骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨形态发生蛋白7具有促进骨髓间充质干细胞分裂增殖的作用，在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。
目的：观察携带人骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7蛋白及mRNA的表达。
方法：提取并培养大鼠骨髓间充质干细胞，通过形态学和细胞表面标记进行鉴定；构建携带人骨形态发生蛋白7的慢病毒载体，转染大鼠骨髓间充质干细胞，提取RNA后采用RT-PCR的方法检测骨形态发生蛋白7 mRNA水平相对表达量的变化，Western blotting检测骨形态发生蛋白7蛋白水平相对表达量的变化。
结果与结论：成功构建了携带骨形态发生蛋白7基因的慢病毒载体PLV-sfGFP(2A)-BMP7，重组载体质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中，转染组的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白表达高于空载体组和空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明外源性骨形态发生蛋白7基因被有效整合到骨髓间充质干细胞并进行表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨形态发生蛋白7, 骨髓间充质干细胞, 慢病毒载体, 转染, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein-7 can promote proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and has important significance in terms of inducing new bone formation.
OBJECTIVE: To observe the protein and mRNA expression of bone morphogenetic protein-7 in bone marrow mesenchymal stem cells transfected with bone morphogenetic protein-7.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured, and then identified by the morphology and cell surface markers. Lentiviral vectors carrying bone morphogenetic protein-7 were constructed to transfect bone marrow mesenchymal stem cells. After total RNA extraction, the protein and mRNA expression of bone morphogenetic protein-7 was detected by RT-PCR and western blot methods.
RESULTS AND CONCLUSION: PLV-sfGFP(2A)-BMP7 recombinant plasmids were successfully constructed and transferred into rat bone marrow mesenchymal stem cells. The mRNA and protein expression of bone morphogenetic protein-7 in the transfection group was significantly higher than that in the blank vector and blank groups (P < 0.05), indicating exogenous bone morphogenetic protein-7 gene is effectively integrated into the bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Bone Morphogenetic Protein 7, Lentivirus Infections

中图分类号:

R394.2

王平，顾煜琛，高志惠，孙铁锋，杨武斌. 骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞再生骨组织[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3609-3615.

Wang Ping, Gu Yu-cen, Gao Zhi-hui, Sun Tie-feng, Yang Wu-bin. Bone tissue regeneration of bone morphogenetic protein-7-transfected bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3609-3615.

图/表（结果） 7

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态倒置相差显微镜观察，细胞接种后可见大量红细胞，并可观察到原代培养细胞呈单个或多个细胞聚集(图1A)。第5天换液时，细胞呈多角形、长梭形，类似成纤维细胞，原来的单个细胞或细胞集落形成多个细胞克隆，出现团、簇状细胞群(图1B)。

2.2 人骨形态发生蛋白7目的基因的获取及骨架载体的酶切用限制性内切酶SmaⅠ和BamHⅠ对PLV-VEGFA- BMP7载体进行双酶切，酶切条带理论大小为1 200 bp，目的条带出现，条带清晰，与1 kb DNA Maker比较，酶切片段与理论值长度一致，提示成功获取目的基因，双酶切结果见图2。骨架载体PLV-sfGFP(2A)-puro的理论大小为9 038 bp，双酶切结果见图3。

2.3 重组载体的验证对挑取的8个单克隆菌，进行质粒提取，用限制性内切酶SmaⅠ和BamHⅠ对质粒载体进行双酶切，结果1通道为阳性克隆，其余均为假阳性，酶切条带理论大小为1 200 bp，目的条带出现，条带清晰，双酶切结果见图4。对该阳性质粒载体送公司测序，结果见图5。

2.4 RT-PCR检测转染细胞人骨形态发生蛋白7的表达各组转染48 h，提取各组细胞的总RNA，对照组和空载组没观察到相应大小的特异性条带，说明没有骨形态发生蛋白7基因的mRNA表达，转染组RT-PCR可检测到有大小约334 bp的阳性条带，说明携带人骨形态发生蛋白7目的基因转染后人骨形态发生蛋白7 mRNA水平有高表达，表明PLV-sfGFP(2A)-BMP7可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞，见图6。

