骨髓间充质干细胞诱导胆管内皮细胞与电纺纳米纤维的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.022

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (23): 3736-3743.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.022

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骨髓间充质干细胞诱导胆管内皮细胞与电纺纳米纤维的生物相容性

杨扬¹，周家华¹，殷雪琰²，徐勇¹，曹阳²，许茜²

1东南大学附属中大医院肝胆胰中心，江苏省南京市 210009；
2东南大学公共卫生学院，江苏省南京市 210009

出版日期:2015-06-04 发布日期:2015-06-04
通讯作者: 周家华，博士，教授，主任医师，东南大学附属中大医院肝胆胰中心，江苏省南京市 210009
作者简介:杨扬，男，1985年生，山西省盂县人，汉族，2011年东南大学毕业，硕士，医师，主要从事胰腺与胆道疾病的临床与基础研究。
基金资助:
江苏省卫生厅医学基金项目(H200815)，项目名称：组织工程胆管的应用研究

Biocompatibility of porcine bone marrow mesenchymal stem cells-derived bile duct endothelial cells with electrospun nanofibers

Yang Yang¹, Zhou Jia-hua¹, Yin Xue-yan², Xu Yong¹, Cao Yang², Xu Qian²

1Hepatobiliary & Pancreatic Center, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China;
2College of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Online:2015-06-04 Published:2015-06-04
Contact: Zhou Jia-hua, M.D., Professor, Chief physician, Hepatobiliary & Pancreatic Center, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
About author:Yang Yang, Master, Physician, Hepatobiliary & Pancreatic Center, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Supported by:
Medical Foundation of Department of Public Health of Jiangsu Province of China, No. H200815

摘要/Abstract

摘要：

背景：胆管损伤修复是腹部外科手术的难题，组织工程胆管是解决这一难题的理想方法，而构建性能优异的组织工程胆管支架是这一研究的关键。
目的：观察猪骨髓间充质干细胞诱导分化的胆管内皮细胞与电纺纳米纤维的生物相容性。
方法：将猪骨髓间充质干细胞于体外定向分化为肝干细胞，再进一步分化为胆管内皮细胞，并通过形态学及RT-PCR对分化完成的细胞加以鉴定。用静电纺丝方法制备聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维膜，通过扫描电镜观察其形态，并测定其短期(2周)内体外降解率。将分化的胆管内皮细胞与纳米纤维复合培养，观察细胞在纳米纤维表面的黏附、增殖能力，荧光染色观察细胞形态及在材料表面的分布情况，扫描电镜观察细胞在纳米纤维表面生长形貌。
结果与结论：骨髓间充质干细胞体外定向分化4周后，细胞呈现典型树枝状胆管内皮细胞形态学改变，并且有CK19的表达。扫描电镜照片显示电纺材料为连续的纳米纤维，纤维直径均分布在200-500 nm范围内，在2周内聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维没有发生明显的降解。通过细胞黏附率计算、MTT法检测、荧光染色及扫描电镜观察证明猪骨髓间充质干细胞诱导分化后的胆管内皮细胞与聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 分化, 组织工程胆管, 骨髓间充质干细胞, 胆管内皮细胞, 电纺纳米纤维

Abstract:

