞能够迁移至损伤部位，并分化为神经细胞。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2013年1月至2014年3月在郑州大学生命科学学院和实验动物中心完成。
材料：
实验动物：81只清洁级成年雄性SD大鼠，体质量200-220 g，由郑州大学实验动物中心提供。

脐带沃顿胶干细胞移植修复脊髓损伤实验所用主要试剂：
试剂	来源
Trizol试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒	TaKaRa公司，日本
单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素10引物、ELISA试剂盒	上海生工生物技术有限公司
免疫组化、Western试剂盒	鼎国生物技术有限公司
神经胶质纤维酸性蛋白、单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素10、β-actin抗体	Santa Cruz，美国
MAB1281抗体	Millipore，美国

实验方法：
沃顿胶干细胞的分离、培养及鉴定：取健康足月顺产孕妇的新鲜脐带，剥离动脉和静脉后，将脐带剪成 1.0-1.5 mm3的组织块，转入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶中，置于37 ℃，含有体积分数为5%的CO2恒温培养箱内培养。每2 d或3 d换液1次，去除未贴壁细胞。待细胞达到80%-90%融合时，胰蛋白酶消化后传代。取第3代沃顿胶干细胞用流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原标记。
脊髓损伤动物模型的制作：大鼠常规消毒，腹腔注射10%水合氯醛(约4 mL/kg)，然后脱毛暴露手术区，固定于立体定位仪。采用脊髓半切手术建立一种新型的急性闭合性大鼠脊髓半切损伤模型，具体制备方法按文献[17]进行。
实验分组与干细胞移植：随机将81只SD大鼠分成3组：假手术组、模型组和沃顿胶干细胞移植组，每组27只。沃顿胶干细胞移植组大鼠于脊髓损伤后10 min经尾静脉移植1×10⁶个第3代沃顿胶干细胞，模型组大鼠经尾静脉注射同等体积的生理盐水。术后每只大鼠皮下注射20×10⁴ U青霉素。
行为学评价各组大鼠运动功能恢复情况：各组随机选取6只大鼠，于移植后第1，3，7，14，21和28天的固定时间，根据BBB评分量表^[22]，评价各组大鼠的运动功能并记录评分。
苏木精-伊红染色检测各组大鼠脊髓组织的病理变化：大鼠脊髓损伤部位组织石蜡包埋切片，常规行苏木精-伊红染色，光镜下观察组织病理变化。
ELISA检测各组大鼠血清中单核细胞趋化蛋白1的含量：每个时间点随机选取3只大鼠，分别于移植后0，3，6，12，24，72，168 h将大鼠麻醉，心脏取血，然后将血样于4 ℃冰箱静置4 h后取上清液，按照ELASA试剂盒的操作说明检测各组动物不同时间点血清中单核细胞趋化蛋白1的含量。
qRT-PCR法检测脊髓组织中单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素10 mRNA的表达：上述大鼠取血后，固定于手术台上，分离损伤部位脊髓组织，清洗干净后液氮冻存。Trizol法抽提组织总mRNA，反转录成cDNA。在Fast 7500 Real Time System上，采用TaKaRa公司的SYBR® PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒并按说明书进行qRT-PCR反应， GAPDH作为内参，每组3个复孔。反应结束后观察扩增曲线和熔解曲线。根据文献描述的Ct法获得基因的相对表达量(RQ)=2-??Ct[23]，再通过GraphPad Prism 5作图。实验所用引物序列见表1。

Western blot检测单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素10蛋白的表达：各组样品加入适量蛋白裂解液充分裂解蛋白后离心收集上清，BCA法测量蛋白浓度。取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离。转膜后置于5%的脱脂奶粉溶液中封闭1.5 h；分别加入单核细胞趋化蛋白1一抗(1︰500稀释)、白细胞介素10一抗(1︰1 000稀释)，于4 ℃孵育过夜；TBST充分洗5次，用HRP标记的二抗孵育1.5 h后充分洗膜，然后ECL发光成像，扫描结果用Image J软件进行蛋白灰度分析。
免疫组化检测组织中MAB1281和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达：移植后28 d，运动功能评分后每组取3只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取损伤区脊髓组织，常规脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。用SP法进行免疫组化染色，检测各组标本中MAB1281和神经胶质纤维酸性蛋白表达，1 000倍显微镜下随机选取5个视野观察并计算神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞百分率。
主要观察指标：①行为学观察大鼠后肢运动功能。②苏木精-伊红染色观察组织学变化。③ELISA检测各组大鼠血清中单核细胞趋化蛋白1的含量。④qRT-PCR和Western blot检测单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素10 mRNA和蛋白的表达。⑤免疫组织化学染色检测沃顿胶干细胞的迁移和分化情况。
统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。各组大鼠BBB评分采用重复测量数据的方差分析，术后不同时间单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素10在转录水平和蛋白水平的表达差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。检验水准α=0.05。

