自然沉降速度法分选骨髓间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：在前期研究低渗结合自然沉降分选兔骨髓间充质干细胞的基础上，以工程学关于颗粒流体力学为指导，求出兔骨髓间充质干细胞在培养液中的沉降速度。通过自然沉降速度法分选及鉴定细胞，建立一个简单易行的分离、纯化、增殖间充质干细胞的方法。
目的：探讨自然沉降法分选骨髓间充质干细胞的可行性。
方法：梯度密度离心法确定兔骨髓间充质干细胞的密度区间(ρ1)，扫描电镜测量出兔骨髓间充质干细胞的直径(d)，液体密度计测算出培养液的密度(ρ2)，黏度计测算出培养液的黏度(μ)，选择合适的公式计算出骨髓间充质干细胞的沉降速度(Vt)。以此沉降速度从兔的骨髓细胞中分选兔骨髓间充质干细胞，体外培养并观察其增殖能力、细胞纯度、细胞分化潜能，同时测定兔骨髓间充质干细胞克隆集落形成率，记录原代培养时间。
结果与结论：①通过电镜测量得出兔骨髓间充质干细胞的直径为(20.37±4.58) μm，进一步确定兔骨髓间充质干细胞在培养液中的沉降速度为50-55 mm/h。②通过自然速度沉降法可成功从兔骨髓组织中分选出骨髓间充质干细胞，分选出的骨髓间充质干细胞原代培养呈成纤维样集落生长，经诱导后具有成骨、成脂分化潜能。③与梯度密度离心法比较，自然速度沉降法分离出的间充质干细胞具有原代培养时间短，细胞集落形成率高的特点。④自然速度沉降法在间充质干细胞分选过程中不采取任何干预措施，也不添加任何分离介质，仅通过物理原理自然沉降，可能对细胞损伤小，使细胞原有的生物学特性得到保留。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 自然沉降, 骨髓间充质干细胞, 沉降速度, 细胞分选

Abstract:

BACKGROUND: In previous studies, it is satisfied to sorting bone marrow mesenchymal stem cells based on natural sedimentation combined with low permeation. Then, based on particle hydromechanics theory, the settling velocity of bone marrow mesenchymal stem cells in culture liquid is calculated. A simple and easy method of separation, purification and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells is established by natural sedimentation velocity.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of sorting bone marrow mesenchymal stem cells by natural sedimentation velocity method.
METHODS: The density interval of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (ρ1) was determined by density gradient centrifugation method. The diameter of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (d) was measured by scanning electron microscope. The density of culture liquid (ρ2) was measured by liquid density meter. The viscosity of the culture liquid (μ) was measured by viscosity meter. The settling velocity of bone marrow mesenchymal stem cells (Vt) was derived from the above four numerical values with the appropriate formula. Bone marrow mesenchymal stem cells were sorted from bone marrow tissue by natural sedimentation velocity method. Cell proliferation, purity and differentiation were observed. Meanwhile, the primary culture time of three
different cell sorting methods was recorded; the colony formation rate of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The diameter of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells was (20.37±4.58) μm, and the setting velocity of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in the culture liquid was 50-55 mm/h. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells could be successfully isolated from bone marrow tissue of rabbits by the natural sedimentation velocity method, which could be induced into osteoblasts and adipocytes. (3) The natural sedimentation velocity group cost less time than the other two density gradient centrifugation groups in the primary culture stage. The colony formation rate of the natural sedimentation velocity group was higher than that of the other two groups. (4) Natural sedimentation velocity method did not impose any intervention measures for sorting cells, which maybe maximally maintain cell viability and biological characteristics. The whole separation process was simple and safe, which may have little damage to the cells.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Separation

中图分类号:

R394.2

蔡金宏，林春博，杨渊. 自然沉降速度法分选骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2973-2980.

Cai Jin-hong, Lin Chun-bo, Yang Yuan. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by natural sedimentation velocity method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2973-2980.

