基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 2965-2972.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.003

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基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

武密山¹，赵素芝²，高维娟³，任立中⁴，王茹¹，刘营¹，韩红伟¹，李彬⁵

¹河北中医学院基础医学院方剂学教研室，河北省石家庄市 050200；²石家庄市长安区胜北社区卫生服务中心，河北省石家庄市 050041；³河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北省石家庄市 050091；⁴河北医科大学第一医院骨科，河北省石家庄市 050031；⁵河北医科大学生物化学教研室，河北省石家庄市 050017

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 通讯作者：赵素芝，副主任医师，石家庄市长安区胜北社区卫生服务中心，河北省石家庄市 050041
作者简介:武密山，男，1966年生，河北省石家庄市人，汉族，1998年河北医科大学毕业，博士，教授，硕士生导师，主要从事“肾通于脑”的机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81073074，30472200)；河北省自然科学基金资助项目(H2013206005)；河北省高等学校科学技术研究重点项目(ZD2015053)；河北省高等学校高层次人才科学研究项目(GCC2014013)

Neuron-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. and Achyranthes bidentata Bl. as guiding drugs

Wu Mi-shan¹, Zhao Su-zhi², Gao Wei-juan³, Ren Li-zhong⁴, Wang Ru¹, Liu Ying¹, Han Hong-wei¹, Li Bin⁵

¹Department of Formulaology, Basic Medicine College, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China; ²Changan District Shengbei Community Health Center of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050041, Hebei Province, China; ³Hebei Key Laboratory of Chinese Medicine Research on Cardio-Cerebrovascular Disease, Shijiazhuang 050091, Hebei Province, China; ⁴Department of Orthopedics, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; 5Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Corresponding author: Zhao Su-zhi, Associate chief physician, Changan District Shengbei Community Health Center of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050041, Hebei Province, China
About author:Wu Mi-shan, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Formulaology, Basic Medicine College, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81073074, 30472200; the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. H2013206005; the Major Scientific Research Project of Hebei Provincial Higher Education, No. ZD2015053; High-Level Personnel Scientific Research Projects of Higher Education in Hebei Province, No. GCC2014013

