不同有机溶剂对缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.21.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (21): 3317-3322.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.21.007

• 药物控释材料 drug delivery materials • 上一篇下一篇

不同有机溶剂对缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊的影响

李夏林¹，易伟宏¹，靳安民²，闵少雄²

¹深圳南山人民医院脊柱外科，广东省深圳市 518052；²南方医科大学附属珠江医院骨科，广东省广州市 510280

出版日期:2015-05-21 发布日期:2015-05-21
通讯作者: 闵少雄，主任医师，副教授，博士，硕士生导师，南方医科大学附属珠江医院骨科，广东省广州市 510280
作者简介:李夏林，男，1978年生，湖南省醴陵市人，2014年南方医科大学毕业，博士，主治医师，讲师，主要从事骨组织工程及药物缓释研究。
基金资助:
广东省医学科研基金项目(B2013254)；深圳市南山区卫生科技计划项目(2014010)

Effects of different organic solvents on slow-release recombinant human bone morphogenetic protein-2 microcapsules

Li Xia-lin¹, Yi Wei-hong¹, Jin An-min², Min Shao-xiong²

¹Department of Spinal Surgery, Shenzhen Nan Shan Hospital, Shenzhen 518052, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China

Online:2015-05-21 Published:2015-05-21
Contact: Min Shao-xiong, M.D., Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
About author:Li Xia-lin, M.D., Attending physician, Lecturer, Department of Spinal Surgery, Shenzhen Nan Shan Hospital, Shenzhen 518052, Guangdong Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. B2013254; the Health Science and Technology Plan Project of Nanshan District in Shenzhen, No. 2014010

摘要/Abstract

摘要：

背景：查阅文献发现在采用复乳溶剂挥发法制备缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊的过程中，可以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或不同有机溶剂混合物等作为油相，而孰优孰劣尚无定论。
目的：优化包封重组人骨形态发生蛋白2微胶囊制备方法，比较不同有机溶剂对微胶囊产生的影响。
方法：分别以二氯甲烷(A组)、二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(B组)、乙酸乙酯(C组)、乙酰丙酮(D组)等4种不同类型的有机溶剂作为油相，以聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物为囊材，采用复乳溶剂挥发法制备缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊，检测微囊的粒径、形态及包封率。将制备的微胶囊分别与第3代大鼠骨髓间充质干细胞共培养，培养14 d后检测碱性磷酸酶活性。
结果与结论：A组微囊形态均一规则，微囊粒径小(4-10 µm)，包封率最高；B组、C组微囊粒径分布范围较大，包封率中等；D组微囊基本难成形，包封率最低。A组、B组、C组碱性磷酸酶活性明显高于D组(P < 0.05)，A组、B组均明显高于C组(P < 0.05)，A组与B组之间无明显差异。表明以二氯甲烷作为有机溶剂制备的重组人骨形态发生蛋白2微胶囊包封率高，形态优良且能很好地保护重组人骨形态发生蛋白2的生物活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 号缓释材料, 号重组人骨形态发生蛋白2, 号微囊, 号聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物, 号有机溶剂；包封率

Abstract:

BACKGROUND: In literatures, the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) loaded microcapsules can be fabricated by double emulsion solvent evaporation method with different organic solvents, such as methylene chloride, ethyl acetate or their mixture. But so far it is not determined yet which one is better.
OBJECTIVE: To optimize the preparation method of microcapsules encapsulating rhBMP-2 and to compare the effects of different organic solvents on the microcapsules.
METHODS: Polylactic acid-polyethylene glycol-polylactic acid copolymer as microcapsules was used to prepare rhBMP-2 loaded microcapsules with double emulsion solvent evaporation method. Four kinds of organic solvents, methylene chloride (group A), mixture of methylene chloride and ethyl acetate (group B), ethyl acetate (group C) and acetyl acetone (group D) were chosen as oil phases to compare their effects on microcapsule’s morphology, diameter, and encapsulation efficiency. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells from rats were
co-cultured with prepared microcapsules for 14 days, and then alkaline phosphatase activity was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other organic solvents, dichloromethane could cause microcapsules with the smaller and more uniform shape (4-10 microns) and the highest encapsulation efficiency; the microcapsules prepared by mixture of methylene chloride and ethyl acetate had relatively wide size distribution and moderate encapsulation efficiency; the microcapsules prepared by acetylacetone were difficult to form and keep the bioactivity of rhBMP-2. After cultured with rat bone marrow mesenchymal stem cells for 14 days, the alkaline phosphatase activity in groups A, B and C was significantly higher than that in group D and there was no significant difference between group A and group B; the alkaline phosphatase activity in groups A and B was significantly higher than that in group C (P < 0.05). The results show the rhBMP-2-loaded microcapsules prepared by methylene chloride as organic solvent have good shape, high encapsulation efficiency, and good biological activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Methylene Chloride, Bone Morphogenetic Proteins, Capsules

