釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (23): 3716-3722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.019

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响

王爽¹，丰培勋²，陈悦¹，张海娟¹，李沙¹，鲍庆红¹，管丽敏¹

1西安交通大学口腔医院正畸科及口腔医学研究中心，陕西省西安市 710004；
2武警陕西总队医院口腔科，陕西省西安市 710054

出版日期:2015-06-04 发布日期:2015-06-04
通讯作者: 王爽，博士，副主任医师，西安交通大学口腔医学院正畸科及口腔医学研究中心，陕西省西安市 710004
作者简介:王爽，女，1974年生，陕西省西安市人，汉族，2008年西安交通大学毕业，博士，副主任医师，主要从事牙周组织改建、再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81200822)；陕西省自然科学基金(2012JQ4004)；中央高校基本科研业务费专项资金(2012jdhz27)

Effect of enamel matrix derivatives on the differentiation and proliferation of human periodontal ligament stem cells

Wang Shuang¹, Feng Pei-xun², Chen Yue¹, Zhang Hai-juan¹, Li Sha¹, Bao Qing-hong¹, Guan Li-min¹

1Center for Orthodontics and Oral Medicine, Hospital of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China;
2Department of Stomatology, Hospital of Shaanxi Armed Police Corps, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China

Online:2015-06-04 Published:2015-06-04
Contact: Wang Shuang, Center for Orthodontics and Oral Medicine, Hospital of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Wang Shuang, M.D., Associate chief physician, Center for Orthodontics and Oral Medicine, Hospital of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81200822; the Natural Science Foundation of Shaanxi Province, No. 2012JQ4004; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2012jdhz27

摘要/Abstract

摘要：

背景：釉基质衍生物已经在临床上用于治疗严重的牙周炎，发现其可促进牙周组织修复、再生，但其中的机制还未阐明。
目的：探讨釉基质衍生物对牙周膜干细胞分化和增殖的作用。
方法：分离培养人牙周膜干细胞，检测其克隆形成率、表面抗原表达情况，鉴定其多向分化潜能。将不同质量浓度的釉基质衍生物(20，50或100 mg/L)作用于牙周膜干细胞培养2，4周，用Trichrome和Von Kosa’s染色法检测牙周膜干细胞胶原合成及矿化结节形成情况，Real time RT-PCR方法检测成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达，MTT法和生长率法检测牙周膜干细胞的增殖情况。
结果与结论：牙周膜干细胞呈梭形，其克隆形成率较牙周膜细胞高，表面抗原CD105，CD29，CD45，CD44的表达率分别为99.8%，99.7%，1.26%，98.8%，具备多向分化潜能。釉基质衍生物呈现一定的时间剂量效应关系促进牙周膜干细胞胶原合成及矿化结节形成，促进成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达，促进牙周膜干细胞的增殖，可能在牙周组织修复、再生中发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 分化, 牙周膜干细胞, 釉基质衍生物, 增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The enamel matrix derivative has been used in the clinical treatment of severe periodontitis; however, the mechanism(s) by which enamel matrix derivative promotes periodontal regeneration is still obscure.
OBJECTIVE: To explore the effects of enamel matrix derivatives on the differentiation and proliferation of periodontal ligament stem cells.
METHODS: Periodontal ligament stem cells were isolated and identified from human teeth. Cloning forming efficiency, surface antigen expression and pluripotency were detected and identified. Enamel matrix derivatives with different concentrations (20, 50, 100 mg/L) were used to culture periodontal ligament stem cells for 2 and 4 weeks. Collagen synthesis and mineralized nodule formation were detected using Trichrom staining and Von Kosa’s staining, respectively; real-time RT-PCR was employed to detect expressions of collagen type I, osteocalcin, and RUX2; MTT and cell growth rate assay were used to detect the proliferation of periodontal ligament stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Periodontal ligament stem cells were spindle-shaped and showed a higher
colony forming efficiency than periodontal ligament cells. The expressions of surface antigens of periodontal ligament stem cells-CD105, CD29, CD45, CD44 were respectively 99.8%, 99.7%, 1.26%, 98.8%, indicating periodontal ligament stem cells have the multilineage differentiation potential. Enamel matrix derivatives improve the collagen synthesis and mineralization nodule formation of periodontal ligament stem cells in a time-dose dependent manner. They also can improve the expression of osteogensis-related genes collagen type I, osteocalcin, RUX2 and proliferation of periodontal ligament stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Periodontal Ligament, Stem Cells, Dental Enamel Proteins, Cell Proliferation, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

王爽，丰培勋，陈悦，张海娟，李沙，鲍庆红，管丽敏. 釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3716-3722.