摘要/Abstract

摘要：

背景：地黄饮子诱导的骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能恢复有明显的影响。
目的：探讨应用“升降开阖”通玄府的引经报使药(升麻、牛膝分别置换薄荷)地黄饮子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性，并进一步研究在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的调节作用。
方法：取4周龄健康清洁级 SD 大鼠骨髓，采用全骨髓贴壁法体外培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测第 3代细胞表面的骨髓基质标志 CD90和造血细胞标志 CD45。取第3代细胞，根据诱导条件不同分为4组：空白对照组、地黄饮子组、牛膝组、升麻组，空白对照组只用含体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12培养，后3组用地黄饮子含药血清、以牛膝为药引子的地黄饮子含药血清、以升麻为药引子的地黄饮子含药血清+体积分数为1%胎牛血清+DMEM/F12培养，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，诱导7 d后，采用免疫细胞化学法和 Western blot 检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达，RT-PCR检测胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子mRNA的表达。
结果与结论：第3代骨髓间充质干细胞大致呈单一的长梭形或扁平形，紧密漩涡样排列生长，流式细胞仪示 CD90表达高达98%，而CD45表达仅1.3%。诱导7 d后，升麻组、牛膝组和地黄饮子组的细胞收缩变圆，向四周伸出多个明显突起，部分突起间存在连接，表现出典型的神经元样细胞形态，而空白对照组变化不明显。免疫组化染色显示牛膝组及升麻组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达均高于地黄饮子组，牛膝组高于地黄饮子组，升麻组高于牛膝组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。Western blot 检测结果与免疫细胞染色结果一致。RT-PCR 检测胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子 mRNA改变类似于相应蛋白改变，升麻组>牛膝组>地黄饮子组>空白对照组，各组间差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果表明升麻、牛膝为药引子的地黄饮子可诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，Wnt/β-catenin 信号通路可能在骨髓间充质干细胞向神经分化过程中起重要作用。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 药引子, 升麻, 牛膝, 地黄饮子, 骨髓间充质干细胞, 神经元样细胞, 分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Rehmannia decoction has remarkable effects on the neurologic function recovery of cerebral ischemia-reperfusion model rats undergoing bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into neuron-like cells induced by Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. and Achyranthes bidentata Bl. as guiding drugs and to further explore the regulatory role.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were harvested from 4-week-old Sprague Dawley rats and cultured in vitro using the whole bone marrow adhesion method. Flow cytometry assay was used to detect the expression of CD90 and CD45 of bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3. Cells at passage 3 were divided into four groups according to different culture conditions: blank control group (1% fetal bovine serum+DMEM/F-12), Rehmannia decoction group (serum containing Rehmannia decoction+1% fetal bovine serum+DMEM/F-12), Achyranthes bidentata Bl. group (serum containing Rehmannia decoction with Achyranthes bidentata Bl. as the guiding drug+1% fetal bovine serum+DMEM/F-12), Cimicifuga heracleifolia Kom. group (serum containing Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. as guiding drug+1% fetal bovine serum+DMEM/F-12). Then the cellular morphology was observed under inverted phase contrast microscope. At 7 days after induction, immunocytochemistry staining and western blot assay were used to detect expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein; and RT-PCR was used to detect mRNA expression of glial cell line-derived neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells roughly presented a single long spindle or flat-shaped morphology at passage 3, grew with close whirlpool-like arrangement, and the CD90 expression level was up to 98%, but the expression level of CD45 was only 1.3%. At 7 days after induction, bone marrow mesenchymal stem cells in the groups of Rehmannia decoction, Achyranthes bidentata Bl. and Cimicifuga heracleifolia Kom. became round, extended multiple distinct processes and had connections among some processes, exhibiting typical neuron-like cell morphology, but in the blank control group, there was no obvious change. Immunocytochemistry staining showed that compared with the Rehmannia decoction group, the protein expression levels of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein in Achyranthes bidentata Bl. and Cimicifuga heracleifolia Kom. groups were obviously increased (P < 0.05); and these protein levels were also higher in the Cimicifuga heracleifolia Kom. group than the Achyranthes bidentata Bl. group (P < 0.05). Western blot results were consistent with the findings of immunocytochemistry staining. RT-PCR results showed the mRNA levels of glial cell line-derived neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor were ranked as follows: Cimicifuga heracleifolia Kom. group < Achyranthes bidentata Bl. < Rehmannia decoction < blank control group, and there were significant differences between different groups (P < 0.05). Taken together, Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. and Achyranthes bidentata Bl. as guiding drugs can induce the neuronal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and Wnt/β-catenin signaling pathway may play an important role in neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cimicifuga, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

武密山，赵素芝，高维娟，任立中，王茹，刘营，韩红伟，李彬. 基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2965-2972.

Wu Mi-shan1, Zhao Su-zhi, Gao Wei-juan, Ren Li-zhong, Wang Ru, Liu Ying, Han Hong-wei, Li Bin. Neuron-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. and Achyranthes bidentata Bl. as guiding drugs [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2965-2972.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态观察与鉴定
2.1.1 骨髓间充质干细胞形态观察原代培养3 d后见贴壁细胞，呈圆形、短梭形(图1A)，第7天细胞呈典型的长梭形(图1B)，第10天细胞呈漩涡样、鱼群样集落式生长(图1C)。第1代细胞培养3 d可见少量杂细胞(图1D)。第2代细胞培养3 d呈单一的长梭形(图1E)。第3代细胞培养3 d呈鱼群样紧密排列生长(图1F)。
2.1.2 骨髓间充质干细胞鉴定流式细胞仪鉴定第3代细胞表面骨髓基质标志CD90高达98%，而造血细胞标志CD45仅1.3%(图2)。
2.2 骨髓间充质干细胞神经分化及神经标志的免疫细胞染色
2.2.1 骨髓间充质干细胞神经分化升麻组诱导3 d后细胞体积变小，立体感增强(图3A)，其他2个诱导组细胞无明显变化。诱导7 d后牛膝组(图3D)及升麻组(图3E)神经元样细胞明显多于地黄饮子组(图3C)，胞体为椭圆形，复杂的多极细胞均可见。空白组罕见类似细胞(图3B)。诱导10 d后升麻组细胞相邻的突起间存在连接(图3F)，其他2个诱导组细胞无明显变化。
2.2.2 骨髓间充质干细胞神经标志的免疫细胞染色骨髓间充质干细胞诱导7 d后，免疫组化染色示牛膝组及升麻组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达均高于地黄饮子组，升麻组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达均高于牛膝组，见图4。