BACKGROUND: Repair of extrahepatic biliary tract injury is a difficult problem in the abdominal surgery. Tissue-engineered extrahepatic biliary tract is an ideal selection for this problem. Construction of tissue-engineered extrahepatic biliary tract with excellent performance is a key to related studies.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of bile duct endothelial cells differentiated by porcine bone marrow mesenchymal stem cells with electrospun nanofibers.
METHODS: Porcine bone marrow mesenchymal stem cells were induced toward biliary tract endothelial cells, which were then identified by morphology and RT-PCR. Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanofiber membranes were prepared by electrospinning. The morphology was determined by scanning electron microscopy and the short-term (2-week) in vitro degradation rate was determined. Adhesion and proliferation of biliary tract endothelial cells on the nanofiber surface was analyzed by calculating the cell adhesion rate and MTT assay, respectively. Cell growth, morphology and distribution on the material surface were observed by fluorescence staining and scanning electron microscopy, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After 4 weeks of directed differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro, cells showed typical morphology of dendritic bile duct endothelial cells and had the expression of CK19. Scanning electron micrographs showed that electrospun materials were continuous nanofibers with diameters between 200 and 500 nm. No significant degradation of the PLGA nanofibers was observed within 2 weeks. Based on the measured cell adhesion rate, MTT assay, fluorescence staining, and scanning electron microscopy, the differentiated cells possessed a good proliferative capacity on PLGA nanofibers. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into bile duct endothelial cells in vitro. Materials prepared by the electrospinning method had a nanofiber structure, which did not significantly degrade within 2 weeks. Differentiated cells exhibit good biocompatibility with the nanofibers.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Bile Duct Endothelial Cells, Nanofibers, Biocompatible Materials

中图分类号:

R394.2

杨扬，周家华，殷雪琰，徐勇，曹阳，许茜. 骨髓间充质干细胞诱导胆管内皮细胞与电纺纳米纤维的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3736-3743.

Yang Yang, Zhou Jia-hua, Yin Xue-yan, Xu Yong, Cao Yang2, Xu Qian. Biocompatibility of porcine bone marrow mesenchymal stem cells-derived bile duct endothelial cells with electrospun nanofibers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3736-3743.

图/表（结果） 5

2.1 聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维微观形貌分析扫描电镜观察3种比例的聚乳酸-羟基乙酸电纺纤维的表面微观形貌，可以看出电纺纤维表面光滑，直径均一，没有膨大的珠状结构或者黏并现象，纤维呈现相互连通的三维网络状结构(图2)，纤维直径均分布在200-500 nm范围内，纤维膜厚度为120-150 µm。
2.2 聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维的体外降解情况检测3种比例的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维在2周之内质量和降解液pH变化情况。由于更易于降解的聚羟基乙酸所占比例较大，聚乳酸-羟基乙酸50/50的质量损失较其他两种比例的材料稍快，在2周时其残留质量为初始质量的90.46%，相应的pH值从7.2降到了6.87。聚乳酸-羟基乙酸75/25、聚乳酸-羟基乙酸90/10纳米纤维的质量损失和pH变化都较慢，残留质量分别为初始质量的91.35%和93.18%，pH分别为6.94和7.0。
第14天3种不同比例的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维微观形貌变化见图3，各种比例的聚乳酸-羟基乙酸材料经过短期的降解后，纳米纤维结构仍然存在，没有发生明显的变形。聚乳酸-羟基乙酸50/50的部分纳米纤维发生了明显的溶解，与其质量损失最明显是相符的。聚乳酸-羟基乙酸75/25的纳米纤维未见明显的溶解，但纤维表面可见材料因降解而出现的孔洞。聚乳酸-羟基乙酸90/10的纳米纤维排列较前稍有紊乱，部分纤维出现了断裂，但纤维未见明显的溶解及孔洞，表明其降解较其他两种比例的材料缓慢。

