序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 3037-3041.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.015

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

尹红¹，李晓丰^2，3，4，李剑平^{2，3，4，5}

¹中国医科大学附属盛京医院麻醉科，辽宁省沈阳市 110041；²辽宁省血液中心输血医学研究所，辽宁省沈阳市 110044；³辽宁省血液安全研究重点实验室，辽宁省沈阳市 110044；⁴沈阳市血液安全研究重点实验室，辽宁省沈阳市110044；⁵沈阳市干细胞临床应用研究中心，辽宁省沈阳市 110044

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 李剑平，博士，主任医师，辽宁省血液中心输血医学研究所，辽宁省沈阳市110044；辽宁省血液安全研究重点实验室，辽宁省沈阳市110044；沈阳市血液安全研究重点实验室，辽宁省沈阳市 110044；沈阳市干细胞临床应用研究中心，辽宁省沈阳市 110044
作者简介:尹红，女，1975年生，内蒙古自治区人，蒙古族，2013年中国医科大学毕业，博士，主要从事全身麻醉药器官功能保护及其机制的研究。
基金资助:
沈阳市科学技术计划项目(F10-206-1-00)

Sequence analysis and identification of a novel allele, HLA-B*55:46

Yin Hong¹, Li Xiao-feng^{2, 3, 4}, Li Jian-ping^{2, 3, 4, 5}

¹Department of Anaesthesia, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110041, Liaoning Province, China; ²Transfusion Medicine Institute, Liaoning Blood Center, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; ³Key Laboratory of Blood Safety Research of Liaoning, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; 4Key Laboratory of Blood Safety Research of Shenyang, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; 5Shenyang Research Center for Stem Cell Clinical Application, Shenyang 110044, Liaoning Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Li Jian-ping, M.D., Chief physician, Transfusion Medicine Institute, Liaoning Blood Center, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; Key Laboratory of Blood Safety Research of Liaoning, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; Key Laboratory of Blood Safety Research of Shenyang, Shenyang 110044, Liaoning Province, China; Shenyang Research Center for Stem Cell Clinical Application, Shenyang 110044, Liaoning Province, China
About author:Yin Hong, M.D., Department of Anaesthesia, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110041, Liaoning Province, China
Supported by:
Shenyang Science and Technology Project, No. F10-206-1-00

摘要/Abstract

摘要：

背景：近几年来，随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高，中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。
目的：探索中国人的人类白细胞抗原新等位基因。
方法：应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术，对1名27岁男性汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA基因分型，并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。
结果与结论：PCR-序列特异性寡核苷酸探针结果显示该样本HLA-B基因座反应格局出现异常提示；基因测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致，在所检测的第2、3外显子中，与序列最相近的等位基因B*55:02:01的差异只是在第3外显子发生了nt 412 A→G一个核苷酸替代，导致第138位密码子由AAC→GAC，相应的编码的天冬酰胺改变为天冬氨酸。将其序列提交国际基因数据库及IMGT/HLA 数据库，证实该HLA等位基因为国际上首次发现，被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-B*55:46 (HM989018)。

关键词: 干细胞, 培养, 新等位基因, HLA-B*55:46, 序列分析, 聚合酶链式反应, 序列特异性寡核苷酸探针, 碱基, 氨基酸, 人类白细胞抗原, 基因座, 外显子

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, with the development of China Marrow Donor Program and the improvement of human leukocyte antigen (HLA) typing technique, novel HLA alleles have been discovered constantly in China.
OBJECTIVE: To identify and confirm a novel HLA allele in a Chinese individual.
METHODS: A new HLA allele was found in a 27-year-old male Han volunteer donor of hematopoietic stem cells during routine HLA genotyping by PCR-sequence specific oligonucleotide probes and sequencing-based typing.
RESULTS AND CONCLUSION:The HLA-B locus hybridization probe reaction patterns of this sample did not match to any known HLA-B alleles or allelic combinations. Exons 2-3 were sequenced in both directions using HLA-B sequence primer and group-specific sequencing primer. The new sequence had 1 nt change from its closest allele B*55:02:01 at nucleotide 412 where A→G (codon138 AAC→GAC) resulting in a coding change,
138 Asparagine (N) was changed to Aspartate (D). The nucleotide sequence has been submitted to the GenBank nucleotide sequence database and it is available under the accession number HM989018. A novel HLA allele, HLA-B*55:46, has been identified, and named officially by the WHO Nomenclature Committee.