2.3 Western blot检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达水平诱导7 d 后，地黄饮子组、牛膝组及升麻组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达均高于空白对照组，牛膝组、升麻组高于地黄饮子组，升麻组高于牛膝组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5，表3。
2.4 RT-PCR检测脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达地黄饮子组、牛膝组及升麻组脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达均高于空白对照组，牛膝组及升麻组高于地黄饮子组，升麻组高于牛膝组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

设计：细胞培养实验观察。
时间及地点：实验于2013年6月至2015年2月在河北省心脑血管病中医药防治重点实验室完成。
材料：
实验动物：①用于细胞培养大鼠：清洁级4周龄SD大鼠4只，雌雄不限，体质量约 40 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。②用于血清制备大鼠：SPF级4月龄SD大鼠40只，雌雄不限，体质量(268±15) g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2003-1-003。实验过程中对动物的处置应符合2009 年《Ethicalissues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化实验所用主要试剂：
仪器	来源
DMEM/F12培养基	Hyclone 公司，澳大利亚
胎牛血清	Gibco 公司，美国
胰蛋白酶、琼脂糖、甘氨酸、SDS、TRIS、50×TAE、EB、EDTA-2Na	Solarbio公司，中国
兔抗大鼠 GFAP、GAPDH 多克隆抗体	Peprotech 公司，美国
兔抗大鼠 NSE 多克隆抗体	PL Laboratories 公司，美国
Triton-X100	AMRESCO 公司，美国
即用型 SABC 试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
DAB 显色试剂盒、HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、高灵敏度化学发光检测试剂盒	北京康为世纪生物科技有限公司
GREENspin 组织/细胞 RNA快速提取试剂盒	北京庄盟国际生物基因科技有限公司
PCR 试剂盒、DNA Marker	北京全式金生物技术有限公司
β-巯基乙醇	北京华迈科生物技术有限责任公司
体积分数为30%过氧化氢、无水乙醇、多聚甲醛	广州化学试剂厂
预染彩虹蛋白 Marker	Fermentas 公司
总蛋白提取试剂盒	普利莱基因技术有限公司

基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化实验所用主要仪器：
仪器	来源
干燥箱	上海实验仪器厂有限公司
水平摇床、水平电泳仪	北京六一仪器厂
CDI-165M 三气细胞培养箱、 BIO-BEST200E 凝胶成像系统	SIM 公司，美国
TS100-F 倒置相差显微镜	Nikon 公司，日本
超净工作台	苏州净化设备有限公司
冷冻高速离心机	珠海黑马医学仪器有限公司
Mini 水平电泳槽、垂直电泳槽、转移电泳槽、PCR 仪	BIO-RAD 公司，美国
数码相机	Canon 公司，日本
-80 ℃冰箱	Haier 公司，中国
BD FACSCalibur 流式细胞仪	BD 公司，美国
紫外/可见光分光光度计	北京瑞利分析仪器公司
移液器	BIOHIT 公司，芬兰
半自动生化分析仪	上海科华实验系统有限公司