Wang Shuang, Feng Pei-xun, Chen Yue, Zhang Hai-juan, Li Sha, Bao Qing-hong, Guan Li-min . Effect of enamel matrix derivatives on the differentiation and proliferation of human periodontal ligament stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3716-3722.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态学及克隆形成率低密度接种细胞后，光镜下观察其呈克隆样生长。培养14 d后， STRO-1+细胞(牙周膜干细胞)的克隆形成率明显高于STRO-1-细胞和牙周膜细胞的克隆形成率(图1)。
2.2 牙周膜干细胞表面抗原表达流式细胞仪检测牙周膜干细胞表面抗原，结果显示CD105，CD29，CD44，CD45的表达率分别为99.8%，99.7%，98.8%，1.26%(图2)，表明其为间充质来源的干细胞。

2.3 牙周膜干细胞多向分化能力牙周膜干细胞成骨向诱导分化后，Von Kosa染色发现出现矿化结节(图3D)；成脂诱导培养后，油红O染色出现脂滴(图3E)；成软骨诱导培养后番红花精O染色呈阳性(图3F)，证明牙周膜干细胞具备多向分化潜能。未经诱导培养的对照组，相应染色后未见明显的细胞定向分化(图3A-C)。

2.4 釉基质衍生物对牙周膜干细胞成骨分化的影响
2.4.1 胶原合成能力以Trichrome染色检测不同质量浓度的釉基质衍生物(0，20，50，100 mg/L)促进牙周膜干细胞的胶原合成能力，结果可见釉基质衍生物可促进牙周膜干细胞胶原的合成，而且这种作用呈现剂量效应关系(图4A)。100 mg/L的剂量促进牙周膜干细胞分化的作用最强，故后续实验都选用这个剂量。随着时间的延长，釉基质衍生物促进牙周膜干细胞胶原合成的作用增加，表明这种作用呈现一定的时间效应关系(图4B-E)。
2.4.2 矿化能力以釉基质衍生物(0，100 mg/L)作用牙周膜干细胞2，4周，可见随着时间的延长，釉基质衍生物促进牙周膜干细胞矿化结节形成的作用增加(图5)。

2.4.3 成骨相关基因表达以釉基质衍生物(0，100 mg/L)分别培养牙周膜干细胞2，4周，用Real time RT-PCR方法检测成骨相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素，Runx2的表达。结果显示随着时间的延长，釉基质衍生物促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化的作用增加(图6)。
2.5 釉基质衍生物对牙周膜干细胞增殖的影响与对照组相比，釉基质衍生物可显著促进牙周膜干细胞的活力，而且随着质量浓度的增加，此促进作用随之增强(图7A)。在此实验基础上，选用100 mg/L的剂量进行细胞生长实验。结果显示随着时间延长，牙周膜干细胞数明显增多(图7B)。