图/表（结果） 5

2.1 密度梯度离心法培养原代细胞形态兔骨髓间充质干细胞原代培养后24 h光镜下观察，原代细胞呈圆形，大小较均一。48 h后全量更换培养液，去除悬浮细胞，可见少量杆状、梭形细胞。随着培养时间的延长，贴壁细胞逐渐铺开，呈放射状贴壁生长，直径大小不等。这些贴壁细胞逐渐形成集落，集落大小不一。细胞增殖迅速，集落之间相互靠进，最终细胞融合成单层，细胞梭形突起变长，呈漩涡状，见图1。 2.2 密度梯度离心法培养传代细胞形态兔骨髓间充质干细胞传代后，细胞生长速度明显加快，接种后6-8 h即可观察到细胞开始贴壁、铺展，细胞恢复长梭形。12 h后细胞基本完全贴壁，此时细胞不再成集落形态生长，而是均匀分布生长，细胞排列规则，形态较原代培养单一。培养三四天后即可见细胞达到80%融合，呈长梭形，鱼群状排列，见图2。 2.3 密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞成骨诱导能力加入成骨诱导剂后，实验组细胞增殖明显减慢，同时细胞形态也在发生变化，由长梭形向多角形转化，培养至第14天，可见多角形细胞明显增多并相互聚拢，钙结节逐渐形成。成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色，黑色钙结节清晰可见。碱性磷酸酶试剂盒染色后，细胞核呈紫蓝色，阳性细胞胞浆中出现棕褐色或咖啡色颗粒，见图3。对照组细胞培养至21 d时细胞形态变得扁平、宽大，增殖速度逐渐减慢，部分细胞脱落，染色结果阴性。

2.4 密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞成脂诱导能力加入成脂诱导剂后，细胞增殖明显减慢，同时细胞形态也在发生变化，培养至第7天时，细胞核回缩、细胞质减少，细小脂滴开始在胞质内形成；第14天时，可见脂滴变大，含有脂滴的细胞数目增多并相互聚拢形成集落，脂肪细胞分布于集落中心；第21天时，脂滴逐渐增多，行Red Oil染色后，显微镜下观察细胞核显示为淡蓝色，脂滴为橙红色，见图4。对照组细胞培养至21 d时细胞形态变得扁平、宽大，增殖速度逐渐减慢，部分细胞脱落，染色结果阴性。
2.5 兔骨髓间充质干细胞直径扫描电镜下观察第3代爬片间充质干细胞，并测得间充质干细胞直径为17-28 μm，采用SPSS16.0求得兔骨髓间充质干细胞的平均直径为(20.37±4.58) μm，见图5。
2.6 沉降速率的计算由1.067-1.070 g/mL的Percoll分选出的细胞形态学观察与间充质干细胞相似，并具有成骨、成脂分化潜能。因此采用1.067-1.070 g/mL作为兔骨髓间充质干细胞的密度区间(ρ1)，扫描电镜测量出兔骨髓间充质干细胞的直径d=(20.37±4.58) μm，液体密度计测算出培养液的密度ρ2=1.008 g/mL，黏度计测算出培养液的黏度μ=0.937 Pa.s。根据电镜的测量结果，d=(20.37±4.58) μm，细胞在装有培养液的离心管中做自然沉降运动时，由于培养液属于静止状态，并且不会因细胞的沉降运动产生漩涡及湍流，因此选择斯托克斯公式：Vt=d2*g*(ρ1-ρ2)/18*μ计算出兔骨髓间充质干细胞的沉降速度Vt=50-55 mm/h。因此自然沉降速度法中加入培养液液面高度为60 mm，待沉降30 min后由上至下小心吸取25-30 mm处的培养液接种。
2.7 自然沉降速度法原代骨髓间充质干细胞形态培养后24 h光镜下观察，原代细胞大小较均一，多呈圆形，其中可见部分较悬浮细胞体积稍大的圆形、椭圆形细胞，其核浆分界清楚，折光性强，核绝大多数为单核、圆形，位于细胞中央。48 h后全量更换培养液，将悬浮细胞去除后，可见部分细胞贴壁，形态多呈杆状、梭形。随着培养时间的延长，贴壁细胞数量增多，逐渐铺开，呈放射状贴壁生长，直径大小不等。细胞轮廓呈长梭形，少量细胞呈星形，胞浆均匀丰富，细胞核位置居中。这些贴壁细胞逐渐形成集落，集落大小不一，集落之间相互靠近，最终细胞融合成单层，细胞梭形突起变长，排列有明显方向性，呈漩涡状，见图6。
2.8 自然沉降速度法培养传代细胞形态传代后，细胞生长速度明显加快，接种后6-8 h即可观察到细胞开始贴壁、铺展，细胞恢复长梭形。12 h后细胞基本完全贴壁，此时细胞不再成集落形态生长，而是均匀分布生长，细胞排列规则，形态较原代培养单一。培养三四天后即可见细胞达到80%融合，呈长梭形，鱼群状排列，见图7。