实验方法：
骨髓间充质干细胞的分离、培养：
全骨髓贴壁法分离培养原代骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼法处死清洁级4周龄SD大鼠，体积分数为75%乙醇浸泡30 min消毒，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，置于无菌PBS中清洗表面软组织，显露骨髓腔，0.1 mol/L PBS冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞后接种于培养瓶，72 h后全量换液去除未贴壁细胞，每隔两三天换液1次，待贴壁细胞融合达80%时按1︰2传代。
骨髓间充质干细胞传代培养与纯化：倒置显微镜下观察贴壁细胞融合达80%时，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞，待细胞变圆且部分脱落时加入等量培养液终止消化，移至无菌离心管中，离心，弃上清液，体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，按1︰2传代，逐渐纯化。
流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞：取融合达80%的第3代骨髓间充质干细胞常规消化、离心，0.1 mol/L PBS重悬至细胞浓度为1×108 L-1，分装至1.5 mL EP管中，每管100 μL。分别加入5 μL 抗大鼠CD90和CD45-FITC单抗，空白对照组加入等量PBS，混匀，孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗涤2遍，以去除未结合的抗体，弃上清后，各加入 0.1 mol/L PBS 500 μL重悬成单细胞悬液，2 h内流式细胞仪上机检测。
大鼠血清的制备：SPF级4月龄SD大鼠40只，随机分为4组：①空白对照组：只灌服相同体积的生理盐水。②地黄饮子组：按1 g/kg 灌服地黄饮子，1次/d，连续3 d。 ③牛膝为药引子的地黄饮子组：按1 g/kg 灌服牛膝为药引子的地黄饮子，1次/d，连续3 d。④升麻为药引子的地黄饮子组：按1 g/kg 灌服升麻为药引子的地黄饮子，1次/d，连续3 d。第3次灌胃1.5 h后，所有大鼠在乙醚麻醉下自腹主动脉抽取血液，同组合并后离心获取血清，血清在56 ℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌后备用。参照本实验室方法[5]，制备1 μmol/L地黄饮子、牛膝为药引子的地黄饮子、升麻为药引子的地黄饮子的含药血清和生理盐水对照血清。
诱导分化分组：取第3代骨髓间充质干细胞常规消化离心，PBS洗涤2次。用无菌PBS重悬混匀至细胞浓度为1.5×107 L-1，接种至6孔板，每孔1 mL。24 h后吸弃原培养基，根据诱导分化条件不同分为4组：①空白对照组：每孔加含体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12培养基。②地黄饮子组：每孔加含20 μg/L地黄饮子含药血清及体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12培养液。③牛膝组(Achranthes)：每孔加含20 μg/L以牛膝为药引子的地黄饮子含药血清及体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12培养液。④升麻组(Cimicifuga)：每孔加含20 μg/L以升麻为药引子的地黄饮子含药血清及体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12培养液。共诱导分化7 d，每3 d换液1次。
细胞形态学观察：倒置显微镜观察原代培养第3，7，10 d细胞形态，第1，2，3代细胞培养第3天以及各组诱导第3，7，10天的细胞形态变化。
免疫细胞染色检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)等神经标志蛋白的表达：
免疫细胞染色前处理：骨髓间充质干细胞诱导培养7 d后弃原培养基，室温下每孔加入40 g/L多聚甲醛200 μL，固定细胞30 min。每孔加入0.3% Triton-X 100(Triton-X100 282 μL溶解于99.7 mL 0.1 mol/L PBS)200 μL，细胞破膜处理20 min。每孔加入体积分数为0.3% H2O2 200 μL，灭活内源性过氧化物酶。
免疫细胞染色：①5% BSA封闭：每孔加入5% BSA 200 μL孵育10 min，去除多余BSA溶液。②一抗孵育：各组分别加适当浓度一抗200 μL，兔抗鼠NSE抗体按1︰100稀释，兔抗鼠GFAP抗体按1︰50稀释，阴性对照组加入相应体积PBS，置于4 ℃孵育过夜。③二抗孵育：每孔加入山羊抗兔二抗200 μL。④SABC孵育：每孔加入SABC溶液200 μL，室温孵育20 min。⑤DAB辣根过氧化物酶显色：每孔加入DAB工作液200 μL，显色后0.1 mol/L PBS终止显色。显微镜下每组随机选择10个视野，计算阳性细胞比例。
Western blot检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达水平：①细胞总蛋白提取：按总蛋白抽提试剂盒操作。弃原培养液，在培养皿中加入细胞裂解液0.5 mL，收集液体于1.5 mL EP管中，按1︰2的比例加入蛋白提取试剂 1 mL，离心，室温干燥蛋白沉淀，加入2% SDS溶液70 μL，95 ℃煮5 min至蛋白沉淀溶解至澄清，标记每管蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度。②SDS-PAGE电泳：根据SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围及目的蛋白大小配制12%分离胶10 mL，加TEMED混匀后加入玻璃槽内，在分离胶上加双蒸水，室温放置30 min。配制5%的积层胶3 mL。测定完待测样品蛋白浓度后计算30 μg蛋白溶液体积即为上样量。取一上样孔加入5 μL预染彩虹蛋白Marker，紧邻Marker孔加入含30 μg蛋白的待测样品，剩余上样孔内加入等体积上样缓冲液平衡。采用70 V恒压电泳，待蓝色条带在积层胶与分离胶交界处成一条细线时，改为恒压120 V继续电泳，电泳至蓝色条带刚出凝胶，即终止电泳。③转膜：根据蛋白Maker的标示及目的蛋白的大小切去多余的分离胶及积层胶，从阴极面到阳极面依次叠放海绵垫、三层滤纸，用玻璃棒赶去气泡后制成转膜“三明治”。放入转膜槽中，接上电泳仪，冰水浴下采用 250 mA，转膜90 min，取出蛋白-PVDF膜。④封闭与杂交：用TBST缓冲液洗结合蛋白的PVDF膜3次，将PVDF膜置于10 mL封闭液中室温下置水平摇床平缓振摇孵育2 h。加入TBST稀释的一抗工作液：神经元特异性烯醇化酶抗体 (1︰100)、胶质纤维酸性蛋白抗体(1︰1 000)及GAPDH抗体(1︰2 000)，4 ℃孵育过夜。加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1︰4 000)，室温孵育2 h。⑤化学发光、显影、定影：根据高灵敏度化学发光检测试剂盒配制好化学发光试剂，将结合有蛋白的PVDF膜置于X光片夹中，将配制好的发光试剂滴加在PVDF膜的蛋白面。将胶片置于保鲜膜上，盖上X光片夹，曝光。将曝光后的胶片浸入显影液和定影液中冲洗，之后用超纯水终止显影。定影后的胶片晾干后保存并扫描，采用Image J灰度分析软件对蛋白条带的表达量进行分析。
RT-PCR检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF)mRNA表达水平：①细胞总RNA提取：按照GREENspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒操作步骤提取细胞总RNA：弃培养皿原培养基，加入细胞裂解液400 μL，在裂解产物中加入400 μL体积分数为70%的乙醇，将混合物转移入一个吸附柱RA中，并将吸附柱放入收集管内。4 ℃ 10 000 r/min，离心60 s，加入700 μL去蛋白液RW1，离心，加入500 μL漂洗液RW，离心。取出吸附柱RA放入1.5 mL EP管中，加水40 μL，离心。取2 μL RNA样本稀释50倍后用紫外分光光度计测定A260、A280吸光度值，计算样本RNA的浓度与纯度，-80 ℃保存备用。②RNA完整性鉴定：制备加入 10 g/L EB 5 μL的1.0%琼脂糖凝胶，分别取RNA样本5 μL和6×缓冲液各1 μL上样，100 V电泳25 min。BIO-BEST 200 E凝胶成像系统观察条带的完整性。③RNA反转录：按照HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒说明配制20 μL反应体系(dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 4 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFi-MMLV 1 μL，RNase-Free water 3 μL)，振荡混匀，70 ℃孵育15 min。④PCR反应：按2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒配制 25 μL反应体系(cDNA模板0.5 μL，上游、下游引物各1 μL，PCR SuperMix 12.5 μL，dd H2O 10 μL)，反应扩增条件见表1，最后在72 ℃ 延长8 min。PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳30 min。BIO-BEST 200 E凝胶成像系统观察条带。基因引物系列及产物大小见表2。