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引言

牙周炎是牙周组织的慢性感染性疾病，是口腔两大疾病之一，也是中国成人牙齿丧失的首位原因。牙周炎会造成牙周组织缺损，乃至牙齿的脱落。多年来，学者和临床医师们一直在寻求能有效促进牙周组织再生的方法，并己开展了牙周骨移植、引导牙周组织再生技术等多方面的研究，取得了一定的进展，但在恢复牙周组织功能上还远未达到预期目标。牙周组织再生是治疗牙周组织缺损最理想的方法，也一直是牙周炎治疗的难点和重点。在牙周组织再生中需要合适的有再生分化能力的细胞以及促进细胞定向分化的细胞因子。
牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是存在于牙周膜内的成体干细胞，具有多向分化潜力及牙周再生能力^[1-2]。在小型猪牙周缺损模型上进行牙周膜干细胞自体移植后发现，其可以促进牙周组织的再生^[3]。在小型猪牙周缺损模型上将异种牙周膜干细胞植入，也可以生成牙周组织^[4]，而且其就位于牙周膜内，是进行牙周再生适宜的种子细胞。在组织再生中，种子细胞是一个重要的因素，但种子细胞需要增殖并分化为特定功能的细胞才能实现组织再生，这个过程往往需要另一个重要因素－细胞因子的刺激和诱导。釉基质衍生物(enamel matrix derivative，EMD)可能在牙周组织再生中起到刺激细胞增殖并定向分化的作用。釉基质衍生物是从发育期牙釉组织中提取的，其主要成分是釉质蛋白，还包括釉基质中的其他成分。有学者在无细胞牙骨质中发现了釉质蛋白^[5]，并认为其可能参与牙周损伤的修复^[6]。将釉基质衍生物放入猴牙周缺损模型中，组织学观察到几乎完全的无细胞牙骨质修复，胶原组织紧密地结合于新生的牙槽骨^[7]。虽然发现了釉基质衍生物有促进牙槽骨修复的作用，但其中的机制还很不清楚，其对牙周膜干细胞的作用也还有待研究。本研究探讨釉基质衍生物对牙周膜干细胞分化、增殖的影响，从而深入认识釉基质衍生物促进牙周再生的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：细胞培养，体外观察实验。
时间及地点：实验于2012年2月至2014年12月在西安交通大学口腔医学研究中心实验室完成。
材料：健康的因正畸原因拔除的前磨牙(n=3)和埋伏的第三恒牙(n=2)来自于西安交通大学口腔医院口腔颌面外科，患者或其家长签署了知情同意书。

釉基质蛋白衍生物促进人牙周膜干细胞分化、增殖实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶	Corning Inc.,Corning,NY,USA
α-MEM培养基	Hyclone Laboratories Inc. Logan, UT, USA
TS100倒置相差显微镜	Nikon Precision Inc.Tokyo.Japan
流式细胞仪	Guava Technologies Inc. Hayward, USA
RCO5000T-5 CO₂培养箱	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
CD34、CD10、CD44、 CD45、STRO-1抗体	BD Bioscience, San Diego. CA, USA
细胞培养皿	Corning Inc.,Corning,NY,USA
实时定量PCR仪	Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA

实验方法：
牙周膜细胞分离培养：在无菌条件下，小心分离离体牙牙根中1/3处牙周膜，用3 g/L的Ⅰ型胶原酶和4 g⁄L的胰蛋白酶于37 ℃消化1 h，接种于10 cm培养皿，加入含体积分数为10%胎牛血清，100 U/mL青霉素G，100 g/mL链霉素的DMEM培养基，在37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中培养。
FACS分选：上述牙周膜细胞培养5-7 d后，用Tryple E 消化细胞，将细胞重悬在blocking buffer中(含HBSS，20 mmol/L HEPES，体积分数为1%人血清，1%牛血清白蛋白，体积分数为5%胎牛血清)，在0 ℃放置20 min，用STRO-1 IgM抗体(2 mg/L)孵育1 h。流式细胞仪分选STRO-1+细胞，即牙周膜干细胞，将细胞传代培养，用第2代或者第3代细胞进行后续实验。
克隆形成率测定：将400个牙周膜细胞(未经分选的细胞)，400个STRO-1+细胞(牙周膜干细胞)和400个STRO-1- 细胞接种于5 cm培养皿中，标准培养液中培养14 d。用体积分数为10%甲醛溶液固定后1% violet blue染色。超过50个细胞聚成的细胞集落算作1个克隆。每个培养皿中的克隆数与植入的细胞数的比率即为克隆形成率。
流式细胞仪表面抗原检测：取第3代牙周膜干细胞用Tryple E 消化后，将细胞重悬在blocking buffer中(含HBSS，20 mmol/L HEPES，体积分数为1%人血清，1%牛血清白蛋白，体积分数为5%胎牛血清)，在0 ℃放置20 min，EP管分装，每管100 μL，加入1 μL CD105，CD44，CD34，CD45抗体孵育1 h，重悬后加入二抗，再次重悬，用流式细胞仪检测。
多向分化能力检测：取第2代牙周膜干细胞以5×107 L-1的细胞浓度加入24孔板，孵育24 h，将培养液更换为成骨诱导液(含10 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L维生素C磷酸酯镁和10 mmol/L β-磷酸甘油钠的DMEM培养液)、成软骨诱导液(含10 μg/L转化生长因子β3的DMEM培养液)、成脂诱导液(含0.5 μmol/L地塞米松，体积分数为5%胎牛血清，0.5 μmol/L异丁基甲基黄嘌呤，50 μmol/L消炎痛的DMEM培养液)，每3 d换液1次。21 d后，成骨诱导组采用von kosa染色观察培养板内矿化结节形成情况，番红O染色观察软骨形成情况，油红O染色观察脂滴形成情况。
成骨分化相关指标检测：取第3代牙周膜干细胞分组培养，对照组用含体积分数为10%胎牛血清，1%抗生素的DMEM培养，实验组在相同的培养液中加入不同质量浓度的釉基质衍生物(20，50或100 mg/L)，放入37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中培养2，4周进行以下检测。
Trichrome染色检测胶原合成情况：按照试剂说明书进行，简述如下：细胞用体积分数为10%甲醛溶液固定后，加入Bouin's溶液56 ℃ 1 h，放入魏格特铁苏木精染液 10 min，清洗后，放入比布列西酸性品红液 10-15 min，再放入苯胺蓝溶液10 min，清洗后放入1%乙酸 5 min，脱水后镜下观察。
Von Kosa’s染色法检测矿化结节形成情况：用Von Kosa’s染色法将矿化结节染成黑色。将固定后的细胞爬片PBS洗涤后，浸入5%硝酸银水溶液中10 min，日光下放置曝晒30 min，蒸馏水洗涤，乙醇系列脱水，二甲苯透明，镜下观察。
RT-PCR检测成骨相关基因表达：培养2，4周时，收集细胞，TRIzol法抽提总RNA，反转录生成cDNA，以此为模板，用目标基因的引物进行Real time RT-PCR，检测目标基因的表达。GAPDH为内参。引物序列：Runx2，正义：5’-CCC GTG GCC TTC AAG GT-3’，反义：5’-CGT TAC CCG CCA TGA CAG TA-3’；Ⅰ型胶原，正义：5’-CCA GAA GAA CTG GTA CAT CAG CAA-3’，反义：5’-CGC CAT ACT CGA ACT GGA ATC-3’；骨钙素，正义：5-AGC AAA GGT GCA GCC TTT GT-3’，反义：5’-GCG CCT GGG TCT CTT CAC T-3’。
细胞增殖能力检测：
MTT法检测细胞增殖情况：第3代牙周膜干细胞以每孔4×10⁴个的浓度种入96孔板，加入不同浓度的釉基质衍生物(0，20，50，100 mg/L)孵育48 h后，用含5 g/L MTT的PBS换去培养液，在37 ℃，体积分数为5% CO2中孵育48 h，于570 nm波长处读取吸光度值。
细胞生长率：第3代牙周膜干细胞以每孔5 000个的密度种在12孔培养板上培养24 h后，在无血清DMEM中再培养24 h。然后在含有100 mg/L釉基质衍生物的培养基中再培养2 d和4 d，消化细胞后计数。
主要观察指标：①牙周膜细胞，STRO-1+，STRO-1-细胞克隆形成率。②牙周膜干细胞表面抗原表达以及多向分化能力鉴定。③釉基质衍生物干预后牙周膜干细胞胶原合成、矿化结节形成情况以及成骨相关基因表达。④釉基质衍生物干预后牙周膜干细胞的增殖情况。
统计学分析：数据以平均值±标准误(S.E.)表示，ANOVA分析所有实验数据，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前针对牙周炎的治疗主要是控制局部的炎症以及促进组织的修复^[8]。对于已经发生的牙槽骨缺损，牙槽骨再生是最理想的治疗方法，但也一直是牙周炎治疗的难点和重点。另外，牙槽骨缺损、牙槽骨吸收造成的骨量不足也是种植牙治疗中面临的一个主要问题，由于骨量不足使得种植体不能获得很好的固位，可能使患者需要选择移植自体骨或者骨粉等人造材料来增加骨量，而有些患者最终还是不得不放弃种植修复。如果能有效提升牙槽骨再生的水平，将为这些患者解决骨量不足的问题，使他们获得满意的种植修复效果。