2.9 自然沉降速度法培养骨髓间充质干细胞成骨诱导能力加入成骨诱导剂后，细胞增殖明显减慢，同时细胞形态也在发生变化，由长梭形向多角形转化，培养至第14天，可见多角形细胞明显增多并相互聚拢，钙结节逐渐形成。培养21 d，Von Kossa染色后黑色钙结节清晰可见。碱性磷酸酶试剂盒染色后，细胞核呈紫蓝色，阳性细胞胞浆中出现红色至红棕色颗粒，有些为棕褐色或咖啡色颗粒，见图8。对照组染色结果阴性。
2.10 自然沉降速度法培养骨髓间充质干细胞成脂诱导能力加入成脂诱导剂后，细胞增殖明显减慢，同时细胞形态也在发生变化，培养至第7天时，细胞核回缩、细胞质减少，细小脂滴开始在胞质内形成；第14天时，可见脂滴变大，含有脂滴的细胞数目增多并相互聚拢形成集落，脂肪细胞分布于集落中心；第21天时，脂滴逐渐增多，行Red Oil染色后，显微镜下观察细胞核显示为淡蓝色，脂滴为橙红色，见图9。对照组染色结果阴性。
2.11 骨髓间充质干细胞生长曲线以时间为横坐标，吸光度值的平均值为纵坐标绘制细胞生长曲线。传代后的前 4 d，细胞的增殖速度并无明显差异。4 d后，细胞开始进入对数增殖期，由吸光度值的观察可知自然速度沉降法组活细胞数量更多。可推断自然沉降速度法分选的细胞具有更强增殖活力，至第10天，细胞增殖速度减慢，进入平台期，见图10。

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引言

目前常用的分选兔骨髓间充质干细胞的方法有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、组织消化法等，每种方法各有优缺点。全骨髓贴壁法得到的原代细胞数量多，但是细胞成分杂，利用兔骨髓间充质干细胞贴壁生长的特点，通过多次换液去除漂浮生长的血液杂质细胞，达到纯化目的。密度梯度离心法加入对细胞无害的介质分离细胞，原代细胞纯度较高，但由于高速离心，难免影响到细胞的活力，因此原代细胞生长较慢，不能短期实现干细胞的大量扩增。免疫磁珠法利用细胞表面特异性标志物进行分离，得到的原代细胞纯度高，但是实验设备昂贵，且如果使用单一特异性标记物则会造成兔骨髓间充质干细胞其他亚群的丢失，若同时使用多种特异性标记则显著提高成本，不适用于一般的实验研究。组织消化法能短时间从活体上获得大量活细胞，且细胞特性与体内接近并能反映生长特性，不过其缺点也比较明显：消化法不但步骤繁琐、易污染，若操作者对消化时间把握不当，直接影响原代获得的间充质干细胞的纯度及其生物学特性，并且破坏细胞结构、干扰细胞增殖及分化，甚至得到异种的细胞群。
课题组前期采用低渗结合细胞自然沉降成功分选出兔骨髓间充质干细胞，骨髓组织中未添加任何介质，也不采用任何干预措施，仅根据重力原理物理沉降，最大程度保持细胞的完整及其生物学特性[1]。在此科研基础上结合颗粒流体力学，提出假说：在一定的颗粒流体系统中，如果液体(培养液)的密度、阻力系数为定值，则不同大小、密度的细胞颗粒具有不同的沉降速度，可以通过不同的沉降速度将原代间充质干细胞分选出来，即探讨兔骨髓间充质干细胞在培养液中自然沉降的机制，通过兔骨髓间充质干细胞在培养液中与其他细胞具有不同沉降速度这一特性，为细胞自然沉降法分选干细胞研究提供理论依据。此法目前国内外文献未见报道，有望揭示并为建立安全分选干细胞的技术开拓新的方向。