表1 各基因PCR条件
Table 1 PCR conditions

基因	预变性	变性	退火	延长	循环数
脑源性神经营养因子	94 ℃ 4 min	94 ℃ 30 s	60 ℃ 30 s	72 ℃ 45 s	31
胶质细胞源性神经营养因子	94 ℃ 4 min	94 ℃ 30 s	60 ℃ 30 s	72 ℃ 45 s	31
β-catenin	94 ℃ 4 min	94 ℃ 30 s	58 ℃ 30 s	72 ℃ 5 s	30

表2 RT-PCR引物序列及产物大小
Table 2 RT-PCR primer sequences and product sizes

基因	引物序列	产物大小
脑源性神经营养因子	上游5’-GCG GCA GAT AAA AAG ACT GC-3’ 下游5’-GCA GCC TTC CTT CGT GTA AC-3’	238 bp
胶质细胞源性神经营养因子	上游5’-TGC CCG AAG ATT ATC CTG AC-3’ 下游5’-TCA GTT CCT CCT TCC TTT CG-3’	264 bp
β-catenin	上游5’-CTG GTG ACA GGG AGG ACA TT-3’ 下游5’-TGC ACA AAC AGT GGA ATG GT-3’	442 bp

主要观察指标：①细胞的形态学观察。②免疫细胞染色检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白等神经标志蛋白的表达。③Western blot检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达水平。④RT-PCR检测脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达水平。
统计学分析：实验数据以x±s表示，应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，组间比较采用多组样本比较的t 检验，计数资料两两样本间率的比较采用χ²检验。