2.3 骨髓间充质干细胞生长、形态观察及其表型鉴定实验通过密度梯度离心法和全骨髓培养法获取猪骨髓间充质干细胞，根据骨髓间充质干细胞的细胞密度大小，采用Percoll液(1.077 g/mL)进行密度梯度离心，获得单个核细胞群，再根据间充质干细胞贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，原代细胞接种后24 h细胞开始贴壁生长，细胞多呈圆形或类圆形，通过定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞、内皮细胞等，随培养天数的增加，贴壁细胞不断增殖，周围的细胞逐渐伸张为纺锤形或梭形，最后变为长梭形(图4)。随着细胞传代培养，最后可获得纯度达95%的间充质干细胞。
流式细胞仪检测分析细胞周期的结果显示G0/G1的细胞比例为89.6%，提示骨髓间充质干细胞有高度多向分化潜力。
2.4 骨髓间充质干细胞向肝干细胞分化更换诱导分化培养液后约6 d，在肝细胞生长因子的作用下，细胞形状从梭形逐渐变成多角形，约2周出现卵圆形改变(图4)，并且细胞在体外呈集落样生长。
加入诱导剂后细胞培养液中碱性磷酸酶、甲胎蛋白及白蛋白的变化见表1。实验组中间充质干细胞标记物碱性磷酸酶水平较对照组明显降低(P < 0.01)，而两种肝干细胞标记甲胎蛋白、白蛋白水平较对照组明显升高(P < 0.01)，这表明骨髓间充质干细胞在体外经诱导后向肝干细胞分化。

2.5 肝干细胞向胆管内皮细胞分化肝干细胞分化完成后，继续诱导肝干细胞分化为胆管内皮细胞，培养2周后出现呈短梭形或树枝样排列典型胆管内皮细胞形态(图4)。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，清晰可见409 bp的电泳条带(图5)，表明经定向分化后的胆管内皮细胞存在CK19的表达，证实分化细胞为胆管内皮细胞，与文献报道相似^[10-11]。

2.6 细胞黏附率测定在培养4 h时，细胞在聚乳酸-羟基乙酸50/50、75/25、90/10 3种材料表面黏附率分别为68.3%、66.7%、70%，在培养24 h时，细胞黏附率分别上升至76.7%、75%、78.3%。3种比例材料之间细胞黏附率差异无显著性意义。
2.7 分化细胞在支架材料上的增殖能力胆管内皮细胞在3种比例聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维上分别培养3 d和 7 d，都显示出良好的增殖能力(表2)。3种不同比例的聚乳酸-羟基乙酸电纺纳米纤维组和对照组的吸光度值均随培养时间的增加而增大，差异有显著性意义(P < 0.05)；在各检测时间点，3种比例的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维与对照组吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，显示它们之间对细胞的增殖没有差异。

2.8 DAPI染色观察细胞在聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面密度及分布胆管内皮细胞与聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维共培养3 d，倒置显微镜和荧光显微镜下观察可见细胞在3种材料表面分布均匀，细胞密度高，生长旺盛(图6)。
2.9 扫描电镜观察细胞在聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面生长形貌胆管内皮细胞在聚乳酸-羟基乙酸电纺纳米纤维材料表面贴附牢固，具有良好的生长形态，呈现类圆形，伸展充分，胞突细长。细胞与纤维之间、细胞与细胞之间均有较多树枝状的突起相互交连(图7)。

