内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后的迁移、归巢与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.005

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 2981-2985.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.005

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内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后的迁移、归巢与分化

何晓青¹，林育辉¹，黄淑玲¹，戴文军¹，许耘红¹，陈友权¹，陈晞明¹，陈敏生²

¹广州医科大学附属第三医院心内科，广东省广州市 510150；²南方医科大学，广东省广州市 510150

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 通讯作者：陈敏生，教授，博士生导师，南方医科大学，广东省广州市 510150
作者简介:何晓青，男，1979年生，广东省汕头市人，汉族，2006年广州医科大学毕业，硕士，主治医师，副教授，主要从事心血管疾病发生机制的相关研究。
基金资助:
广东省医学科研基金立项课题(A2012266)

Migration, homing and differentiation of endogenous bone marrow mesenchymal stem cells after myocardial infarction

He Xiao-qing¹, Lin Yu-hui¹, Huang Shu-ling¹, Dai Wen-jun¹, Xu Yun-hong¹, Chen You-quan¹, Chen Xi-ming¹, Chen Min-sheng²

¹Department of Cardiology, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China;²Southern Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Corresponding author: Chen Min-sheng, Professor, Doctoral supervisor, Southern Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:He Xiao-qing, Master, Attending physician, Associate professor, Department of Cardiology, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
Funding: the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. A2012266

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前的大多数研究主要集中在移植外源干细胞来源的心肌细胞对受损心肌进行修复与再生，而有关内源干细胞迁移、归巢及分化的研究比较少。
目的：观察内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后迁移、归巢以及分化情况。
方法：成年雌性C57BL/6小鼠随机分为2组：心肌梗死组(n=4)小鼠建立骨髓重建模型，于骨髓重建4周后行冠状动脉左前降支结扎术建立急性心肌梗死模型，1周后处死；对照组(n=3)小鼠进行单纯骨髓重建，于骨髓重建4周后处死。取心脏组织，采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin Ⅰ的表达，观察心肌梗死后表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞在心肌组织中的分布、分化情况。
结果与结论：骨髓重建小鼠心肌梗死组与对照组均可见到发绿色荧光的骨髓间充质干细胞，心肌梗死组骨髓间充质干细胞数量比对照组明显增多。两组切片均可见部分骨髓间充质干细胞呈GFP、Troponin Ⅰ和PI三阳性，心肌梗死组三阳性的细胞比对照组明显增多，表明心肌梗死后内源骨髓间充质干细胞能迁移、归巢到受损的心肌组织并获得心肌分化表型。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓重建, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 分化, 迁移, 归巢

Abstract:

BACKGROUND: Most of studies have focused on the transplantation and regeneration of exogenous stem cells-derived myocardial cells after myocardial infarction, but relatively few studies address the migration, homing and differentiation of endogenous stem cells.
OBJECTIVE: To observe the migration, homing and differentiation of endogenous bone marrow mesenchymal stem cells after myocardial infarction.
METHODS: Adult female C57BL/6 mice were randomized into two groups: myocardial infarction group (n=4), in which, the left anterior descending branch of the coronary artery was ligated to establish acute myocardial infarction models at 4 weeks after bone marrow remodeling, and 1 week later, the model mice were sacrificed; control group (n=3), in which, the mice were subject to bone marrow remodeling and then sacrificed after 4 weeks. Heart tissues were extracted from two groups followed by immunofluorescent detection of Troponin I expression, and the distribution and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells positive for green fluorescent protein after myocardial infarction were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: After histological and immunohistochemical examination, bone marrow
mesenchymal stem cells positive for green fluorescent protein were observed in both myocardial infarction group and control group, while more positive cells were seen in the myocardial infarction group. Some bone marrow mesenchymal stem cells in both two groups were positive for green fluorescent protein, Troponin I and PI. However, more triple-positive cells were observed in the myocardial infarction group compared to the control group. Endogenous bone marrow mesenchymal stem cells can migrate, home to the damage myocardium and acquire cardiogenic phenotype after myocardial infarction.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Myocardial Infarction, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

何晓青，林育辉，黄淑玲，戴文军，许耘红，陈友权，陈晞明，陈敏生. 内源骨髓间充质干细胞在心肌梗死后的迁移、归巢与分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2981-2985.

He Xiao-qing, Lin Yu-hui, Huang Shu-ling, Dai Wen-jun, Xu Yun-hong, Chen You-quan, Chen Xi-ming, Chen Min-sheng. Migration, homing and differentiation of endogenous bone marrow mesenchymal stem cells after myocardial infarction [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2981-2985.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2012年1月至2013年12月在广州医科大学中心实验室完成。
材料：
实验动物：成年GFP转基因C57BL/6小鼠4只，8-12周龄，雄性，体质量25 g左右；成年C57BL/6小鼠10只，8-12周龄，雌性，体质量23 g左右，均由赛业(广州)生物科技有限公司提供。