讨论

3.1 玄府的认识 “玄府”一词，最早见于《黄帝内经》，其《素问•水热穴论》云“所谓玄府者，汗空也”。金元医家刘完素对玄府之义大加发挥，以独特的视角、精炼的语言，提出了一个全新的集合着结构、功能与信息的“玄微府”概念，如《素问•玄机原病式》指出：“然皮肤之汗孔者，谓泄气液之孔窍也，一名气门，谓泄气之门也。一名腠理者，谓气液出行之腠道纹理也。一名鬼神门者，谓幽冥之门也。一名玄府者，谓玄微府也。然玄府者，无物不有，人之脏腑、皮毛、肌肉、筋膜、骨髓、爪牙，至于世之万物，尽皆有之，乃气出入升降之道路门户也”。
玄府，含义有3个：①分布广泛：不仅遍布人体内外各处，而且存在于各种生物中，玄府是存在于世界万物内部的细小幽微的孔隙(包括血脑屏障)。②结构微细：所谓“玄微府”，即言其形态之玄冥幽微，殆非肉眼所能窥见，人体之玄府广泛存在于一切有形可见、有特定功能的组织器官中，其为气机升降出入之门户，津液输布流通之道路，集中体现生命活动的气化功能的场所。③贵开忌阖：玄府以开通为顺，闭阖为逆。玄府亦为人体神机出入之所，人体的一切生命活动皆与玄府“枢机”的宣通开阖有关。若玄府郁闭，气液不得流通，则百病由生。
玄府为人体一身组织腠理，只要玄府通畅、则营卫、气血、津液等营养物质在体内畅行无阻，脏腑、经络、四肢、九窍、肌肤、骨髓、毛发皆得以滋养而维持其正常生理功能，维持这种正常生理现象的机制被称为“玄府气血液宣通”，且受到人体“神机”的调节和控制[6-8]。分布于脑的玄府，依赖于玄府通利、开阖自如，才得以保持机体的气液流通、血脑屏障渗灌和神机运转的复杂功能。病理情况下，一旦玄府的正常开阖通利状态受到损伤，必然会影响正常的气、血、液流通等功能，导致气滞停津，积水成浊，浊蕴为毒，浊毒泛淫玄府，碍神害脑，变生中风诸症。
3.2 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定骨髓间充质干细胞在特定条件下可分化为多谱系细胞[9]，如成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等，是组织工程研究、细胞替代治疗的良好种子细胞。目前常用的体外分离培养骨髓间充质干细胞方法主要有4种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法及免疫磁珠分选法[10]，尤以前两种方法最为常用，后两种方法所获得的细胞纯度较高，但因细胞活性差、操作复杂及费用昂贵等原因限制了其应用。全骨髓贴壁法通过不断换液及传代的方法去除不贴壁的血细胞、白细胞和造血细胞等成分，经三四次传代后可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞。本实验采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，隔天换液1次，经过多次换液冲洗及传代两三次后得到形态比较一致的典型的纤维样细胞，呈栅栏样、鱼群及漩涡样集落式生长，细胞间紧密排列，流式检测示第3代骨髓间充质干细胞表面标志CD90、CD45阳性率分别为98%、1.3%，符合骨髓间充质干细胞基本特性。
3.3 微环境对骨髓间充质干细胞的影响因骨髓间充质干细胞具有良好的自我增殖及多向分化潜能，对生长微环境要求极为严格，如血清纯度、培养瓶质量等，本实验全程采用高纯度血清及塑料瓶培养细胞，以最大限度的降低培养微环境对骨髓间充质干细胞生物活性的影响。原代培养细胞第3天全量换液后见贴壁细胞较多，部分细胞呈短梭形，逐渐成长梭形，轮廓清晰，细胞增殖较快，细胞形态大致一致，第7天左右见细胞呈典型集落样生长，细胞呈栅栏样、鱼群及漩涡样紧密排列，第10天左右铺满瓶底达80%左右，未出现异常分化、衰老细胞，传代细胞经一两天静止期后呈对数增长，4 d左右铺满瓶底达90%左右，细胞形态呈一致的典型的长梭形紧密排列。