讨论

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤疾病，严重危害人类的健康。随着工业、建筑业和交通的发展，脊髓损伤的发病率逐年升高，对脊髓损伤的干预和治疗迫在眉睫。本实验室前期结果表明沃顿胶干细胞对脊髓损伤大鼠具有神经保护作用^{[17，21，24]}。王革生等^[25]发现沃顿胶干细胞移植到宿主损伤脊髓后可以存活、迁移，并向神经元样和星形胶质细胞分化，能够促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复。但是，沃顿胶干细胞治疗脊髓损伤的分子机制还不清楚。
目前研究认为脊髓损伤会引起脊髓组织缺血、脂质过氧化以及炎症细胞浸润和炎症因子的释放^[26-27]，其中损伤区严重的免疫炎症反应促使大量炎症因子的产生和释放是继发性脊髓损伤的主要原因^[21，28-29]。因此，有效控制脊髓损伤后的炎症反应是改善预后的关键之所在。研究表明单核细胞趋化蛋白1可趋化、激活巨噬细胞，参与介导脊髓损伤部位的继发性炎症反应，导致脊髓继发性损伤^[30]。而白细胞介素10能够在损伤早期通过对NF-κB转录因子的抑制作用来抑制炎症反应。课题组前期研究发现沃顿胶干细胞移植能够抑制损伤部位肿瘤坏死因子α的表达，同时促进脑源性神经营养因子的表达，可能是促进大鼠神经功能恢复的机制之一^[17，31-32]。但是沃顿胶干细胞移植与单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素10表达在减少脊髓损伤继发性损伤中的相关性还不清楚。
本实验从脐带沃顿胶组织中分离、培养沃顿胶干细胞，经尾静脉植入脊髓损伤模型。研究发现脊髓损伤大鼠神经功能障碍在1 d达到高峰，随着时间延长BBB评分有所增加，但沃顿胶干细胞移植组BBB评分显著高于模型组，说明脊髓损伤早期沃顿胶干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。移植28 d的免疫组化结果显示，损伤区可观察到MAB1281和神经胶质纤维酸性蛋白双标染色的阳性细胞，说明沃顿胶干细胞可迁移至损伤部位，并进一步分化为神经细胞。
实验也证实单核细胞趋化蛋白1在脊髓损伤后表达明显升高，随后逐渐趋于正常水平，这与张群等[30]的研究一致。赵峰等[33]发现骨髓干细胞移植可以降低肺损伤大鼠单核细胞趋化蛋白1的表达。本实验也发现沃顿胶干细胞移植组单核细胞趋化蛋白1的表达显著低于模型组的表达，该结果说明沃顿胶干细胞移植可显著抑制损伤部位单核细胞趋化蛋白1的表达。相反，沃顿胶干细胞移植可促进白细胞介素10的表达，进而抑制炎症反应带来的继发性脊髓损伤，这与罗文芳等[34]在脑出血大鼠中发现的神经干细胞移植可上调白细胞介素10的结果一致。
干细胞能够促进脊髓损伤大鼠的神经修复，但是分子机制可能是多方面的^[35-37]，比如替代受损细胞、为损伤微环境提供营养支持和抑制损伤局部的免疫炎症等^[38-43]。该研究显示沃顿胶干细胞可迁移至损伤部位并分化为神经细胞，抑制单核细胞趋化蛋白1和增加白细胞介素10的表达，提示沃顿胶干细胞可能通过调控脊髓损伤组织的炎症反应，促进脊髓损伤大鼠的神经功能修复。该结果表明干细胞对免疫炎症反应的调节可能是其促进损伤组织神经功能修复的机制之一，也为进一步降低免疫反应，采取新的抗炎措施提高损伤修复的效果提供理论依据，具有重要的研究意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脐带沃顿胶干细胞移植对脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响

Effects of umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cell transplantation on the expression of inflammatory factors in rats with spinal cord injury

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