2.5 Western-blot检测转染后细胞骨形态发生蛋白7蛋白的表达 Western blot法检测3组细胞中骨形态发生蛋白7的表达情况，3组均可见大小约为 Mr 55 000的单一蛋白免疫反应条带，与文献报道的骨形态发生蛋白7蛋白分子大小一致，见图7。以 Mr 43 000大小β-actin为内参照，行灰度分析并统计学分析得出：3组骨形态发生蛋白7相对于 β-actin的表达量，转染组(1.109±0.013)高于空载体组(0.063±0.004)和空白组(0.059±0.008)，差异均有显著性意义(P < 0.05)，空载体组与空白组相比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果说明含人骨形态发生蛋白7目的基因病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白7蛋白水平有高表达。

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引言

材料方法

设计：组织工程体外实验。
时间及地点：实验于2014年3月至2015年2月在山东大学国家糖工程技术中心完成。
材料：
实验动物：5周龄SD大鼠5只，雌雄不限，体质量140-160 g，购自山东大学实验动物中心，动物质量合格证号：鲁动质SCXK(鲁)20090001号。
配制试剂：
0.1%Ⅱ型胶原酶：取100 mg的Ⅱ型胶原酶于100 mL无菌玻璃瓶，加入20 mL D-Hank’s平衡盐溶液溶解，即得5 g/L的Ⅱ型胶原酶储备液。过滤除菌，分装于4支5 mL的小青瓶，-20 ℃冻存。用时，取1 mL储备液加4 mL D-Hank’s平衡盐溶液，即得0.1%Ⅱ型胶原酶。
细胞培养液(含体积分数为20%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 mg/L)：瓶子洗净，泡酸过夜，高压灭菌。室温下于超净工作台内向400 mL DMEM培养液中加入胎牛血清100 mL；再向上述培养液中加入青链霉素混合液4 mL；混匀后置于4 ℃冰箱中保存备用。
茜素红染液(0.1%的茜素红Tris-HCl，pH 8.3)：取100 mL 玻璃瓶，0.788 g Tris-HCL加入瓶中，再加PBS 100 mL配成Tris-HCl缓冲液100 mL(0.05 mol/L)；用0.1 mol/L的HCl和0.1%的NaOH在pH酸度计下调节pH值为8.3；用电子天平称取茜素红粉剂0.1 g，加入瓶内，摇匀，便得到0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)溶液，过滤后备用。

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞实验所用主要试剂：
试剂	来源
0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、PBS、茜素红指示剂、Tris-HCl、大鼠骨髓间充质干细胞分离液	Solarbio公司
吉姆萨染色液	北京鼎国昌盛生物技术有限公司
碱性磷酸酶测试盒(酶标仪法)、CAKP 染液(钙钴法)、总蛋白定量测试盒(带标准：BCA法)(48T)	南京建成生物工程研究所
Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)	武汉博士德公司
DMEM低糖细胞培养液	Hyclone公司
标准胎牛血清	TBD 公司
胶原酶Ⅱ	Notlas公司
荧光标记小鼠抗大鼠抗体CD45-FITC、CD90-FITC	北京碧橙蓝生物科技公司
PLV-sfGFP(2A)-puro慢病毒基因过表达载体、慢病毒包装体系	北京英茂盛业生物科技有限公司
PLV-VEGFA-BMP7载体质粒	山东大学药学院师教授赠予
PCR引物	英潍捷基贸易有限公司
T₄ DNA Ligase	Promega
一抗：BMP-7多克隆抗体	Santa Cruz公司
SmaⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、Taq^TM	TAKARA公司
二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记鼠抗羊IgG	北京中杉金桥生物技术有限公司

骨形态发生蛋白7转染骨髓间充质干细胞实验所用主要仪器、设备：
仪器、设备	来源
超净工作台ZHJH-1209	台湾斯特仪器设备有限公司
酶标仪 MK3、微型高速冷冻离心机	Thermo，美国
离心机 Centrifuge5810R	Eppendorf，德国
超低温冰箱	SANYO，日本
1×71倒置相差显微镜(含摄像功能)	Olympus，日本
培养箱	Galaxy，德国
凝胶成像系统	Alpha Innotech