心肌梗死后内源性骨髓间充质干细胞迁移、归巢与分化实验所用主要试剂：
试剂	来源
IMDM干粉培养基、DMEM/F12培养液、胎牛血清、胰酶	美国Gibco公司
碱性成纤维细胞生长因子、α-sarcomeric actinin单克隆抗体、Hoechst	美国Sigma公司
小鼠抗大鼠cTnI单克隆抗体	美国Cedarlane公司
MEF-2C单克隆抗体	美国Santa Cruz公司
Alexa fluor 555山羊抗小鼠IgG	美国Molecular Probes公司

实验方法：
表达绿色荧光蛋白骨髓间充质干细胞的体外分离：取成年雄性GFP转基因C57BL/6小鼠4只，断颈处死后，体积分数为75%乙醇消毒皮肤，无菌条件下自髋关节离断双侧股骨及胫骨(此步骤以后的各个步骤均应注意避光)。将分离的股骨及胫骨转入超净工作台，剔除周围肌肉组织，置入培养皿用PBS漂洗两三次，剪去骨骺端，取股骨及胫骨中段。用18号针头分别插入股骨及胫骨两端，各穿一小孔，然后用注射器吸取3-5 mL含体积分数为10%胎牛血清的IMDM培养液反复冲洗骨髓腔。收集冲洗液，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的IMDM培养液，吸管反复吹打，制成单细胞悬液。
实验分组：10只成年雌性C57BL/6小鼠随机分为2组：心肌梗死组(n=5)：小鼠经骨髓重建后4周，行左冠状动脉前降支结扎术建立心肌梗死模型，术后7 d处死，观察心肌组织中Troponin Ⅰ的表达；对照组(n=5)：行单纯骨髓重建术，术后4周处死，观察心肌组织中Troponin Ⅰ的表达。
小鼠骨髓重建模型的建立：对成年雌性C57BL/6小鼠进行10.0 Gy致死剂量的一次性全身立式照射放疗，辐射后3 h，将10×10⁶个雄性C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉注射入体内进行骨髓移植。术前及术后观察受体鼠的精神状况、饮食、体质量、有无腹泻、便血、脱毛、皮肤溃疡、抽搐、耳廓脚掌红斑等。
小鼠心肌梗死模型的建立：①接受骨髓移植后4周，将存活的小鼠予3%-4%的异氟烷吸入麻醉。②连接小动物呼吸机(Model 683，美国harvard公司)，调整呼吸频率为70-100次/min，呼︰吸为1︰1.5，并调整潮气量。③待呼吸稳定后直接行气管插管，呼吸机通气，调整异氟烷浓度为2%-2.5%。④右侧卧位固定于动物手术台上，左侧胸部脱毛，常规消毒铺巾；从左胸第4肋间做1.5 cm横形切口，开胸暴露心脏。⑤剪开心包，用无菌棉签轻轻右翻心脏，可清楚看到左心耳，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下 2-4 mm处，用7-0无损伤缝线结扎冠状动脉左前降支，造成左室前壁心肌梗死。⑥观察左室前壁颜色变深，在ECG I、aVL导联上出现ST段上抬0.2 mV以上伴对应导联改变作为成功建立小鼠急性心肌梗死模型的标志。⑦5-0号丝线迅速逐层关胸。⑧观察小鼠呼吸情况，待小鼠自主呼吸恢复撤去呼吸机，拔出气管插管，注意保温，动物苏醒后放入动物饲养笼继续观察1 h。⑨术后腹腔注射青霉素抗感染。
免疫组织化学检查(抗TroponinⅠ免疫荧光染色)及结果分析：
标本制备：术后存活2周以上并满足实验要求的小鼠有7只，心肌梗死组4只，于心肌梗死后7 d处死动物；对照组3只，于骨髓移植后4周处死动物。动物处死后，开胸取出心脏，冰盐水冲洗，将心脏组织置于10%PFA浸泡固定24 h后，体积分数为10%-30%乙醇梯度脱水3次，每次1 h；将心脏组织块平放于OCT化合物中包埋，置于液氮液平面上，待组织完全冻结后，立即送病理科行冰冻切片；心肌组织块多部位切片，同一部位以5 μm厚度连续切片3-5张，-80 ℃保存。
染色程序：取心脏组织切片，用PBS清洗2遍后， -20 ℃丙酮固定10 min，PBS/0.5%BSA缓冲液室温下冲洗3遍(以下各步骤均应注意避光)，0.2%TritonX-100浸泡10 min后，PBS/0.5%BSA缓冲液室温下冲洗2遍；体积分数为5%的正常山羊血清封闭，分别加入小鼠抗大鼠Troponin Ⅰ心肌特异性抗体做为第一抗体(抗体滴度为 1︰400)，室温下孵育 2 h，PBS/0.5%BSA缓冲液冲洗3遍，体积分数为5%的正常山羊血清室温下封闭15 min后，PBS/0.5%BSA缓冲液冲洗1遍，分别滴加1︰50稀释的AMCA共轭亲和纯化的山羊抗小鼠IgG二抗，室温下避光孵育1 h，PI荧光标记液染核，透明中性树胶封固镜检。染色结果采用共聚焦显微镜(Fluo View-1000，日本Olympus)进行观察。
结果分析：实验采用3种荧光标记，表达绿色荧光蛋白骨髓间充质干细胞本身带有绿色荧光蛋白标记，PI标记细胞核，二抗采用AMCA共轭亲和纯化的山羊抗小鼠IgG进行标记。绿色荧光蛋白在蓝色荧光激发下呈现绿色，PI在绿色荧光激发下呈现红色，AMCA在紫外光线激发下呈现蓝色，分别进行照相，将同一视野的3种图片重叠起来观察。如果3种颜色都呈阳性，表明归巢的表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞可获得心肌分化表型；如果只有绿色和红色呈现阳性，表明是归巢的表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞。
主要观察指标：①心肌梗死小鼠生命体征、心电图的变化。②心肌组织中Troponin Ⅰ的表达。