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引言

胆肠吻合术是目前修复与重建肝外胆道常用的治疗手段，该手术能疏通胆道，但手术改变了胆道正常生理途径，会使Oddi括约肌功能丧失，治疗后易发生逆行感染、吻合口狭窄等并发症。设计一种可以代替胆道结构和功能的人工胆管，或许是一种简单有效的方法^[1]。
种子细胞和支架材料是组织工程的两大关键因素。骨髓间充质干细胞是组织工程中常选用的种子细胞，其具有分化为多种细胞的潜能，在体外诱导条件下可分化为胆管内皮细胞和平滑肌细胞^[2]。人工胆管作为人体内的植入物，所用的支架材料需要具备良好的生物相容性、可塑性、一定的机械强度、三维立体多孔结构，同时还应具备可降解性，其降解率应与组织细胞生长率相适应。另外，降解产物需对细胞无毒害作用，不引起炎症反应。脂肪族聚酯，特别是聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物是研究最多的人工合成的可降解医用材料。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是由两种单体乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，具有优良的生物相容性和生物可降解性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以它应用在医药和生物材料中时不会有毒副作用。
静电纺丝技术是制备纳米纤维的有效方法，其具有设备成本低廉、工艺流程简单、液固相分离时间比常规纺丝方法短等优点。近几年来，采用电纺技术制备组织工程支架引起了人们极大的关注^[3]。电纺纤维结构和形貌的多样化为研制组织工程支架提供了方便。电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维支架在软骨、骨、心脏、血管等组织工程领域的研究已经开展了近10年，其应用可行性已得到充分证实。
Park等^[4]发现电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维的亲水性及化学组成对成纤维细胞的黏附及增殖有显著的影响。Yucel等^[5]制备了为细胞提供活力的神经导管，它由多孔、线性排列的电纺β-羟基丁酸戊酸酯-聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合纤维构成，其纤维的方向能诱导自体神经细胞的迁移及排列，体内和体外实验结果均表明其适用于神经组织工程。Canton等^[6]制备了布洛芬涂层的三维电纺聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维支架，它能有效地促进组织创伤后的修复和再生。Zhang等^[7]和Liao等^[8]分别研制了聚乳酸-羟基乙酸/多壁碳纳米管复合电纺纳米纤维支架和胶原/聚乳酸-羟基乙酸组成的电纺纳米纤维支架，结果表明细胞能迁移到支架内，产生丰富的细胞外基质胶原，电纺纳米纤维支架能保持自身结构稳定性，支撑矿化组织形成，可应用于骨组织工程。Jeong等^[9]在海产胶原和聚乳酸-羟基乙酸混合电纺纳米纤维支架上种植了平滑肌细胞和内皮细胞后，以动脉灌注法塑形，获得组织工程人造血管。
本实验拟在体外诱导猪骨髓间充质干细胞定向分化为胆管内皮细胞，探讨胆管内皮细胞与支架材料的生物相容性，验证聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维作为组织工程支架材料的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：分组对照体外观察实验。
时间及地点：实验于2011年3至11月在东南大学医学院外科实验室、病理实验室及动物中心实验室完成。
材料：
实验动物：贵州小香猪4头，三四个月龄，体质量 15-20 kg，雌雄不限，由东南大学医学院动物中心提供。

骨髓间充质干细胞诱导的胆管内皮细胞与电纺纳米纤维相容性检测所用主要试剂：
试剂	来源
DMEM低糖培养基	美国HYCLONE公司
肝细胞生长因子、干细胞因子、表皮生长因子	美国PEPROTECH公司
鼠抗猪CD29、CD34、CD45一抗	美国VMRD公司
聚乳酸-羟基乙酸共聚物	济南岱罡生物科技有限公司
MTT	北京拜尔迪生物技术公司
DAPI	Roche公司

实验方法：
聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维的制备：称取一定量的聚乳酸-羟基乙酸50/50、75/25、90/10固体颗粒，分别置于具塞的50 mL锥形瓶中，加入适量四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(体积比1∶1)，于室温下搅拌混匀12 h，得到浓度为15%的聚乳酸-羟基乙酸溶液。
将聚乳酸-羟基乙酸溶液吸入到配有12＃不锈钢针头的5 mL玻璃注射器中，针头尖端磨平作为喷针，外径为 1 mm，内径为0.7 mm。调整针尖到接收装置的距离为 20 cm。针尖接高压电源正极，接收装置接高压电源负极，喷射电压设定为15 kV，推进速度设定为0.5 mL/h。聚合物液滴在电场力作用下于针尖口形成泰勒(Taylor)锥，当电场力达到并超过喷射的临界电压时，聚合物液滴将最终克服表面张力而形成喷射细流。细流在喷射过程中，溶剂挥发，纤维固化并最终收集在接收装置上形成纳米纤维膜。收集一定时间后，将纳米纤维膜连同铝箔一起放在70 ℃真空干燥箱中，干燥2 h。静电纺丝装置如图1所示。

聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维的微观形貌分析：将3种不同比例聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维膜表面喷金后，用日本日立公司Hitachi S-3000N扫描电子显微镜观察其微观形貌特征。利用Adobe Photoshop6.0量取照片上所有纤维的直径。采用薄膜纸张测厚仪/无纺布厚度仪测定纳米纤维膜的厚度。
聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维的体外降解实验：将3种比例的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维材料，裁成24孔培养平板孔径大小，并放入孔中，浸泡于pH=7.2的PBS中，放入37 ℃恒温箱内。于实验第4，7，10，14天取样，去离子水冲洗，冷冻干燥后进行质量及液体pH检测。质量损失通过公式L=(mo-mt)/mo×100%来计算，其中mo是降解前质量，mt是降解不同时间后的质量。每次各取3个平行试样。在第14天将3种不同比例聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维膜表面喷金后，用日本日立公司Hitachi S-3000N扫描电子显微镜观察其微观形貌特征。
猪骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定：无菌条件下用16号骨穿针在猪髂前上棘抽取红骨髓，以2×10⁵/cm²的密度接种于35 cm²含体积分数为10%胎牛血清DMEM低糖培养液的玻璃培养瓶，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度条件下培养。48 h首次换液，以后每3 d换液，去除未贴壁细胞。待培养的细胞互相融合到90%生长面积时用消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA)消化，2×10⁴/cm²接种，以1︰2的比例传代培养。
细胞传代扩增纯化3代，以2×10⁴/cm²接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM低糖培养液的培养瓶中，于 37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下培养。每天用倒置相差显微镜观察细胞形态、贴壁及生长情况。同时取培养液行碱性磷酸酶、甲胎蛋白及白蛋白检测。对纯化后的骨髓间充质干细胞进行苏木精-伊红染色，观察细胞形态。
取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，消化后制成细胞悬液，水平离心机短时低速离心(1 000 r/min，5 min)；弃上清用培养液重悬后分为4管，每管0.5 mL，其中1管为空白对照，3管分别加入一抗4 ℃孵育30 min(一抗为鼠抗猪CD29、CD34、CD45)，洗涤细胞2次，加入FITC标记羊抗鼠二抗4 ℃孵育30 min，洗涤细胞3次，分别加入 500 μL PBS洗液重悬，移入流式细胞仪专用测试管，流式细胞仪检测分析细胞表面抗原表达和细胞周期。
诱导猪骨髓间充质干细胞分化为肝干细胞：将第3代骨髓间充质干细胞以3×108 L-1细胞浓度接种于6孔板内，培养液为含体积分数为10%胎牛血清+25 μg/L肝细胞生长因子的DMEM低糖培养液，每两三天换液1次观察细胞生长分化形态。细胞出现圆形或卵圆形改变后，取细胞培养液行碱性磷酸酶、甲胎蛋白及白蛋白检测。
诱导肝干细胞分化为胆管内皮细胞：向上述诱导后的6孔板内加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、1 μg/L两性霉素B、20 μg/L干细胞因子、10 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L表皮生长因子、 1.0×10^-7 mol/L地塞米松磷酸钠及1.5%二甲基亚砜的DMEM低糖培养液，观察细胞生长及分化情况，记录细胞形态，待出现胆管内皮细胞典型形态时行苏木精-伊红染色。