材料方法

设计：完全随机设计。
时间及地点：实验于2014年3月至2015年3月在广西医科大学组织学及胚胎学实验室完成。
材料：
实验动物：出生一两天的新西兰大白兔27只，雌雄不限，体质量50 g左右，随机分成3组，分别标记为梯度密度离心法1.067 g/mL组，梯度密度离心法1.070 g/mL组，自然沉降速度法组。实验动物均由广西医科大学医学科学实验中心提供。动物实验方案经广西医科大学医学伦理委员会审查。

自然沉降速度法分选兔骨髓间充质干细胞所用主要仪器：
仪器	来源
CO₂培养箱	日本三洋公司
高速离心机	美国Epperdorf公司
超净工作台	苏净集团安泰公司
倒置相差显微镜	OLYMPUS
液体密度计DH-300L	北京仪特诺公司
SYP型水浴恒温箱	南京桑力电子设备厂
细胞培养瓶等实验耗材	美国Corning公司

自然沉降速度法分选兔骨髓间充质干细胞所用主要试剂：
试剂	来源
L-DMEM培养液、胎牛血清	Hyclone
β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C、胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤	Sigma
Von Kossa试剂盒	上海舜百生物科技
Red oil试剂盒、AKP试剂盒	南京建成

实验方法：
原代骨髓间充干细胞的分离及培养：颈椎脱臼法处死新生新西兰大白兔，置于体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡10 min。无菌条件下取出双侧股骨，剔除股骨附属软组织，样本浸泡于无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)中移至超净工作台内，中间剪断长骨干，暴露骨髓腔，以无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)反复冲洗髓腔至骨头变白，将冲洗液收集于无菌培养皿中，移液至离心管，以1 000 r/min×5 min离心，弃上清，加入少量无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)重悬；重新取一支15 mL离心管，加入10 mL Percoll(密度梯度区间为1.064-1.073 g/mL，密度间隔为0.001 g/mL，液体密度计调节密度)，同时将重悬后的细胞悬液沿离心管壁缓慢滴入，置于高速离心机于3 000 r/min离心25 min，离心后，吸管由上至下小心吸取1.067 g/mL密度层及1.070 g/mL密度层内液体分别移至新的离心管内，分别加入2.0-3.0 mL无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)重悬，再次置入离心机以1 000 r/min离心5 min后，弃上清，加入2.0-3.0 mL细胞培养液(含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的L-DMEM)重悬。
骨髓间充质干细胞的纯化与扩增：于种瓶48 h后首次全量更换新鲜培养液以去除悬浮细胞，以后每隔2 d待培养液变色时及时半量换液。每日观察细胞生长情况，在原代细胞达到70%-80%融合时传代。移除培养液，加入胰蛋白酶+0.02% EDTA 1.0-2.0 mL于培养瓶中铺满瓶底消化细胞，倒置显微镜下观察到大多数细胞呈圆形、漂浮时，加入3倍消化液体积的细胞培养液(含体积分数为15%胎牛血清， 100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的L-DMEM)轻轻吹打终止消化，将消化后的细胞悬液移入离心管，以1 000 r /min，离心5 min，弃上清，加入细胞培养液(含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的L-DMEM)重悬，按1︰2比例传代，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2培养箱中培养。