实验方法：
实验分组及处理：
实验分组：①正常对照组(正常培养基+正常骨髓间充质干细胞)。②阴性空载组(正常培养基+转染空载体的骨髓间充质干细胞)。③转染组(正常培养基+转染骨形态发生蛋白7基因的骨髓间充质干细胞)。
各组细胞用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM-LG培养液换液培养。除骨形态发生蛋白7蛋白水平测定外，其余检测指标均重复6孔。在不同培养容器中接种细胞后，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂恒温培养箱预培养24 h。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定^[6-9]：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养：取5周龄的大鼠引颈处死，无菌条件下用DMEM-LG培养液将骨髓从骨髓腔冲出，消化后过100目细胞筛，1 000 r/min离心5 min，取下层。用DMEM-LG清洗后置于25 cm2塑料培养瓶中，于37 ℃，体积分数为5%CO2恒温培养箱中培养。每3 d换液1次，贴壁筛选法培养至第1代，待培养瓶内细胞铺满后一部分冻存备用，另外一部分继续传代培养，传至第3代进行鉴定。
Giemsa染色：将纯化后的细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于12孔板(包被)，培养2 d后取出，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa染液染15 min，双蒸水冲洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。
大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：选取状态较稳定的第3代骨髓间充质干细胞，用PBS洗涤3次，0.25%胰酶消化收获单细胞悬液，移入离心管，1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，与饱和浓度的FITC荧光标记的抗大鼠CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光孵育30 min，PBS洗涤细胞除去未标记的抗体，20 g/L多聚甲醛固定，行流式细胞仪检测CD45和CD90的表达。
骨形态发生蛋白7基因慢病毒载体的构建与鉴定^[10-15]：
骨形态发生蛋白7基因片段的获取：从含有骨形态发生蛋白7目的基因的PLV-VEGFA-BMP7质粒中，利用酶切方法钓取目的基因，在此质粒中骨形态发生蛋白7基因的克隆位点是SmaⅠ和BamHⅠ。反应温度为30 ℃，采用10× loading buffer终止反应，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，DNA琼脂糖凝胶电泳回收参照QIAquick的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，-20 ℃冰箱保存。

双酶切反应体系：
SmaⅠ	1 μL
BamHⅠ	1 μL
10×T Buffer	1 μL
0.1% BSA	2 μL
PLV-VEGFA-BMP7质粒	1 μg
灭菌水	up to 20 μL

慢病毒基因过表达载体的酶切及骨形态发生蛋白7基因片断的整合：①PLV-sfGF(2A)-puro慢病毒基因过表达载体的双酶切：将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行连接，反应温度为30 ℃。采用10×loading buffer终止反应，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收。②载体连接：双酶切后的载体和目的片段按1︰3的浓度在4 ℃过夜。③转化感受态：无菌条件下取100 μL DH5α感受态细胞置于冰上融化，轻轻混匀；向100 μL DH5α感受态中加入10 μL连接反应液，轻轻混匀，冰浴30 min；42 ℃热激90 s，迅速置于冰上2 min；加600 μL LB培养基(不含抗生素)；37 ℃，200 r/min摇床培养45 min；取300 μL转化菌液在LB固体培养基上涂板，加氨苄筛选，37 ℃培养过夜；挑8个单菌落，摇菌过夜，按天跟质粒小提试剂盒提取质粒，备用。④构建成功后阳性单克隆的鉴定：对长出的克隆先进行双酶切鉴定，再对鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。挑平板上的阳性单克隆，用加过氨苄青霉素的LB培养基培养过夜，然后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，PCR和双酶切鉴定阳性克隆，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。最后将鉴定好的阳性克隆送上海英俊生物科技有限公司测序。

双酶切反应体系：
SmaⅠ	1 μL
BamHⅠ	1 μL
10×T Buffer	1 μL
0.1% BSA	2 μL
PLV-sfGF(2A)-puro载体	1 μg
灭菌水	up to 20 μL

连接反应体系：
T₄ DNA连接酶10×loading buffer	1 μL
PLV-sfGF(2A)-puro载体(50 ng)	5 μL
骨形态发生蛋白7目的基因	1 μL
T₄ DNA连接酶	1 μL
灭菌水	up to 10 μL