RT-PCR检测：从分化的胆管内皮细胞内提取RNA，分别采用GeneQuantⅡ和水平式琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及完整性。取总量1.0-2.0 μg 纯化后的总RNA加入1 μL Oligo(dT)18(0.5 g/L)，补无RNase水至15 μL，70 ℃变性 5 min，迅速置于冰上至少5 min。于上述15 μL液体中，依次加入5.0 μL MMLV buffer(5×)，1.25 μL dNTPs (10 mmol/L)，0.65 μL RNase抑制剂(40 U/μL)，1.0 μL MMLV (200 U/μL)，补无RNase水至总体积25 μL，42 ℃温育1 h。90 ℃ 5 min灭活残留DEPC，反转录的cDNA测定浓度和纯度，放-60 ℃保存备用。检索GenBank数据库(http//:www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/)，获取CK19全长序列(上游引物：5’-AAG CTA ACC ATG CAG AAC CTC AAC GAC CGC-3’，下游引物：5’-TTA TTG GCA GGT CAG GAG AAG AGC C-3’，409 bp)，采用Primer premier 5.0软件设计特异性扩增部分片段，以β-actin作为内参(上游引物：5’-TCA CCA TGG ATG ATG ATA TCG C-3’，下游引物：5’-CGT GCT CGA TGG GGT ACT TCA-3’，225 bp)。PCR反应体系包括0.5 U Taq酶，2.0 μL PCR Buffer (10×；Mg2+Free)，0.8 μL 25 pmol/L的CK19和β-actin的上下游引物，1.0 μL样品cDNA，1.6 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，1.2 μL MgCl2，加灭菌蒸馏水至20 μL。PCR循环条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
细胞黏附率：将3种不同比例的聚乳酸-羟基乙酸电纺纳米纤维膜制成与24孔板孔径大小相仿的小圆片(直径约10 mm，厚度约1 mm)，置于24孔培养板中加入体积分数为75%乙醇溶液消毒处理30 min，PBS(pH 7.4)充分浸泡，中间换液以保证交换出所有残留乙醇。然后置于紫外灯下照射1 h，自然风干。灭菌后的材料用DMEM低糖培养基(含体积分数为10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)浸泡24 h，移入24孔无菌培养板。分别取200 μL分化的胆管内皮细胞悬液(5.0×10⁷ L^-1)接种于3种聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面(实验孔)及培养平板中(对照孔)，在37 ℃、饱和湿度、体积分数5% CO2培养箱中培养。在培养4 h和24 h后，将试样从培养液中取出，用PBS (pH 7.2)冲洗2次，加入200 μL 0.25%胰蛋白酶消化液消化3-5 min，加入含血清培养基终止消化，充分挤出支架中液体，用血细胞计数板计数，计算细胞黏附率，细胞黏附率=C/C0×100%，其中，C0为接种细胞数，C为附着细胞数。每次均做3个平行实验试样，取其平均值。
MTT法检测细胞增殖能力：胆管内皮细胞接种培养3，7 d取3种不同比例材料的试验孔和对照孔各2孔，每孔分别加入80 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃培养箱中继续培养4 h，加入600 μL二甲基亚砜，振荡器振荡20 min，将其以每孔150 μL转移至96孔培养平板中，微孔酶标仪570 nm下测定每孔吸光度值，取平均值。
DAPI染色：胆管内皮细胞与聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维共培养3 d后，小心弃掉培养液，PBS轻轻洗涤细胞材料复合物，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗3次，加入0.3% Triton 1 mL，PBS冲洗3次，将5 mg/L溶于PBS的DAPI 500 μL覆盖细胞材料复合物表面1 min，PBS冲洗3次，避光，在荧光显微镜下观察照相。