讨论

长期以来心肌细胞都被认为是不能发生损伤修复的，但是近年来随着干细胞移植的兴起，这一观念发生了改变，许多研究已证实心肌可通过多种途径发生再生和修复，缺血心肌再生和修复已成为心血管病研究领域的一大热点^[2-7]。心肌梗死后大量心肌细胞凋亡或坏死，仅有少量心肌细胞保持了增殖和再生的能力，需要新的有功能的心肌细胞取代凋亡的细胞以维持心脏的功能，这可通过刺激内源的干细胞迁移并分化，还可通过移植外源干细胞来源的心肌细胞^[8-10]。目前的研究主要集中在移植外源干细胞来源的心肌细胞对受损的心肌进行修复与再生，而对内源干细胞的迁移、归巢及分化的研究比较少。
最近，一种骨髓重建模型被开发出来并不断完善，但是其价格昂贵，尤其是放疗后体质量和抵抗力明显下降，死亡率高，限制了其应用的推广^[11-13]。尽管如此，该模型为研究自体骨髓来源或是血液来源的干细胞在心肌梗死后心肌再生中的作用提供了一个非常好的平台，具有较高的应用价值(图2)。国内也有研究表明骨髓间充质干细胞对极重度放射损伤小鼠造血功能重建有一定的促进作用^[14-17]。目前在国内尚未见小鼠骨髓重建模型在心肌梗死基础研究中应用的报道。本研究采用该方法成功建立了小鼠骨髓重建模型[^11-13]，并在此基础上成功建立了小鼠心肌梗死模型。研究发现心肌梗死后骨髓间充质干细胞能迁移、归巢到受损的心肌组织并获得心肌分化表型。大部分绿色荧光蛋白阳性细胞出现在梗死周围的区域，表明心肌的再生主要发生在受损的心肌组织及其周围的区域。骨髓间充质干细胞具有经血液循环归巢至损伤心肌的能力，也就是当组织损伤时发出信号，使移植细胞靶向性地归巢至心肌损伤部位，这是应用静脉途径行细胞移植的重要理论依据^[18]。研究结果表明，梗死心肌部位有较多绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞归巢，而远离梗死区的正常心肌和正常小鼠心肌组织中均只发现少量带绿色荧光蛋白荧光的骨髓间充质干细胞，进一步证实干细胞归巢需要损伤信号。Chiu^[17]发现在瘢痕己经形成的陈旧性心肌梗死，该归巢机制减弱或消失。这一结果和人们的设想一致，即归巢信号与组织损伤部位的急性炎症反应有关。在心肌梗死愈合期，瘢痕已形成，炎症反应消退，循环中供体细胞失去靶向性。最近许多学者的研究也证明干细胞具有从骨髓向受损心肌迁移、整合到受损心肌组织里面并向心肌细胞分化的能力^[9，18-19]。结合上述研究结果，作者认为经静脉途径移植骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死具有可行性及较高的安全性，经静脉途径移植骨髓来源干细胞治疗心脏病患者是一项无创性、可重复进行的临床治疗策略，尤其对于弥漫性心肌病变具有较高的应用价值。
然而，骨髓间充质干细胞在心肌组织里向心肌细胞分化的具体机制尚未清楚，最近关于骨髓间充质干细胞分化机制的研究已经成为学术界讨论研究的热点。与先前提出的转分化的观点不同，许多学者提出移植细胞与心肌细胞的融合才是移植细胞获得心肌分化表型的主要机制^[20-22]，这就使干细胞向心肌细胞分化的机制变得更加复杂。体外共培养实验证明了细胞融合与转分化在骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的机制上共同起作用，但本实验只证明了体内来源的骨髓间充质干细胞可向心肌细胞分化，未能阐明其具体作用机制，其机制有待以后进一步研究。尽管大家对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的机制存在异议，但是在骨髓间充质干细胞可成为干细胞治疗的优良供体及可改善受损心脏心功能的认识上，已基本达成共识，骨髓间充质干细胞应用于治疗心肌梗死表现出了巨大的潜能，具有广阔的应用前景。

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