牙周骨移植、引导组织再生术目前常用于牙周病治疗和牙周缺损修复，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上效果还很不理想。组织工程技术在重建缺失组织，产生新生组织方面具有优势，使其成为实现牙周组织再生研究中的热点。Seo等^[1]于2004年首次从人磨牙中分离出了牙周膜干细胞，具有多向分化潜力以及牙周再生能力，其子代能增殖产生成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞^[9]，可分化形成牙周膜、牙槽骨、外周神经和血管^[10-11]，参与牙周组织的修复和再生^[12]。
牙周膜干细胞与特定生物材料植入体内可形成牙周膜牙骨质复合样结构^[13]。Kato等^[14]比较了骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙周膜干细胞的骨分化能力，发现牙周膜干细胞是最理想的牙槽骨再生的种子细胞。骨组织再生需要细胞有较强的矿化能力，还应具备较强的胶原合成能力。也有研究表明牙周膜干细胞胶原形成能力比脂肪间充质干细胞强^[15]。
本研究对人牙周膜干细胞进行了分离培养，其在形态学上呈梭形，与其他间充质干细胞相似。克隆形成能力是干细胞的主要特点之一，与牙周膜细胞相比，牙周膜干细胞具有更强的克隆形成能力。目前还未发现牙周膜干细胞特异的表面标记物。本研究结果显示分离出的牙周膜干细胞表达间充质干细胞抗原表型CD29、CD44、CD105、STRO-1，不表达造血系标记物CD45。而且在特定的条件诱导液中培养，该细胞也表现出了三向分化(成脂、成骨、成软骨)能力。这些结果与其他一些学者的研究结果一致^[9，16]，证明了牙周膜干细胞的干细胞特性。
对于牙槽骨的再生，创造一个近似天然的能够控制相关细胞增殖、分化的微环境是至关重要的。不同的微环境包含不同的生长因子，影响细胞的生理功能。学者们已经发现了多种细胞因子能够影响牙周膜干细胞的增殖和分化^[17-25]。
釉基质衍生物是从发育期牙釉组织中提取的，其主要成分是釉质蛋白。由于人的牙胚不易得，而釉质蛋白在物种间又有高度的同源保守性，因此釉基质衍生物主要采用酸提取法从猪或牛的牙胚组织中提取。瑞典BIORA公司已商品化产品Emdogain，是在上述基础上，猪釉基质衍生物经高效液相色谱法纯化，取典型的3个分子质量峰值蛋白冻干保存，并经脂质载体处理而成，本研究中应用的即是此产品。Fihppi等^[26]证实Emdogain有促进牙周膜再生作用。
胶原的产生和矿化结节的形成是成骨的重要步骤。本研究用染色的方法证明了釉基质衍生物可以促进牙周膜干细胞的胶原合成与矿化过程，进一步从RNA水平证实了釉基质衍生物可以促进牙周膜干细胞成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达。研究还发现釉基质衍生物可以促进牙周膜干细胞的增殖。将本研究的这些发现与以往一些学者的发现相比较，可以发现有相似之处，也存在不同之处。比如，Rincon等^[27]发现牙周膜细胞在釉基质衍生物作用下，似有向成牙骨质细胞分化的倾向。Keila等^[28]检测了釉基质衍生物对牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞中骨桥蛋白含量，发现釉基质衍生物可促进这两种细胞向成骨细胞分化。国内钟永荣等^[29]的研究发现釉基质衍生物对牙周膜细胞的骨钙蛋白表达无明显影响。曲哲等^[30]发现釉基质蛋白具有促进牙周膜细胞增殖、分化与迁移的能力。张凤秋等^[31]研究表明釉基质蛋白能促进牙周膜细胞增殖、蛋白合成及矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。以上这些研究的观察对象都是牙周膜细胞。牙周膜细胞包含了多种细胞群，其中以牙周膜成纤维细胞为主，也包括牙周膜干细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞。而本实验以细胞表面抗原为STRO-1+的牙周膜干细胞为研究对象，结果表明釉基质衍生物促进牙周膜干细胞胶原合成及矿化结节形成，促进成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、骨钙素、RUX2的表达，促进牙周膜干细胞的增殖，可能在促进牙槽骨修复、再生中发挥作用。
釉基质衍生物含有多种蛋白，其中哪一个蛋白或者哪个蛋白的哪个肽段起主要作用是值得进一步探讨的问题。已有学者进行了这方面的研究，Katayama等^[32]发现釉基质衍生物的一个合成寡核苷酸肽段可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。课题组下一步将继续寻找釉基质衍生物的有效蛋白及肽段，并进一步研究其促进牙周膜干细胞分化的机制，以期进行更有效的牙槽骨再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

釉基质蛋白衍生物对人牙周膜干细胞分化、增殖的影响

Effect of enamel matrix derivatives on the differentiation and proliferation of human periodontal ligament stem cells

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