Key words: 干细胞, 培养, 新等位基因, HLA-B*55:46, 序列分析, 聚合酶链式反应, 序列特异性寡核苷酸探针, 碱基, 氨基酸, 人类白细胞抗原, 基因座, 外显子

中图分类号:

R394.2

尹红，李晓丰，李剑平. 序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 3037-3041.

Yin Hong, Li Xiao-feng, Li Jian-ping. Sequence analysis and identification of a novel allele, HLA-B*55:46[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 3037-3041.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：于2011年1月在辽宁省血液中心输血医学研究所组织配型实验室完成所有实验。
对象：1名造血干细胞志愿捐献者，男，27岁，汉族，辽宁省沈阳市人。经体检合格后签署志愿捐献造血干细胞知情同意书，采集其EDTA抗凝全血样本5 mL，分装后 -20 ℃以下保存。

HLA多态性检测的试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
血液基因组DNA提取试剂盒	北京天根生化科技有限公司
基因分型试剂盒LABTypeTM试剂盒	美国ONELAMDA公司
基因测序试剂盒SBTexcellerator®试剂盒	荷兰Genome Diagnostics公司
Bigdye3.1测序试剂盒，9700型扩增仪，3130 Genetic Analyzer 基因测序仪	美国ABI公司
核酸蛋白测定仪	美国GENEQUAN公司
IS-200流式检测仪	美国Luminex公司

方法：
提取基因组DNA：取200 μL抗凝全血，按照北京天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，用GeneQuant核酸蛋白测定仪确定DNA标本质量，浓度为 55 μg/L，纯度A260 nm/280 nm为1.81，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测无DNA降解现象。
序列特异性寡核苷酸探针方法基因分型：采用基于Luminex平台的PCR-序列特异性寡核苷酸探针方法，进行样本的HLA-A、B、DRB1基因分型。应用LABTypeTM试剂盒，严格按照其试剂盒操作说明书，将DNA进行PCR扩增。扩增产物与标记有荧光的特异性探针微珠杂交后，应用IS-200流式检测仪检测，分型结果应用与试剂盒对应的HLA Tools软件(美国ONELAMDA公司)进行判读。软件依据DNA与每个微珠探针的反应格局，自动给出HLA-A、B、DRB1各基因座的分型结果。
基因测序：由于怀疑为新等位基因，随即采用了PCR产物直接测序方法(SBT)。应用SBTexcellerator®试剂盒的HLA-B基因座的特异性引物进行第1-7外显子的PCR扩增。扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min 30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min后冷却至4 ℃。扩增产物经ExoI/SAP酶纯化后，应用Bigdye3.1测序试剂盒，进行第2、3外显子正反两个方向的测序反应，测序产物再经过乙醇/醋酸钠沉淀，95 ℃热变性速冷后即可直接用ABI 3130 Genetic Analyzer基因测序仪进行毛细管电泳，得到PCR产物的基因序列。根据实验室以往采用的方法^[10-12]，为了分开2个杂合的等位基因，又应用荷兰Genome Diagnostics公司的组特异性引物(group sequence specific primer，GSSP)进行再次扩增和测序。结果应用与试剂盒对应的SBTengine®软件进行数据分析，根据电泳结果分析后自动得出基因测序结果。
主要观察指标：基因分型结果、PCR产物测序结果、核苷酸和氨基酸序列比较