中图分类号:

R318

李夏林，易伟宏，靳安民，闵少雄. 不同有机溶剂对缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(21): 3317-3322.

Li Xia-lin, Yi Wei-hong, Jin An-min, Min Shao-xiong. Effects of different organic solvents on slow-release recombinant human bone morphogenetic protein-2 microcapsules [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(21): 3317-3322.

图/表（结果） 3

2.1 不同有机溶剂对微囊形态的影响通过优化的复乳溶剂挥发法及冷冻干燥法成功地制备了其内包封rhBMP-2的聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊。通过光电显微镜可以观察到微囊的形态，见图1所示：A组微囊形态规整，大小分布较均匀，呈现椭圆形或规则圆形，微囊直径范围为4-10 µm；B组与C组大部分呈球形，少部分呈现不规则样形态，大小分布范围较广，且微囊直径普遍大于A组， B组直径范围为4-20 µm，C组直径范围为2-16 µm；D组制备出的产物偶能见到类似圆形微囊，大部分呈大小不均的不定形颗粒状物质。
2.2 不同有机溶剂对微囊包封率的影响包封率是微囊制备成功与否的重要指标之一，本实验中4种溶剂对微囊包封率的影响结果为，A组的包封率最高，达到(65.1±5.8)%；B组和C组包封率分别为(53.2±4.6)%和(48.3±5.6)%；D组测出的包封率仅为(5.2±1.3)%，即说明在本实验条件下采用二氯甲烷为油相可以达到最高的包封率。

2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的形态及鉴定通过倒置显微镜观察，可见骨髓间充质干细胞贴壁，传至第3代时细胞形态较一致，呈长梭形，折光性强，排列成束，类似成纤维样细胞(图2)。
流式细胞仪直接荧光法检测显示，第3代骨髓间充质干细胞的CD44、CD166的阳性细胞比率分别为98.2%和99.3%，而CD45、CD34阳性细胞比率分别为1.56%和0.87%。这些结果可以进一步证实培养的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞。

2.4 碱性磷酸酶活性检测为了检验不同组微囊缓释液中骨形态发生蛋白的生物活性，以及各组微胶囊缓释液对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导能力的区别，对细胞进行碱性磷酸酶活性检测。取材料缓释液定期加入细胞培养液中，于第14天检测细胞碱性磷酸酶活性，A组-D组的碱性磷酸酶值分别为(15.6±3.4)，(13.4±2.2)，(8.3±1.2)，(2.2±0.5) mg/L，各组细胞碱性磷酸酶表达量有统计学差异(F=28.57，P=0)，A组、B组、C组碱性磷酸酶值均高于D组(P=0)，而A组、B组之间碱性磷酸酶值比较差异无显著性意义，而A组、B组碱性磷酸酶值均高于C组，差异有显著性意义(图3)。可见使用二氯甲烷制备的微囊缓释rhBMP-2活性最高。

参考文献

[1] Lei L,Wang S,Wu H,et al.Optimization of release pattern of FGF-2 and BMP-2 for osteogenic differentiation of low-population density hMSCs.J Biomed Mater Res A. 2015; 103(1):252-261.

[2] Lim SM,Eom HN,Jiang HH,et al.Evaluation of PEGylated exendin-4 released from poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres for antidiabetic therapy.J Pharm Sci. 2015; 104(1):72-80.

[3] Simon-Yarza T,Formiga FR,Tamayo E,et al.PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery.Int J Pharm. 2013;440(1):13-18.