兔骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制：取生长良好的第3代细胞，消化制备成单细胞悬液、计数，以每孔1×104个接种于96孔培养板，每板接种60孔。从第2天起至第12天，每2天选6孔测定吸光度值。每次在收获前4 h，每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT，测定前吸干上清液，加入150 μL二甲基亚砜。在酶联免疫检测仪检测490 nm处每孔的吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
成骨分化诱导及检测：取第3代生长稳定的细胞，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度1.0×107 L-1接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内以制备爬片。每孔加入1.5 mL左右的培养液，48 h后全量换液，待细胞贴壁生长后，实验组加入成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM，10-7 mmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L 维生素C)，观察细胞的生长情况及细胞形态的变化，21 d后行Von Kossa染色及碱性磷酸酶染色检测，镜下观察细胞形态的变化和生长情况。对照组只加细胞培养液培养。
成脂分化诱导及检测：取第3代生长稳定的细胞，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度至1.0×107 L-1接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内以制备爬片。每孔加入1.5 mL左右的培养液，48 h后全量换液，待细胞贴壁生长后，实验组加入成脂肪诱导液(含1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素、体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM)，观察细胞的生长情况及细胞形态的变化，21 d后行Red Oil染色检测，镜下观察细胞形态变化和生长情况。对照组只加细胞培养液培养。
电镜测量兔骨髓间充质干细胞直径：经上述步骤确定提取细胞为间充质干细胞后，取第3代贴壁间充质干细胞，移除培养液，加入消化液(胰蛋白酶+0.02%EDTA)1.0-2.0 mL于培养瓶中铺满瓶底，倒置显微镜下观察到大多数细胞皱缩、开始脱离瓶底漂浮时，加入3倍消化液体积的细胞培养液(含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的L-DMEM)轻轻吹打终止消化，将消化后的细胞悬液移入离心管内离心(1 000 r /min，5 min)，弃上清，加入细胞培养液重悬，将细胞悬液接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内以制备爬片，每日观察细胞生长情况，待细胞贴壁生长后，弃培养液，加入戊二醛固定，置于 4 ℃冰箱过夜。生物标本固定后，0.1 mol/L PPS清洗3次，系列梯度乙醇(体积分数为50%，70%，80%，90%，100%)脱水3次，六甲基二硅胺烷干燥3次后抽真空，黏座，IB3离子溅射仪喷镀后放入扫描电镜观察。
沉降速率的计算：以工程学关于颗粒流体力学为指导，假设单个细胞相当于单个的颗粒，细胞受重力作用会在培养液中沉降，此时细胞受到3个力的作用，即：重力，浮力与阻力。假设细胞的密度为ρ1，直径为d，培养液的密度为ρ2，阻力系数为ζ，A为颗粒的迎流投影面积，则：重力Fg=π*d3*ρ1*g/6；浮力Fb=π*d3*ρ2*g/6；阻力Fd=ζ*A*ρ2*μ2/2，对于近似球形的细胞，其迎流投影面积A=π*d2/4。由牛顿第二定律可知，细胞在培养液中沉降，其受到重力、浮力、阻力的合力等于细胞的质量与其加速度α的乘积，Fg-Fb-Fd=mα(公式1)。随着细胞沉降速度的增加，同时受到的阻力也在增加，在某一时刻，阻力、浮力与重力达到平衡后，即当α=0，V=Vt时，细胞开始做匀速沉降运动。将重力、浮力及阻力代入公式1后简化得Vt=√{4*d*g*(ρ1-ρ2)/3*ρ2*ζ}(公式2)。通过因次分析可知，ζ是颗粒与流体相对运动时雷诺数Ret的函数，其中Ret=d*Vt*ρ2/μ，μ为液体的黏度。ζ与Ret的关系由实验测定可描成相应的曲线，对于近似球形细胞的阻力系数曲线(Φs=1的曲线)，按Ret值可分成3个区，各区内的曲线可分别用相应的关系式表达：
