经气管移植骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的归巢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (23): 3711-3715.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.018

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经气管移植骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的归巢

黄明¹，周永梅¹，李斌¹，吴奇峰¹，朱玉峰²，梁伟辉¹

1广东省职业病防治院，广东省广州市 510300；
2南方医科大学南方医院实验动物研究中心，广东省广州市 510515

出版日期:2015-06-04 发布日期:2015-06-04
作者简介:黄明，女，1980年生，湖南省平江县人，汉族，2010年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事职业病防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81302396)；国家十二五科技支撑计划分课题(2014BAI12B01)；广东省职业病防治重点实验室(2012A 061400007)

The homing of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via the trachea into rats exposed to silica dust

Huang Ming¹, Zhou Yong-mei², Li Bin¹, Wu Qi-feng¹, Zhu Yu-feng², Liang Wei-hui1

1Guangdong Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangzhou 510300, Guangdong Province, China;
2Center for Experimental Animals, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Online:2015-06-04 Published:2015-06-04
About author:Huang Ming, M.D., Associate chief physician, Guangdong Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangzhou 510300, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81302396; the National Science and Technology Support Plan during the 12th Five-Year Period, No. 2014BAI12B01; Guangdong Key Laboratory for Occupational Disease Prevention, No. 2012A061400007

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞经气管途径注入大鼠体内能减轻染矽尘大鼠的肺部损伤，但其在大鼠体内的分布、迁移情况尚不清楚。
目的：观察经气管途径移植的骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的分布和归巢情况。
方法：用携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒(Lv-eGFP)转染SD大鼠骨髓间充质干细胞，锥虫蓝染色和CCK-8法检测转染前后细胞的活力及增殖情况。将SPF级SD大鼠随机分为染矽尘组和对照组，染矽尘组大鼠经气管内注入40 g/L无菌矽尘混悬液1 mL，对照组大鼠注入生理盐水1 mL。造模后第2天每只大鼠经气管注入2.5×106个Lv-eGFP转染的骨髓间充质干细胞，分别于移植后的1，2，3，4周处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑组织冰冻切片，荧光显微镜观察各组织荧光表达，图文分析软件计算组织荧光强度。
结果与结论：感染复数为50时，转染与未转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞在活细胞率及增殖力上差异无显著性意义(P > 0.05)。注入细胞后两组肺组织切片均可见广泛、强烈的绿色荧光，以支气管、血管周围明显，各时间点染矽尘组的荧光强度均高于对照组(P < 0.05)，到第4周荧光仍较强。两组其余各脏器在第1周均可见荧光，肝、脾、心脏荧光强、分布广，肾、脑组织荧光相对较弱、分布较少；随时间推移，荧光均逐渐减弱，分布逐渐减少。结果提示骨髓间充质干细胞经气管途径进入染矽尘大鼠体内后可归巢至受损肺部。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 绿色荧光蛋白, 二氧化硅, 移植, 气管途径, 归巢, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells transplantation via the trachea can relieve the lung injury of rats exposed to silica dust, but their distribution and migration in vivo is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the distribution and homing of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via the trachea into rats exposed to silica dust.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were isolated through bone marrow adherent method and transfected with lentivirus carrying enhanced green fluorescent protein gene (Lv-eGFP). Trypan blue staining and cell counting kit-8 were applied to assay the viability and proliferation of the transfected and untransfected cells. Sprague-Dawley rats, SPF level, were randomized into control group and silica dust exposure group. Rats in the two groups were respectively injected via the trachea with 1 mL of sterile
silica dust suspensions (40 g/L) and 1 mL of normal saline. At 2 days after modeling, 2.2×106 transfected bone marrow mesenchymal stem cells were injected via the trachea into the rats of control group and silica dust exposure group. Rats were killed at weeks 1, 2, 3, 4 after transplantation, and the distribution and intensity of green fluorescence in the lung, heart, liver, spleen, kidney, and brain tissue were observed under the fluorescence microscopy by frozen sections and analyzed using imaging analysis software.
RESULTS AND CONCLUSION: When the multiplicity of infection was 50, there were no significant differences between the viability and proliferation activity of the transfected and untransfected cells (P > 0.05). After transplantation of transfected bone marrow mesenchymal stem cells, strong green fluorescence was observed widely in the lung, especially around the bronchus and blood vessels, and still obvious at the 4th week. The fluorescence of other organs also could be observed at the 1st week. It was strong and wide in the liver, spleen and heart, while faint and less in the kidney and brain, and all reduced with time. It shows bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via the trachea into rats exposed to silica dust can be homing to the injured lung of rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Lung, Drug Administration Routes