胆管内皮细胞在聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面生长形貌：胆管内皮细胞与聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维共培养3 d后，取出细胞材料复合物，以PBS轻轻洗涤，30 g/L戊二醛溶液固定4 h，体积分数为50%，60%，70%，80%，90%和100%乙腈梯度脱水各10 min，真空干燥，喷金后观察胆管内皮细胞在材料表面的生长形貌。
主要观察指标：①细胞培养液碱性磷酸酶、甲胎蛋白及白蛋白水平。②分化的胆管内皮细胞增殖能力及生长形态。
统计学分析：数据以x±s表示，采用统计软件SPSS 18.0行配对样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胆道手术是外科手术的难点，术中胆管损伤修复、修复后发生再狭窄以及胆道恶性狭窄的治疗一直是腹部外科的难题。胆肠吻合术是胆管良恶性狭窄切除后重建肝外胆道的常用手术，但术后Oddi括约肌功能丧失，引起肠液返流，从而导致远期胆管癌的发生率升高^[12]。组织工程胆管是解决这一难题的理想方法，它改变了以往“以创伤修复创伤”的传统治疗模式，成为临床应用发展的必然趋势^[13]。
如何构建具有仿生天然细胞外基质结构和功能的组织工程支架材料，从而为种子细胞提供良好的生长、增殖和功能表达的环境，一直是组织工程及再生医学研究的热点。静电纺丝技术诞生于20世纪70年代，是一种利用高压强电场制备亚微米及纳米纤维的新型技术。以此技术制备的纳米纤维支架，具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，相对于传统技术制备的支架能够更好地模拟天然细胞外基质的结构特点，为种子细胞的生长提供良好的微环境，因此在组织再生与修复领域具有相当广阔的应用前景。现有的研究结果表明，在静电纺丝过程中，影响纤维性能的主要工艺参数主要有：①聚合物溶液浓度。在静电纺丝中，当聚合物溶液浓度过低时，溶液黏度极低，此时将很难维持喷丝细流的连续性，不能形成稳定的流体，而形成了喷射液滴，因此在收集装置上得到块状体。在较高浓度下，黏度足够大，可阻止细流变形，从而形成均一的纤维，因此聚合物浓度必须超过一定值时，静电纺丝过程才能顺利进行。②纺丝电压。静电纺丝中，电压影响电场中流体的表面电荷密度，从而影响电场及流体所受拉伸作用。随着电纺电压的增大，高分子聚合物溶液射流表面的电荷密度增大，因而使之具有更大的静电斥力；同时加大电压可使射流获得更大的加速度和拉伸力，从而具有更大的拉伸应变速率，有利于制得更细的纤维。③接收距离(喷嘴到接丝装置距离)。接收距离增大，电场强度变小，但是拉伸聚力及拉伸时间却也相应的增加，因此不能确定其对电纺纤维的影响程度。④溶剂的推进速度。溶液的挤出速度受到喷头、注射器与水平面的倾角等多方面的影响。在喷头的孔径等因素固定的前提下，射流平均速度与纺丝液的推进速度呈正比。挤出速度减小，纺丝细流在空气中固化时间加长，被收集装置有效拉伸的倍率加大，从而使纤维直径变细。基于前期实验结果的分析，本实验选取的纺丝溶液的浓度为15%，纺丝电压为15 kV，接收距离为20 cm，推进速度为0.5 mL/h，在此纺丝工艺条件下电纺丝得到连续的纳米纤维，表面光滑，成丝质量好。
人工合成的可降解的医用高分子材料中研究最多、应用最广的就是脂肪族聚酯，特别是乳酸、羟基乙酸及其共聚物。在美国，聚乳酸-羟基乙酸通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。在组织工程应用中，由于聚乳酸和聚羟基乙酸的组成比例不同，共聚物的性能必然不同，包括机械性能和生物学性能。聚乳酸-羟基乙酸的降解机制是水解机制，通过溶蚀，聚乳酸-羟基乙酸由不溶于水的固体变成水溶性物质，整体结构被破坏，体积变小，溶解的小分子参与到体内的三羧酸循环，最终以二氧化碳和有机酸的形式排出体外。降解过程中，相对分子质量会迅速降低，失去原有的力学强度。当相对分子质量小到可溶于水的极限时，整体结构发生变形和失重。本文研究的3种比例聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维材料中，在2周的降解时间内都没有发生明显的变形，可以应用于组织工程胆管的初步研究中，进行与胆管内皮细胞的复合培养，但长期的降解率还需要进一步实验来检测。