病毒的包装：
制备质粒 DNA：将慢病毒载体5 μg、 pH1载体3.75 μg、pH2载体1.25 μg加入DMEM无血清培养基，充分混匀，使最终总体积保持500 μL。
制备脂质体转染试剂稀释液：20 μL Lipofectamine 2000+DMEM无血清培养基480 μL，充分混匀。
将脂质体转染试剂稀释液加入质粒 DNA 溶液中，立刻充分混匀；室温孵育转染混合液15 min。在孵育转染混合液时，消化293T细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基制备成浓度为0.6×10⁹ L^-1细胞悬液。将细胞悬液放入15 mL离心管备用。将每1 mL转染混合液加入 10 mL细胞悬液，轻轻吹吸细胞混匀，加入10 cm培养皿，放入37 ℃培养24 h。去除含有转染试剂的培养基，用10 mL病毒培养基换液。转染后48 h收集细胞培养上清。500×g离心10 min 去除细胞碎片。同样的方法获取空载体病毒。
慢病毒颗粒PLV-sfGFP(2A)-BMP7转染大鼠骨髓间充质干细胞：感染病毒前24 h将骨髓间充质干细胞以合适的密度接种到3个10 cm培养皿中，待细胞融合率为80%左右时，进行转染。室温溶解病毒液，混匀。培养皿更换无双抗的新鲜培养基3 mL，取两皿细胞分别加入浓缩后病毒原液2 mL(PLV-sfGFP(2A)-puro病毒液和PLV-sfGFP(2A)- BMP7病毒液)，同时加入polybrene至终质量浓度为4 mg/L感染骨髓间充质干细胞，充分混匀后放入37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中培养。培养24 h，更换为低糖DMEM完全培养液继续培养。病毒感染后48 h，去除培养液，加入含有300 mg/L嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；每2 d换液1次，直至空白对照死亡。药筛4 d后空白对照骨髓间充质干细胞全部凋亡；而感染PLV-sfGFP (2A)-puro和PLV-sfGFP(2A)-BMP7的两种细胞几乎没有细胞凋亡，停止药筛，进行传代培养。
RT-PCR检测转染细胞人骨形态发生蛋白7的表达^[16-18]：
总RNA的提取：①均质化：细胞接种于6孔板分为空白组、空载组、转染组，每孔各加入1 mL TRIzol试剂，用移液器抽吸几次，置室温5 min，使细胞完全裂解，转移净化后的均质溶液到新1.5 mL EP管中，室温孵育5 min。②相分离：各组加氯仿0.2 mL，大力摇管15 s，室温孵育3 min，4 ℃，12 000×g离心15 min，转上层水相(400-500 μL)于新EP管中。③RNA沉淀：加入等体积(0.5 mL)异丙醇，混匀，置室温孵育10 min。4 ℃，12 000×g离心10 min。④RNA洗涤：弃上清，加预冷的体积分数为75%乙醇(0.1% DEPC水配制)1 mL，涡旋混合，4 ℃，7 500×g离心5 min。⑤重新溶解RNA：瞬间离心，吸出上清，超净工作台开风机干燥约10 min(不能完全干燥)。溶于DEPC水中至20 μL，吹打几次溶解RNA，并在 55 ℃孵育10 min，分装-80 ℃保存。⑥RNA浓度的测定：取样品，用NaNO 2000超微量分光光度计测定RNA浓度与A260/A280值。
RNA反转录反应：把RNA在65 ℃条件下灭活5 min后，立即放于冰上冷却，进行变性，在37 ℃条件下，进行15 min的反转录反应，然后98 ℃水浴进行5 min的酶失活反应，反应结束之后的cDNA，保存于-20 ℃。

反应液体系组成：
5×RT Buffer	2 μL
RT Enzyme Mix	0.5 μL
Primer Mix	0.5 μL
RNA	0.5 pg-1 μg
Nuclease-free Water	up to 10 μL