[4] Li X, Min S, Zhao X,et al. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 2014;10:015002.

[5] Vyslouzil J,Dolezel P,Kejdusova M,et al.Long-term controlled release of PLGA microparticles containing antidepressant mirtazapine. Pharm Dev Technol. 2014:1-8. [Epub ahead of print]

[6] Shah RB, Schwendeman SP. A biomimetic approach to active self-microencapsulation of proteins in PLGA.J Control Release. 2014;196:60-70.

[7] Ogbonna JD,Kenechukwu FC,Nwobi CS,et al.Formulation, in vitro and in vivo evaluation of halofantrine-loaded solid lipid microparticles.Pharm Dev Technol. 2014:1-8.[Epub ahead of print]

[8] 林楚伟,周胜华,杜优优.全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较[J].中国组织工程与临床康复,2010,14(14):2508-2512.

[9] McKay WF,Peckham SM,Badura JM.A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). Int Orthop. 2007;31(6):729-734.

[10] Lebl DR.Bone morphogenetic protein in complex cervical spine surgery: A safe biologic adjunct? World J Orthop.2013; 4(2):53-57.

[11] Lad SP,Bagley JH,Karikari IO,et al. Cancer after spinal fusion: the role of bone morphogenetic protein.Neurosurgery. 2013; 73: 440-449.

[12] Calori GM,Donati D,Di Bella C,et al.Bone morphogenetic proteins and tissue engineering: future directions. Injury.2009; 40 Suppl 3:S67-76.

[13] Kempen DH,Kruyt MC, Lu L,et al.Effect of autologous bone marrow stromal cell seeding and bone morphogenetic protein-2 delivery on ectopic bone formation in a microsphere/ poly(propylene fumarate) composite.Tissue Eng Part A. 2009; 15(3):587-594.

[14] Kim SS,Gwak SJ,Kim BS.Orthotopic bone formation by implantation of apatite-coated poly(lactide-co-glycolide)/ hydroxyapatite composite particulates and bone morphogenetic protein-2.J Biomed Mater Res A. 2008; 87(1):245-253.

[15] Zhao J,Wang S,Bao J,et al.Trehalose maintains bioactivity and promotes sustained release of BMP-2 from lyophilized CDHA scaffolds for enhanced osteogenesis in vitro and in vivo. PloS one.2013;8:e54645.

[16] White LJ, Kirby GT,Cox HC,et al.Accelerating protein release from microparticles for regenerative medicine applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2013;33(5):2578-2583.

[17] Chen L,Lu X,Li S,et al.Sustained delivery of BMP-2 and platelet-rich plasma-released growth factors contributes to osteogenesis of human adipose-derived stem cells. Orthopedics.2012;35:e1402-1409.

[18] Hernandez A,Reyes R,Sanchez E,et al.In vivo osteogenic response to different ratios of BMP-2 and VEGF released from a biodegradable porous system. J Biomed Mater Res A.2012;100(9):2382-2391.

[19] Molavi O,Mahmud A,Hamdy S,et al.Development of a poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) nanoparticle formulation of STAT3 inhibitor JSI-124: implication for cancer immunotherapy. Mol Pharm.2010;7(2):364-374.

[20] Zhang L,Lan X,Xu M,et al.Improvement in angiogenesis and osteogenesis with modified cannulated screws combined with VEGF/PLGA/fibrin glue in femoral neck fractures.J Mater Sci Mater Med. 2014;25(4):1165-1172.

[21] Yan J,Yang S,Sun H,et al.Effects of releasing recombinant human growth and differentiation factor-5 from poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres for repair of the rat degenerated intervertebral disc.J Biomater Appl. 2013;29(1): 72-80.

[22] Gainza G,Aguirre JJ,Pedraz JL,et al.rhEGF-loaded PLGA-Alginate microspheres enhance the healing of full-thickness excisional wounds in diabetised Wistar rats. Eur J Pharm Sci.2013;50(3-4):243-252.

[23] Zou GK,Song YL,Zhou W,et al.Effects of local delivery of bFGF from PLGA microspheres on osseointegration around implants in diabetic rats.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2012;114(3):284-289.