滞流区或托斯克斯定律区(stokes)(10-4 < Ret < 1)，ζ=24/Ret，代入公式2简化得出斯托克斯公式：Vt=d2*g* (ρ1-ρ2)/18*μ；大致上1 μm < d < 100 μm。
过渡区或艾伦定律区(Allen)(1 < Ret < 103)，ζ=18.5/ Ret0.6，代入公式2简化得出艾伦公式：Vt= 0.27√{d*g* Ret0.6 *(ρ1-ρ2)/ ρ2}；大致上100 μm< d <1 000 μm。
湍流区或牛顿定律区(Newton)(Ret > 103)，ζ=0.44，代入公式2简化得出牛顿公式：Vt=1.74√{d*g*(ρ1-ρ2)/ ρ2}；大致上d >1 000 μm。
根据上述沉降速度的公式只要测算出细胞的直径、细胞和培养液的密度、培养液的黏度，就能算出细胞在培养液的沉降速度。于密度梯度离心法测算出兔骨髓间充质干细胞的具体密度值或密度区间(ρ1)，电镜测量出兔骨髓间充质干细胞的直径(d)，液体密度计测算出培养液的密度(ρ2)，黏度计测算出培养液的黏度(μ)。代入相应公式测算出的兔骨髓间充质干细胞在培养液的沉降速度，进一步确定自然沉降时间。
自然沉降速度法分选兔骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼法处死新生新西兰大白兔，置于体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡10 min。无菌条件下取出双侧股骨，剔除股骨附属软组织，样本浸泡于无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)中移至超净工作台内，中间剪断长骨干，暴露骨髓腔，以无血清L-DMEM(含青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)反复冲洗髓腔至骨头变白。收集冲洗液，1 000 r/min离心3 min；弃上清，加入三蒸水，短暂重悬细胞后加入10倍PBS终止破膜，900 r/min离心3 min；加入 1 mL细胞培养液(含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的L-DMEM)重悬细胞，然后将细胞悬液沿离心管壁缓慢滴入已加入细胞培养液的离心管，前后加入离心管的培养液液面高度参照计算出的干细胞沉降速度确定，待干细胞在培养液中自然沉降至预先设定的深度时，采用离心管由上至下吸取相同长度的培养液，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。细胞培养与扩增、生长曲线的绘制、成骨及成脂诱导与前面所述方法相同。
兔骨髓间充质干细胞克隆集落形成率的测定：选取生长良好的传代细胞，0.25%胰蛋白酶消化后离心，培养基重悬调整细胞密度以100个/孔的密度接种于6孔板中，每3 d换液，待细胞集落长出后，集落长出后，倒置相差显微镜下观察，超过50个细胞计为1个集落，计算集落形成率。集落形成率(CFE)=(集落数目/接种细胞数目)×100%。
记录各组原代培养时间：3种方法分离培养的细胞于第4天在倒置相差显微镜低倍视野下观察。分别记录各瓶细胞生长达到70%-80%融合后首次传代的时间，如于16 d之内无法达到70%-80%融合即视为不合格。
主要观察指标：①梯度密度离心法、自然沉降速度法分选出的间充质干细胞原代培养及传代培养的光镜形态。②梯度密度离心法、自然沉降速度法分选出的间充质干细胞经过成骨成脂诱导剂诱导后的光镜形态以及碱性磷酸酶染色、Von Kassa染色、Red Oil染色结果。③扫描电镜下测量梯度密度离心法、自然沉降速度法分选出的间充质干细胞直径。④梯度密度离心法及自然沉降速度法分选出的第3代间充质干细胞的生长曲线。⑤梯度密度离心法及自然沉降速度法分选出的细胞生长集落形成率。⑥梯度密度离心法及自然沉降速度法分选出的原代细胞培养时间。