讨论

HLA是人类主要组织相容性抗原，是迄今已知的人类遗传多态性最高的基因复合体，其编码基因位于人类第6号染色体短臂6P21.31区域，全长4 000 kb，以糖蛋白的形式在大多数有核细胞的膜表面表达。HLA按编码分子的特性不同可分为HLA-I、II、III类基因，HLA-B属于经典HLA-I类基因，含有1-7个外显子。HLA多态性形成的机制主要是碱基突变、链间转换以及基因重组^[14]。本例发现的新等位基因，是在HLA-B第3外显子发生两个碱基突变，并导致相应的氨基酸发生改变。已经证实HLA-I类基因的第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，其中α1、α2两个结构域位于分子的顶部，共同组成抗原肽结合区，是分子的可变区和抗原肽识别的部位^[15]。因此α1、α2结构域内氨基酸的替换可能会影响到抗原结合的特性，产生不同的免疫应答反应。但由于当时未得到捐献者的新鲜血液样本，未进行该新基因的抗原免疫性检测。
本例先证者样本是通过PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型时发现HLA-B分型中出现探针反应格局异常，真正的阴性反应被提示为假阴性，由此怀疑有新基因存在的可能，并最后经基因测序分析后证实为新的等位基因。序列特异性寡核苷酸探针实验的原理是采用一套标记有两种不同比例的荧光素的微珠，在不同的微珠上标记不同的探针，与标记有生物素扩增后的样本杂交，做荧光染色，应用基于Luminex的流式微珠检测仪由两种不同的激光分别检测微珠本身的荧光强度和杂交后DNA上标记的荧光强度，通过对所有微珠的信号的组合，借助专用软件来判断样本DNA的HLA基因型[16-18]。PCR-序列特异性寡核苷酸探针方法是用已知的基因序列来标记探针，但当样本为未知序列的新等位基因时，就会在与探针进行扩增和杂交反应中出现一些模棱两可的分型结果，表现为按照探针分型格局判断软件可能出现假阴性或假阳性的异常提示，或者不同方法结果的不一致等。本研究中33号探针反应格局出现异常提示，并非是33号探针本身的缺陷，而是因为该样本是一个HLA-B*55的新等位基因，与33号探针上标记的与HLA-B*55相关的所有已知基因序列是有差异的，因此出现了真正的阴性反应，但软件中仅有已知的基因分型结果，对于未知的基因序列只能提示为假阴性，才能判断出样本的HLA基因分型结果。这在常规的分型工作中应引起实验人员的高度重视，仔细分析并重复试验，以避免遗漏新等位基因或稀有基因等。
SBT目前作为HLA基因分型的金标准^[19-24]，已广泛应用于HLA组织配型实验室，因为SBT能够直接从碱基水平得到HLA的等位基因序列，得到高分辨结果，从而明显提高HLA分型的准确性。然而当遇到杂合子时，PCR产物的测序就有可能给不出确切的单链结果，无法确定新的变异基因到底位于哪一条DNA链上。以往的国内文献采用的办法多是以基因克隆方法区分杂合子^[25-27]，本实验室之前也曾采用此方法，但其方法操作繁琐，费时费力。本文采用了在PCR产物双链测序后再加做组特异性引物测序的方法，在B*07、B*55两个基因的内含子中寻找单核苷酸突变点设计引物分别扩增，这样使PCR产物的双链中只含有单一的目的基因片段，进而对其单链进行测序，确定了新等位基因的序列。组特异性引物测序的方法是目前国际上进行单链测序最先进最便捷的方法，结果可靠，用该方法得到的序列能够被国际基因数据库(GenBank)和WHO所接纳和认可。
目前国际上已检出HLA-B*55等位基因90个(IMGT/ HLA Release 3.19, 2015-01)。HLA-B*55在中国南方汉族的基因频率为3.36%，北方汉族为2.15%^[28]，西北汉族为2.67%^[29]，在辽宁人群中为1.89%^[30]。因辽宁是中国满族的发源地，由于地理位置和历史进程的特殊性，经历了群体漂移，形成了汉族、汉化为主的满族和蒙古族、回族等多民族混居的分布特点，因而导致HLA基因频率具有本地区的独特性。新等位基因HLA-B*55:46的基因频率极低，但该先证者的新等位基因是自身发生基因突变而产生还是由亲代遗传而来，还需下一步进行家系调查等遗传学方面的分析。
HLA抗原具有高度遗传多态性和异质性，除了参与免疫排斥反应外，在机体免疫应答的启动和免疫调节中也发挥重要作用，因此HLA与疾病相关性研究近年来也倍受关注。山东地区汉族人乙肝患者中HLA-B55基因阳性率明显高于山东地区健康汉族人的基因携带率(P < 0.05)，提示HLA-B55基因表型与山东地区乙肝慢性化相关^[31]。肖露露等^[32]在对219例慢性肾小球肾炎尿毒症患者和406例健康人群进行HLA免疫基因的频率、单倍型频率分析和疾病关联研究。结果显示在疾病组中包括B55在内的7个HLA基因频率显著升高，是最终导致肾功能衰竭的风险因素，其中B55等3个基因为国内外相关研究中首次报道，可能是患者群特有的地区性风险因子。
本实验应用目前国际上先进的基因测序方法，序列分析并确认了1例中国人的HLA新等位基因，为国际上首次发现，得到WHO命名。HLA新等位基因的发现，不仅给HLA家族增加了新成员，增加了HLA的多态性，也为研究本民族或本地区优势基因的起点、或消失基因的消失点找到了突破点，更重要的是增加了HLA配型的准确率，最大限度的保证了移植的成功率，为需要移植的患者带来了帮助，对提高组织器官移植成功率、人类群体遗传学研究、亲子鉴定和个体识别、个体对某些疾病的易感性分析等都具有重要的意义^[33]。

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

Sequence analysis and identification of a novel allele, HLA-B*55:46

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