[24] Jelvehgari M, Montazam SH. Comparison of microencapsulation by emulsion-solvent extraction/ evaporation technique using derivatives cellulose and acrylate-methacrylate copolymer as carriers.Jundishapur J Nat Pharm Prod. 2012;7(4):144-152.

[25] Gupta V,Davis M,Hope-Weeks LJ,et al.PLGA microparticles encapsulating prostaglandin E1-hydroxypropyl-beta- cyclodextrin (PGE1-HPbetaCD) complex for the treatment of pulmonary arterial hypertension (PAH). Pharm Res. 2011; 28(7): 1733-1749.

[26] Sheng Y,Yuan Y,Shan X,et al. Study on mass transfer behavior of hemoglobin-based nanocapsule surface. Sheng wu yi xue gong cheng xue za zhi = Journal of biomedical engineering.Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2008;25(4):879-884.

[27] Zhao J,Liu CS,Yuan Y,et al.Preparation of hemoglobin-loaded nano-sized particles with porous structure as oxygen carriers. Biomaterials.2007;28:1414-1422.

[28] Kim HK, Park TG. Microencapsulation of human growth hormone within biodegradable polyester microspheres: protein aggregation stability and incomplete release mechanism. Biotechnol Bioeng.1999;65(6):659-667.

引言

重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP-2)是骨组织工程中最常用的外源转化生长因子，具有生物学活性好、生物相容性好等优点，在骨组织工程及修复再生领域有巨大的研究应用价值。然而单纯的骨形态发生蛋白半衰期短，在体内易被蛋白酶降解，其诱导活性难以得到充分发挥，达不到所期望的生物效应，因此选择合适的缓释载体对于骨形态发生蛋白发挥最大骨诱导活性至关重要。微囊技术系利用天然或合成的高分子材料(称为囊材)作为囊膜壁壳，将固态药物或液态药物(称为囊心物)包裹而成药库型微型胶囊。它不但能包封普通的化学药物，同时也能很好地用于制成大分子药物的缓释微球系统，其应用已日趋广泛并成熟，成为制备药物缓释制剂重要的方法之一，也为制备骨形态发生蛋白2缓释制剂提供了一个良好的解决方案。
载药微胶囊的制备方法有很多种，其中复乳-溶剂挥发法(W/O/W)是目前国际最为常用的方法之一。有研究表明在复乳法制备过程中，许多实验参数对最终微囊的包封率、表征等特征均会产生不同的影响，而用于溶解高分子材料的有机溶剂是重要的影响参数之一。查阅文献发现不同的学者在制备过程中常选用不同的有机溶剂作为油相溶媒，比如二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮及橄榄油等不同有机溶剂混合物等，而孰优孰劣尚无定论。本实验采用复乳-溶剂挥发法制备rhBMP-2载药微囊，以具有双亲特性的高分子聚合物聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物作为囊材，通过比较不同有机溶剂对最后微囊包封率、表征的影响，探讨优化rhBMP-2载药微囊的制备方法，为rhBMP-2体内缓释载体的研究提供理论依据和技术支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

实验动物：3月龄雄性Wistar大鼠，体质量约300 g，由南方医科大学动物实验中心提供。
实验方法：
载rhBMP-2微囊的制备：以经典复乳溶剂挥发法(W/O/W)制备包封rhBMP-2的聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊^[1-3]。根据本研究组既往研究的实验结果选用优化的实验参数^[4]。方法简述如下：首先将rhBMP-2 3 μg溶解于200 μL蒸馏水成为内水相(W1)；将330 mg 聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溶解于不同的有机溶剂成为油相(O)，油相中司盘- 20(span-20)浓度为0.5%。将内水相加入油相，予以振荡混匀并超声乳化10 min，形成初乳液(W1/O)。再配制40 mL浓度为1.0%的聚乙烯醇溶液作为外水相(W2)，将初乳液滴加到外水相中混合，并超声乳化10 min，形成复乳液(W1/O/W2)。以800 r/min速度室温下搅拌40 min，以彻底挥发有机溶液，固化微囊。将微囊予以低温离心10 min (8 000 r/min)，洗涤3次再收集，冷冻干燥过夜。得到微囊密封干燥保存于-20 ℃冰箱备用。

缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊制备实验用主要试剂：
试剂	来源
rhBMP-2	北京义翘神州生物技术有限公司
rhBMP-2 ELISA试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乙烯醇(分子量22 000，分析纯)、司盘-20(分析纯)	山东医疗器械研究所
MTT检测试剂盒	上海贝博生物公司
碱性磷酸酶试剂盒	南京建成科技有限公司
优级胎牛血清	浙江天杭生物科技有限公司
DMEM/F12细胞培养液	美国Hyclone公司
RIPA裂解液(强)	上海碧云天生物技术研究所
PBS(0.1 mol/L,pH=7.4)	北京中杉金桥生物技术有限公司
胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)	北京崇文华广生化仪器公司
荧光标记单克隆抗体	美国BD公司

缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊制备实验用主要实验设备：
设备	来源
超净工作台、SW-CJ-2FD超净工作台	苏州净化设备公司
冷冻离心机(SCR20B)、扫描电镜(S-3000 N)、冷冻离心机(SCR20B)	日本HITACHI公司
电子天平(BS210S)	日本Satorius公司
空气恒温振荡器	江苏大仓医疗仪器厂
冷冻干燥机(SL-12N)	南京顺流仪器有限公司
磁力搅拌器(SH-3)	北京金紫光科技发展有限公司
电压力蒸汽消毒器	上海仪器总厂
3517-2型CO₂细胞培养箱	美国SHELLAB公司
倒置显微镜、倒置显微镜数码摄像仪	日本OLYMPUS公司
酶标仪	美国Thermo Scientific公司
细胞培养板	广州洁特生物公司
MIR 160型恒箱、-80 ℃冰箱	日本Sanyo公司
FACScan流式细胞仪	美国BD公司

微囊表面形态学观察：各组微囊的表面形态通过光电显微镜来观察。测量视野下50个微囊，测定其平均粒径。
微囊包封率的测定：微囊包封率是指包封于微囊内的药物量与总共投入的药物总量的比值，为评价微囊制备方法的非常重要的参数之一。本实验参考以往研究方法测定微囊包封率^[5-7]，简述如下：将20 mg微囊悬浮于1 mL PBS中。将样品置于恒温振荡箱中(100 r/min，37 ℃)振荡36 h。然后将样品离心，收集上清液，过滤，用 rhBMP-2 ELISA试剂盒测定上清液中rhBMP-2浓度，由此推算出微囊包封的rhBMP-2的量。微囊包封率按下面的公式计算：