讨论

大量研究证明，间充质干细胞在体内来源广泛、易于分离培养，同时可在体外大量增殖并且保持高度未分化状态，在细胞再生医学及组织工程方面有巨大的潜能[2-4]。但是干细胞如果要进入临床，必须要保证其在体外分选时不受多种因素的影响而异常分化。人类的骨髓间充质干细胞比例太小^[5]，并随年龄增长逐渐减少，数量上难以达到细胞工程的要求，因此建立一个简单易行的方法安全分选干细胞是非常重要的。
目前比较成熟的间充质干细胞的分选方法有全骨髓贴壁法^[6]、梯度密度离心法^[7]、组织块消化培养法^[8]。但各种方法都有其不足^[9-12]：全骨髓贴壁法需通过胰蛋白酶消化细胞，经过多次传代达到纯化细胞的目的。梯度密度离心法需要加入特定的分离介质才能分离出纯度较高干细胞。组织消化法需采用组织消化酶从组织中获得目的细胞，但该方法有获得异种细胞群的可能性。随着对间充质干表面抗原的认识，免疫磁珠分离等技术都被运用于间充质干细胞的分离和纯化^[13]。然而，应用免疫磁珠法分离的细胞增殖缓慢、高花费和高技术难度使得这些技术的推广受限。以上分选方法均加入外源性干预介质对干细胞进行分选，这些方法由于所加入的介质对人体危害的不确定性大多仅应用于基础实验。
本实验设计的自然沉降速度分选法以工程学关于颗粒流体力学为指导^[14-15]，根据颗粒沉降速率公式计算出间充质干细胞的沉降速率，进一步确定沉降时间，采用细胞自然沉降速度法分选兔骨髓间充质干细胞。自然沉降速度法并未添加任何分离介质，同时不采用任何干预措施，仅根据重力原理物理沉降，避免了加入外源性介质对人体危害的不确定性。同时，该方法从原代取材开始尽可能提高兔骨髓间充质干细胞的纯度，相对于全骨髓贴壁法，原代换液次数少，使细胞处于一个相对稳定的生长环境，最大程度的维持细胞原有生物学特性。同时整体操作步骤简便，显著减少细胞污染的概率。沉降速度公式中需求得兔骨髓间充质干细胞的具体密度值或密度区间(ρ1)，扫描电镜测量出兔骨髓间充质干细胞的直径(d)，液体密度计测算出培养液的密度(ρ2)，黏度计测算出培养液的黏度(μ)四个数值。而Rosca等^[16]研究表明，采用1.067-1.070 g/mL介质分离出的兔骨髓间充质干细胞数量较多，因此实验采用相同密度区间的分离介质从骨髓组织中分选并鉴定所得到的细胞，在确定其具有间充质干细胞的相关特性后以1.067- 1.070 g/mL作为兔骨髓间充质干细胞的密度区间(ρ1)。所得到的间充质干细胞直径(d)由电镜测得，测量中发现间充质干细胞并不是均一等大的细胞群落，可能是由于间充质干细胞由多个亚群组成，每个亚群的细胞大小存在差异，因此最终取所测的细胞直径的平均数作为间充质干细胞的直径，为(20.37±4.58) μm。培养液的密度、黏度均由仪器确定，根据细胞直径的范围，选择斯托克斯公式计算兔骨髓间充质干细胞的沉降速度Vt=50-55 mm/h，并确定自然沉降时间为30 min，又因离心前后加入的培养液的高度在5.0-6.0 cm之间^[14-15]，待30 min后间充质干细胞可能沉降到离心管中下部，因此可以成功分离兔骨髓间充质干细胞。本实验对分选出来的兔骨髓间充质干细胞进行体外培养并传代扩增，光镜下观察原代细胞呈成纤维样细胞集落放射样生长，传代后细胞形态均一，呈鱼群状排列。同时，细胞生长曲线提示细胞的体外增殖过程经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，说明所分离出的间充质干细胞增殖分裂能力十分活跃。此外，对得到细胞进行成骨、成脂诱导并行相关染色，结果证实培养的细胞诱导分化后具有多方向分化潜能^[17-21]。
综上所述，实验所取结果初步证实：①通过自然速度沉降法可成功从兔骨髓组织中分选出骨髓间充质干细胞，分选出的骨髓间充质干细胞原代培养呈成纤维样集落生长，经特定诱导后具有成骨、成脂分化潜能。②较梯度密度离心法，自然速度沉降法分离出的间充质干细胞具有原代培养时间短，细胞集落形成率高的特点。③自然速度沉降法在间充质干细胞分选过程中不采取任何干预措施，也不添加任何分离介质，仅通过物理原理自然沉降，可能对细胞损伤小，使细胞原有的生物学特性得到保留。