3.4 不同血清浓度对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响血清是细胞体外培养时最常用的天然培养基，营养物质丰富，血清内成分复杂，各成分对细胞体外培养的作用各不相同，如生长激素调节细胞的多种生命活动；生长因子刺激细胞生长、增殖分化；纤维连接蛋白维持细胞结构并促进细胞黏附，对于贴壁生长的细胞必不可少；蛋白酶抑制剂可以中和细胞释放的毒性物质；血清中的蛋白质提高细胞培养液的黏度，有利于细胞免受机械损伤[11]。血清浓度的高低决定了神经干细胞分化的方向，不同血清浓度培养分化所得的神经元和胶质细胞比例不同。将脊髓来源的神经干细胞接种于无血清、含体积分数为5%胎牛血清和体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，7 d后进行免疫双标染色并计数神经元和胶质细胞的比例，发现无血清条件下主要向神经元分化，低血清和高血清浓度条件下主要向胶质细胞分化，但无血清和低血清浓度下所分化的胶质细胞为原浆型星形胶质细胞，而高血清浓度下则分化为纤维型星形胶质细胞[12]。本实验室的早期研究观察了不同血清浓度对地黄饮子诱导骨髓间充质干细胞成神经分化方向的影响，胎牛血清浓度影响了骨髓间充质干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的比例，在无血清条件下趋向于向神经元分化，在高浓度血清条件下趋向于向星形胶质细胞分化。
3.5 Wnt/β-catenin信号通路在骨髓间充质干细胞成神经分化中的作用经典的 Wnt 信号传导通路的组成主要包括：配体(Wnt家族分子)、跨膜受体(Frizzled家族分子和 LRP-5/6)、胞浆调节蛋白(Dsh、APC、Axin、GSK-3β、β-catenin等)以及核内转录因子(TCF/LEF1家族)等。Wnt 信号通路活化的第一步是Wnt蛋白与细胞膜上受体Fz及辅助受体LRP5/6结合。LRP5/6胞外区结合Wnt蛋白，和Fz受体相互作用将Wnt信号从胞外传入胞内。Wnt蛋白的受体是卷曲蛋白(Frizzled，Fz)，为7次跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体。Fz胞外N端具有富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，能与Wnt结合，其胞内区作用于蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh 或 Dv1)，Dsh与其他蛋白一起阻断β-catenin的降解途径，从而使β-catenin在细胞质中积累，并进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，激活下游靶基因的转录，引发生物学效应[13]。TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子，它与 Groucho结合则抑制基因转录[14]，而与β-catenin结合则促进基因转录[15]。研究分离培养的骨髓间充质干细胞可塑性时发现[16]，与小脑颗粒神经元共培养的nestin阳性骨髓间充质干细胞呈神经元样形态，且Wnt信号受体蛋白FZD1、FZD2及FZD5表达增加。
胶质细胞源性神经营养因子属于转化生长因子家族，是目前发现的多巴胺能神经元特异性最强的营养因子，也是运动神经元营养因子，有利于发育中和成熟的多巴胺能神经元的存活和轴突延伸，并能促进神经前体细胞分化为神经元样细胞[17]；对神经损伤修复具有重要作用，提高损伤后的神经元存活[18]，并能促进损伤的周围神经再生[19]。胶质细胞源性神经营养因子能诱导骨髓间充质干细胞向肠神经细胞分化，分化后的细胞胶质细胞源性神经营养因子表达增强[20]。脑源性神经营养因子是神经营养因子家族成员，促进周围及中枢神经细胞存活、生长、发育及功能维持，调节神经元轴突、树突的生长，调控中枢神经系统突触的形成与神经递质的释放[21-23]。脑源性神经营养因子能有效促进神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化，并促进神经元突起延伸，分化过程中Wnt 1和游离β-catenin分子表达增加，而这些促进效应可被Wnt信号通路特异性阻滞剂IWR1显著抑制，脑源性神经营养因子在体外可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路引起神经干细胞增殖、分化[24]。
根据“升降开阖”通玄府法，选择升清降浊、开阖枢机的牛膝、升麻，升麻组、牛膝组和地黄饮子组可诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，分化过程中胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子mRNA表达增高，提示Wnt/β-catenin信号通路可能在骨髓间充质干细胞向神经分化过程中起重要作用。但确切的信号机制及所得神经是否具有电生理功能需进一步研究。