中图分类号:

R394.2

黄明，周永梅，李斌，吴奇峰，朱玉峰，梁伟辉. 经气管移植骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的归巢[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3711-3715.

Huang Ming, Zhou Yong-mei, Li Bin, Wu Qi-feng, Zhu Yu-feng, Liang Wei-hui. The homing of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via the trachea into rats exposed to silica dust [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3711-3715.

图/表（结果） 4

2.1 Lv-eGFP转染骨髓间充质干细胞按照前期所用全骨髓贴壁培养法从供体大鼠分离、培养骨髓间充质干细胞^[11-12]。转染骨髓间充质干细胞48 h，荧光显微镜下可见到绿色荧光，72-96 h达高峰，此后趋于稳定。感染复数为1-50时，随着感染复数提高，转染率增加，荧光强度增强。感染复数为50时，转染率约80%，且细胞生长状态良好，见图1。感染复数为100时，细胞可见萎缩和凋亡。故实验取感染复数为50的Lv-eGFP转染骨髓间充质干细胞。

2.2 转染与未转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞活力比较 Lv-eGFP转染骨髓间充质干细胞第7天细胞存活率为(97.67±0.60)%，未转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞存活率为(98.03±0.56)%，差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 转染与未转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞增殖能力比较转染与未转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞生长趋势基本一致，第1，2天是细胞生长潜伏期，第3-5天为对数生长期，之后为生长平台期。经统计学分析，两组骨髓间充质干细胞的吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 实验动物数量分析两组受体大鼠各4只，均进入结果分析(每只大鼠各组织均取不同位置冰冻切片、采集不同视野图像)，无脱落。
2.5 大鼠各脏器组织荧光表达植入细胞后第1周，对照组和染矽尘组大鼠肺组织均见分布广泛的较强绿色荧光表达，尤以气管、血管周围荧光强烈；染矽尘组较对照组荧光更强，且持续到第4周仍较明显，对照组荧光随时间延长而减弱，到后期减弱更明显。两组大鼠其余组织在植入细胞后第1周荧光也较明显，尤以肝、脾和心脏组织荧光强烈、分布广泛，脑和肾脏组织分布相对较少；染矽尘组各组织随时间延长荧光强度迅速减弱，分布范围减少，到第4周，仅肝和脾脏组织中可见到较弱、散在的黄绿色荧光；对照组的各组织随时间延长荧光强度也减弱，但除脑组织外减弱幅度较染矽尘组小，见图2。