引物序列及扩增产物大小：
名称	引物	长度
人骨形态发生蛋白7	上游引物5’-GGG CTT CTC CTA CCC CTA CA-3’ 下游引物5’-GTC GAG CAG GAA GAG ATC CG -3’	334 bp
β-actin	上游引物5’-GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A-3’ 下游引物5’-CTC GCG CTA CTC TCT CTT TCT GG-3’	333 bp

PCR反应体系：
DNA template	3 μL
10×PCR Buffer	2 μL
dNTP Mixture	1.6 μL
上游引物(20 μmol/L)	0.8 μL
下游引物(20 μmol/L)	0.8 μL
rTaq酶	0.2 μL
RNase-Free ddH₂O	至20 μL

PCR：①设计引物：按NCBI的genebank查询人骨形态发生蛋白7和大鼠β-actin基因序列，采用Primer-BLAST功能设计人骨形态发生蛋白7基因和内对照基因β-actin引物序列及扩增产物大小。②PCR条件：按PCR反应体系进行PCR反应，人骨形态发生蛋白7的PCR循环条件为94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30个周期。β-actin的PCR循环条件为94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30个周期。③琼脂糖凝胶电泳：PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewⅠ型核酸染色剂染色。每个加样孔中分别加入内参PCR产物和人骨形态发生蛋白7的PCR产物各9 µL及1 µL 10×DNA Loading buffer，电压 80 V电泳25 min后，于凝胶自动分析仪上对特异性PCR扩增带进行图像扫描。
Western-blot检测转染后细胞骨形态发生蛋白7的蛋白表达^[19-21]：
总蛋白的提取：分别收集转染组、空载组和未转染的骨髓间充质干细胞，用4 ℃的PBS洗3次，充分吸弃PBS残液，冰上操作；加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液400 µL，置于冰上；用细胞刮刀刮掉培养皿中的细胞，转移至预冷EP管，并冰浴15 min；4 ℃离心12 000×g，20 min；上清液转移至预冷EP管，-80 ℃保存。
总蛋白定量与处理：留2 µL样品采用碧云天BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，其余分装冻存于-80 ℃备用。上样量30 µg，分别将蛋白上清液与buffer加入EP管中(封口膜封口)，沸水浴3 min，待上样。
SDS-PAGE电泳：配制8%分离胶，5%浓缩胶；电泳槽夹用前清洗且用蒸馏水冲洗，安胶(检漏)；加电泳缓冲液SDS-PAGE(槽内每次换新，外液可用2次或3次)，上样30 µg，加maker 5 µL(protein loading)；先恒压80 V，约30 min (loading buffer在浓缩胶与分离胶处呈一条线)；调为恒压120 V至loading buffer 跑至底端(约80 min)。
转膜与蛋白封闭：①处理PVDF膜：用甲醇泡5 min，双蒸水洗一下，再用电转液泡5 min，滤膜、海绵亦需充分浸泡。②转膜顺序：阳极(白色)-海绵、滤纸-PVDF膜-PAGE胶-滤纸、海绵-阴极(黑色)。③放入电转槽中，加电转液至刻度线，180 mA恒流100-120 min，槽内需放入冰壶，槽外加充足的冰；取膜时protein面朝上，双蒸水洗一下，加5%脱脂奶粉(用1×TBST配制)封闭至少1 h。
敷一抗：将封闭好的膜弃去脱脂奶粉，1×TBST洗3次，10 min/次，根据maker剪膜：每孔加5 mL一抗稀释液，再分别加一抗actin、VEGF(1︰500)10 µL，BMP-7(1︰200)，4 ℃摇床过夜。
敷二抗以及显影：一抗回收(最多用5次)，1×TBST洗膜，5 min/次×5次，每孔加5 mL脱脂奶粉，加二抗：actin抗鼠 (1︰5 000)，VEGF抗兔(1︰5 000)，BMP-7抗羊(1︰5 000)，孵育1 h。二抗弃去，1×TBST洗膜，5 min/次×5次，PVDF膜放入显影液中，然后放入凝胶成像仪显影。荧光强度值=检测条带灰度值/内参条带(β-actin)灰度值。
主要观察指标：转染骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白的表达。
统计学分析：所有数据应用SPSS 10.0软件包进行统计学处理，均数间比较用F 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。