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哪些方药能“归经入脑”？脑是人体至关重要的器官，但中医学对脑却一直未给予足够的重视，从古至今归经(the channel-tropism of herbal drugs)理论中更无“归经入脑”之说（中医有“五神藏”之说，归经入脑的药物一般归于五脏）。药引子(medicinal guiding)可引导药力直达病所，发挥脑靶向作用归经入脑，吴鞠通《医医病书点注》：“药之有引经，如人之不识路径者，用向导也，能接引众药，直入本经，用力寡而获效捷也”。药引子是具有向导使命的靶向载体，“药引子”侧重于改变方药的作用趋向。《医学阶梯》说：“汤之有引，如舟之有楫”。地黄饮子的使药薄荷主要成分薄荷油为脂溶性小分子物质，属于芳香开窍药，易通过血脑屏障，对中枢神经系统有抑制作用。传统归经主要以临床疗效为依据，目前大多数中药调节血脑屏障的研究集中在芳香开窍药，而对非芳香开窍药的脑靶向研究很少，本课题将升麻和牛膝置换补肾方药地黄饮子的使药薄荷，研究是否能有更好的“归经入脑”靶向作用呢？
本课题从脑病的发生，选择药引子升麻和牛膝置换薄荷，“归经入脑”的依据是：
升麻，入脾、胃、肺、大肠经，在补中益气汤中“升清阳之气”，使下陷之清阳上升而恢复其本位。从中药升降浮沉的作用趋势看：升浮药向上、升阳、开窍均可“归经入脑”。脑为至清至高之清灵之体，《素问•本病论》说:“神游上丹田, 在帝太乙君泥丸宫下”，脑为气血精华汇集之处，《灵枢•邪气脏腑病形》云:“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍”。《素问•口问篇》:“上气不足, 脑为之不满”。
牛膝，入肝、肾经，在镇肝熄风汤中“引血下行”，折其亢盛之肝阳，平定气血逆乱之势，补益肝肾。脑居天阳之位，位于气机升降转折之处，气机上升到此而转为下降，成为气机升降的转折点。从中药升降浮沉的作用趋势看：引血下行，或者质重潜降亢脑之阳的药均可“归经入脑”。
升麻（“升清阳之气”）和牛膝（“引血下行”）在理论上“归经入脑”，如果作为药引子，置换地黄饮子的使药（药引子薄荷），能否具备主动寻靶“归经入脑”通过血脑屏障的引领作用呢？清代临床医家龙之章说：“治病引子最为先，引子便是先锋官”，本课题用高通量筛选和现代分离提取技术，分析“药引子”（薄荷、升麻、牛膝）是否有靶向亲和性的引经载体(medicinal guiding carrier)，进一步阐明 “药引子”主动寻靶“归经入脑”通过“血脑屏障”之后，作用于 Wnt/β-catenin 信号通路转导途径，从“药引子”中寻找“肾通于脑”的天然脑靶向引经载体一定会有欣喜的发现。

基于“升降开阖”通玄府的引经药诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

Neuron-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by Rehmannia decoction with Cimicifuga heracleifolia Kom. and Achyranthes bidentata Bl. as guiding drugs

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