2.6 大鼠各脏器组织荧光强度比较两组大鼠肺组织荧光吸光度值比较，在组别和植入时间的交互作用上差异有显著性意义(P < 0.01)。单独效应分析结果显示：4个时间点染矽尘组肺组织吸光度值均显著高于同时间点对照组 (P < 0.05)。两组肺组织吸光度值均较同组前1周明显减低(P < 0.05)，但对照组减低幅度远较染矽尘组大。
两组大鼠脾、心、肾和脑组织在染尘处理、观察时间的交互效应上差异也有显著性意义(P < 0.05)。除对照组大鼠肝脏组织第1周和第2周吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余大鼠各组织吸光度值与前1周比较差异有显著性意义(P < 0.05)。染矽尘组大鼠的肝、心及肾组织每周吸光度值，脾组织第3，4周吸光度值，脑组织第1，2，3周吸光度值均低于对照组(P < 0.05)；脾组织第1，2周吸光度值均高于对照组(P < 0.05)；两组脑组织第4周吸光度值比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2014年10月至2015年1月在南方医科大学南方医院动物实验中心完成。
材料：
实验动物：健康SPF级SD大鼠，购自南方医科大学动物实验中心，供体大鼠3只，4-6周龄，雄性，体质量120- 150 g；受体大鼠8只，7-8周龄，雄性，体质量180-220 g。
主要试剂：二氧化硅粉尘购自Sigma公司，DMEM-LG培养基、胰酶、特级胎牛血清均购自Gibco公司，Lv-eGFP试剂盒购自Cyagen公司，CCK-8试剂盒购自同仁化学试剂研究所，Jung冰冻包埋剂购自Leica公司。
实验方法：
骨髓间充质干细胞分离培养：按照课题组前期使用的全骨髓贴壁法取供体大鼠进行骨髓间充质干细胞分离培养、传代和鉴定^[11]。
Lv-eGFP转染：用Lv-eGFP转染第3代骨髓间充质干细胞。每孔接种5×10⁴个细胞于24孔板，待细胞融合至40%-60%时弃去培养液，按Lv-eGFP试剂盒说明书操作，采用感染复数(Multiplicity of infection，MOI，感染细胞时病毒颗粒数与细胞数量的比值)为1，5，10，20，50和100的Lv-eGFP转染骨髓间充质干细胞。20 h后PBS洗涤细胞，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM-LG培养基继续培养48 h，荧光显微镜下观察荧光的表达情况。
骨髓间充质干细胞活力、增殖能力检测：
活力检测：消化未转染与转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，与0.4%锥虫蓝溶液按9∶1体积比例混匀，3 min内计数。死细胞被染成明显蓝色，活细胞为无色透明状，按照活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%来计算细胞存活率(%)，重复3次计算均值。
增殖能力检测：取未转染与转染Lv-eGFP的骨髓间充质干细胞，在细胞生长融合达80%-90%时调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，各接种5孔于96孔板中，共7块，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度条件下培养。每天于相同时间加入10 μL CCK-8试剂与细胞孵育4 h，酶标仪检测490 nm波长吸光度(A)值，连续检测7 d，绘制细胞生长曲线。
动物分组及处理：受体大鼠随机分为对照组和染矽尘组，每组4只。采用文献[11]的实验方法，染矽尘组大鼠经气管内注入40 g/L无菌矽尘混悬液1 mL，对照组大鼠注入生理盐水1 mL。
骨髓间充质干细胞移植：造模后第2天每只大鼠经颈部正中皮肤小切口，用1 mL注射器从气管环状软骨间隙向气管内注入细胞浓度为5×10⁹ L^-1 Lv-eGFP转染的骨髓间充质干细胞0.5 mL。
各脏器组织荧光观察：各组大鼠分别在植入Lv-eGFP转染的骨髓间充质干细胞第1，2，3，4周，统一放血处死大鼠，取肺、肝、脾、心、肾和脑组织经冰冻包埋剂包埋，保存于液氮管中，恒温箱冷冻机对各组织多个部位进行快速冰冻切片，荧光显微镜下观察荧光强度及分布。
主要观察指标：各组织随机选取5个不同部位的视野采集图像，用Image-pro plus 6.0图文分析软件检测各组织绿色荧光的吸光度(A)值。
统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计分析，两组组间均数比较采用独立样本t 检验；析因设计资料采用析因设计方差分析，检验水准α=0.05。