制备微囊的不同有机溶剂分组：
微囊分组	有机溶剂
A组	4 mL二氯甲烷
B组	2 mL二氯甲烷+2 mL乙酸乙酯
C组	4 mL乙酸乙酯
D组	4 mL丙酮

大鼠骨髓间充质干细胞的分离提纯：本次所有动物细胞实验经南方医科大学实验动物权利与伦理管理委员会批准。按照之前的研究描述，用全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞^[8]。将雄性Wistar大鼠断颈处死，在无菌条件下剪取大鼠双侧股骨，去除股骨两侧干骺端，以含体积分数10%FBS的DMEM/ F12细胞培养液冲洗骨髓腔，反复冲洗3次，将冲洗液收集，吹打均匀，以800 r/min离心5 min，收集细胞，再用培养液重悬，接种于培养瓶中，于体积分数5%CO₂浓度的细胞培养箱中培养，第2天换液，去除悬浮的红细胞，后每2 d更换细胞培养液。待贴壁细胞达到80%-90%融合后，弃培养液，PBS清洗3次，用胰酶+EDTA消化液消化贴壁细胞，以1︰2 比例传代。传至第3-5代可用于细胞鉴定及后续实验。
大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：共通过2个方面对大鼠骨髓间充质干细胞进行鉴定：①倒置显微镜下观察细胞形态：是否贴壁生长，细胞形态，边缘等特征。②通过流式细胞仪检测细胞表面标志物，观察细胞表达细胞表面标志物CD44、CD166、CD34和CD45 的阳性率。将第3代骨髓间充质干细胞胰酶消化后离心，PBS冲洗，离心1遍后加入荧光标记的单克隆抗体CD44-PE、CD166-PE、CD34-PE、CD45-PE，于室温避光孵育半小时，再以PBS清洗离心2次后行流式细胞仪检测。
缓释液骨形态发生蛋白活性测定：通过检测细胞碱性磷酸酶的活性来检测骨髓间充质干细胞的成骨分化结果，以评价微囊缓释的rhBMP-2的生物活性。将10 mg微囊干粉浸泡在装有1 mL PBS的EP管中，放置在37 ℃恒温箱中。每2 d取出EP管，200 r/min离心5 min，收集上清液并储存在-20 ℃冰箱中直到实验时解冻。再加入1 mL新鲜PBS继续放入恒温箱。将骨髓间充质干细胞以5×10⁴/cm²密度接种于48孔板中，用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液于37 ℃、体积分数5%CO₂加湿的细胞培养箱中培养细胞。培养液每2 d更换，并同时加入对应的各组微囊浸泡液100 μL。于培养2周后取出培养板，检测各组细胞的碱性磷酸酶活性。具体按照试剂盒说明书操作，简述如下：吸出培养液，加入RIPA裂解液150 μL/孔，充分接触，吹打一两秒，裂解贴壁细胞。然后将30 μL裂解物与含有磷酸苯二钠的50 μL基质液及50 μL碱性缓冲液混合，在37 ℃恒温箱中温育15 min，再加入安替比林和K3Fe(CN)6以终止反应。用酶标仪检测样品520 nm波长处吸光度值以确定碱性磷酸酶的活性。每个样品设6个重复样以减少误差。
主要观察指标：各组微囊的粒径、形态、包封率及碱性磷酸酶活性。
统计学分析：实验结果中各项指标所得数据用x±s表示，碱性磷酸酶检测结果均以SPSS 19.0(美国)软件进行分析，组间数据比较用单因素方差分析，两两比较用S-N-K检验，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨折愈合过程中骨形态发生蛋白家族多种活性因子起着非常重要的作用。其中骨形态发生蛋白2是一种强的骨诱导生长因子，它能刺激成骨细胞分化，并促进骨形成。美国FDA已批准一种rhBMP-2复合胶原蛋白的产品(INFUSE bone graft，美敦力公司)用于临床治疗胫骨等骨折及促进腰椎后路椎间融合等[9]。然而当大量骨形态发生蛋白2局部制剂应用于临床后，许多临床并发症相继出现，诸如局部软组织水肿、脊髓脊神经根炎、异位骨化、种植体周围骨吸收及诱发癌症风险等近几年已备受关注^[10-11]。大多数学者认为造成这些并发症的主要原因在于：这种产品的骨形态发生蛋白2的缓释曲线不够科学，常呈现短期内高浓度释放，其浓度可达正常生理浓度的数千倍，高浓度的骨形态发生蛋白2容易引起各种局部并发症，影响临床疗效^[12]。有研究表明，局部缓释低浓度的骨形态发生蛋白2比短期突释具有更优良诱导成骨的能力且不良反应小^[13-15]，因此骨形态发生蛋白2缓释制剂是目前研究的热点，未来临床应用前景广阔。
微囊(Microcapsules)技术是一种利用天然或合成的高分子成膜材料(囊材)把液体或固体药物(囊心物)包裹形成微小胶囊的技术。在医药领域由于它可以将药物制成缓释胶囊，使药物体内控释甚至靶向释放的目的，同时还能保护诸如蛋白质等大分子活性药物在体内不被迅速分解，从而使药物最大限度地发挥其功效。目前为止已有200多种药物采用了微囊化技术，但大部分为化学类药物，如抗生素、避孕药、解热镇痛药、抗癌药等，而用微囊化技术包封生物活性大分子，包括蛋白质，基因等的研究还处于起步阶段，多为体外实验及动物实验等临床前研究，很多蛋白质活性因子等药物制成的微囊用于临床还需要进一步考察其安全性及有效性。近些年也有学者尝试以PLGA等高分子材料将骨形态发生蛋白2制成微囊缓释制剂，并试图优化其缓释曲线，提高其安全性及有效性[16-18]。然而微囊制备工艺优化的研究目前较缺乏。本次实验用同时具备亲酯及亲水活性的高分子聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物作为囊材，成功将rhBMP-2制备成缓释微囊制剂，并比较不同有机溶剂对微囊形态，包封率及其缓释的rhBMP-2成骨诱导活性产生的影响。其结果表明，用改良的复乳溶剂挥发法能成功地制备出形态良好，包封率高，并能保留细胞因子生物活性的载rhBMP-2的聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微胶囊。