骨髓间充质干细胞是目前组织工程中常选用的种子细胞，因为这种细胞取材方便，可通过穿刺获得，创伤小，取材后并发症少，细胞培养增殖快，在体外诱导下可分化为胆管内皮细胞和平滑肌细胞，具有多向分化潜能，此外这种细胞也容易分离和培养。有研究显示，体外培养条件下骨髓间充质干细胞呈指数扩增[14]，可在体外分裂(38±4)次并且保持纺锤形态和分化潜能直至细胞衰竭，细胞进行冷冻复苏后培养传代达15次，细胞的增殖分化能力未受影响。目前，鉴定骨髓间充质干细胞的基本标准包括以下几个方面^[15]：①细胞生物学特性，表现为细胞形态为成纤维或纺锤状，贴壁生长，细胞增殖快。②细胞表面标记的表达，在第1，2代细胞有约95%，98%细胞的表型一致，为CD29、CD44等阳性，CD34、CD45、CD14阴性。③具备多向分化潜能，在体外可经人工诱导进行定向分化。本实验检测了第3代骨髓间充质干细胞的表面标志CD29阳性，而CD34、CD45阴性，与文献报道相似^[16-17]，证明所分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞，而非造血干细胞、成纤维细胞。
骨髓间充质干细胞诱导分化的细胞类型、分化能力及机制目前还处于探索之中。细胞分化是细胞在可逆性的轻度损伤和细胞外因素的诱导下，细胞通过诱导物与诱导细胞表面受体结合而介导细胞分化，其实质是细胞内基因的选择性表达，导致细胞合成新的、特异性的蛋白质，从而在生化、结构及功能上发生变化。据近来对细胞生物学分化的研究，可以认为是多种因素如细胞质和细胞核之间的相互作用、诱导因素和抑制因素的相互制约，及多种细胞信号分子形成的信号网络以及细胞本身所处微环境的位置信息等综合影响，诱导相关发育基因在序列上的改变，促使干细胞向不同组织细胞分化，但目前对于这些因素及其所产生的分子信号以及这些信号是如何传递并引起细胞基因的差异性表达还知之甚少。
不同聚乳酸-羟基乙酸比例的支架材料上的胆管内皮细胞黏附率和增殖率均没有显著差异。在培养24 h后细胞在纳米纤维表面的黏附率均大于70%，在培养第7天与第3天相比，细胞有显著的增殖(P < 0.01)，且与培养板对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。高建军等^[18]将取自大鼠肝脏的肝内胆管上皮细胞分别接种在加有壳聚糖、Ⅰ型胶原、壳聚糖-胶原复合载体及空白的24孔组织培养板上，整个生长过程中壳聚糖-胶原复合载体组细胞生长活力优于其他各组，表明壳聚糖-胶原复合载体对肝内胆管上皮细胞生长有明显促进作用。本实验结果表明胆管内皮细胞在聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面具有良好的贴壁率和增殖率，证实了聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维具有良好的生物相容性。
静电纺丝技术制备的纳米纤维拥有三维立体多孔结构，具有较高的比表面积，在纳米纤维表面培养的细胞可以通过支架材料的孔隙向支架内部生长，获得更大的生长空间，与培养平板相比，应该具有更好的增殖率。本实验中，胆管内皮细胞在聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维上的增殖率与培养板并没有显著差异，荧光染色虽可见细胞在材料表面密度较高，生长旺盛，但电镜照片未见明显的向纳米纤维内部渗入生长的情况，因此，如何进一步改善支架材料，研究并提高支架材料的孔隙率，使细胞能够渗入支架内部生长是今后实验中需要解决的一个难题。
结论：骨髓间充质干细胞在体外能够分化为胆管内皮细胞。静电纺丝方法制备的材料为纳米纤维结构，在2周内没有发生明显的降解，分化后的细胞与电纺纳米纤维生物相容性良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞诱导胆管内皮细胞与电纺纳米纤维的生物相容性

Biocompatibility of porcine bone marrow mesenchymal stem cells-derived bile duct endothelial cells with electrospun nanofibers

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