讨论

在肺部疾病治疗中，除常见的口服、静脉给药途径外，经气管途径也是一种重要方法。不同给药途径各有利弊，口服给药最方便，通常也最安全，但口服药物吸收始于口腔和胃，大部分由小肠吸收，药物通过小肠壁及肝脏方能进入全身血循环。此外，部分口服药物对胃肠道有刺激作用，甚至可损害胃肠黏膜并诱发溃疡。静脉给药是将药液直接送入血液，药物不必经过胃肠道吸收和肝脏阶段，直接进入体循环，这种给药方式可获得较口服更快和更持久的效应，且剂量准确，但静脉注射液要求澄明，无浑浊、沉淀，无异物及致热原，但混悬溶液、油性溶液、不能与血液混合的其他溶液，以及能引起溶血或凝血的物质，均不可采用该途径。经气道给药是将药物通过肺上皮细胞或呼吸道黏膜吸收进入血液循环，起效速度快，与静脉给药相当；可避免首过消除，生物利用度完全，尤其适合肺部疾病；且由于是局部给药，故毒副作用一般较全身用药小。由于药物可在血浆和组织中迅速达到高浓度，给药速度及剂量必须严格控制，部分药物也会对肺上皮产生刺激。骨髓间充质干细胞为活细胞类生物制剂，胃肠道环境会影响其生存，不适合通过消化道途径进入体内。目前其在机体内的研究，绝大部分通过静脉途径，暂未发现通过气管途径的报道。
荧光蛋白标记技术是利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞，通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞。慢病毒载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而稳定持久表达。慢病毒载体还具有宿主细胞免疫反应小、细胞毒性小等优点^[13]。绿色荧光蛋白最初从水母中提取，无种属特异性，其表达不影响细胞的生长和功能，不需要反应底物，可通过荧光显微镜在蓝色或紫外光激发下即产生绿色或黄绿色荧光而被直接观察到，因此常用于活体细胞的实时检测。目前常用的是其人工突变体增强型绿色荧光蛋白，它能使荧光强度增加35倍，大幅提高检测的灵敏度。研究表明慢病毒转导增强型绿色荧光蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性无明显影响^[14]。本研究也显示Lv-eGFP对大鼠骨髓间充质干细胞的生长状态、增殖力均无影响，且在被转染的骨髓间充质干细胞中表达稳定、持久，证明是一种良好的示踪方法。
研究结果还显示，骨髓间充质干细胞进入大鼠体内后，除直接到达肺部外，在肝、脾、心、肾、脑组织中也有分布，提示经气管注入后骨髓间充质干细胞可经肺泡毛细血管进入血液循环，再到达其他组织。早期染矽尘组肺、脾组织荧光强度明显高于对照组，而在其他组织，除肾组织荧光强度无差异外，染矽尘组荧光强度均低于对照组。在经气管注入大鼠体内的骨髓间充质干细胞数量大致相同情况下，骨髓间充质干细胞在肺部受损伤时可较多聚集到肺部发挥作用而导致在其他组织相对减少。骨髓间充质干细胞有免疫调节功能[15-16]，脾脏作为最大免疫器官，骨髓间充质干细胞在此增多推测可能与矽尘刺激机体发生免疫反应，致脾产生淋巴细胞等免疫细胞增多，而骨髓间充质干细胞到达局部发挥作用有关。随着时间延长，不论染矽尘组还是对照组大鼠，各组织的绿色荧光也呈减弱、减少趋势，这可能与骨髓间充质干细胞自然凋亡有关，但染矽尘组肺部绿色荧光持续到后期仍较强，而对照组荧光到第4周已较弱，且染矽尘组其他组织的荧光强度减弱较对照组明显，提示骨髓间充质干细胞即使早期分布到其他组织后仍可逐渐向受损肺部迁移，定植到肺部。
总之，研究结果表明经气管途径进入机体内的骨髓间充质干细胞可在较长时间内聚集、定植在矽尘损伤的肺部，这为临床经气管途径移植骨髓间充质干细胞治疗尘肺提供了的实验依据，但其进入体内后归巢到肺部的机制及如何进一步发挥损伤修复作用尚需进行深入研究。

杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

经气管移植骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的归巢

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