制备微囊的方法包括有很多种。复乳溶剂挥发法仍是目前制备包封蛋白质类微胶囊最常用的方法^[3，19-22]。由于制备条件相对温和，不容易破坏活性因子的结构和功能，并且包封蛋白效果稳定，故而被众多研究者所认可并使用。既往的研究表明，制备工艺还对最后微囊的大小，活性因子的包封率有很大影响。为了能够使得到的微囊包封率高，药物缓释性能好，同时能最大限度保留负载的活性因子的生物活性，需要研究将各种制备条件中的一些关键影响因素予以调控和优化，制备出最佳的符合临床需要的微囊。本课题组既往的研究表明：囊材的相对分子质量、质量、加入的活性蛋白质的质量、内水相乳化剂浓度、外水相中聚乙烯醇浓度及微囊固化的搅拌时间均会对微囊的包封率产生重要影响[4]。而本次研究是在既往研究成果的基础上，探寻不同有机溶剂对微囊的形态、包封率及蛋白质活性可能产生的影响。二氯甲烷，分子式为CH₂Cl₂，是一种有芳香气味，不可燃，低沸点的无色透明液体，由于其溶解能力强，毒性低，且具备良好的稳定性及安全性，是一种优良的有机溶剂，在生物材料制备及医学上应用较广泛。用复乳法制备包封具备生物活性因子的微囊过程中，大部分学者还是选择常规用二氯甲烷作为有机溶剂^[23-25]。而乙酸乙酯与丙酮均为具有水溶性的有机溶剂，有研究表明使用这类有机溶剂制备纳米微球能有效调节微球表面的孔隙率[26]。乙酸乙酯是一种无色透明具有刺激性气味的液体，具有优异的溶解性、快干性，且毒性低，是一种重要的有机化工原料和极好的工业溶剂。因此也有学者用复乳溶剂挥发法制备载药微囊的过程中以乙酸乙酯与二氯甲烷的混合液作为有机溶剂制备载药微囊，并得到了优良的微囊参数^[27-28]。本次实验比较了单纯的二氯甲烷，乙酸乙酯及二者的混合液在制备rhBMP-2/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊过程中对微囊参数的比较，结果显示使用单纯的二氯甲烷制备出的rhBMP-2/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊各项参数均较为优良。而乙酰丙酮也是一种常用的工业上常用的有机溶剂，可以用作醋酸纤维素的溶剂，有机合成中间体，金属络合剂等，但由于毒性较大，之前很少被用来制备微囊，本次实验结果也进一步证实乙酰丙酮作为一种有机溶剂不适合用于载活性蛋白的微囊的制备(复乳法)。
本次研究证明了二氯甲烷作为有机溶剂在制备rhBMP-2/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊过程中的优良性能，这与既往的研究结果相似^[5]。相比较乙酸乙酯、乙酰丙酮等其他有机溶剂，二氯甲烷制备的rhBMP-2/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸微囊包封率高，形态优良，且能很好地保护其内包封的rhBMP-2的生物活性，是一种安全，低毒，能有效溶解高分子可降解生物材料的有机溶剂，适用于制备各种需要保留生物活性蛋白质的微囊缓释制剂，也为今后以复乳溶剂挥发法制备载药微囊的工艺优化提供了参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

不同有机溶剂对缓释重组人骨形态发生蛋白2微胶囊的影响

Effects of different organic solvents on slow-release recombinant human bone morphogenetic protein-2 microcapsules

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[4]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[5]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[6]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[7]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[8]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[9]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[10]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[11]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[12]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[13]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[14]	李黎, 马力, 李鹤. 磁性壳聚糖微球的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 577-582.
[15]	唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.