C4/5椎间不稳模型动物病理学变化及黄韧带转化生长因子β1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2891-2895.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.018

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C4/5椎间不稳模型动物病理学变化及黄韧带转化生长因子β1的表达

卜宪敏1，吴彬2，徐芳芳1，孟纯阳2，王海滨2

1济宁市第一人民医院病理科，山东省济宁市 272000；2济宁医学院附属医院骨科，山东省济宁市 272000

收稿日期:2015-03-30 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
作者简介:卜宪敏，女，1980年生，山东省微山县人，汉族，2006年福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事病理研究。
基金资助:
济宁医学院青年基金(20090511)；山东省自然科学青年基金(ZR2014CQ042)

Histopathology changes and transforming growth factor-bata1 expression in the ligamentum flavum of C4/5 cervical instability animal models

Bu Xian-min1, Wu Bin2, Xu Fang-fang1, Meng Chun-yang2, Wang Hai-bin2

1Department of Pathology, First People’s Hospital of Jining, Jining 272000, Shandong Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jining Medical College, Jining 272000, Shandong Province, China

Received:2015-03-30 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
About author:Bu Xian-min, Master, Attending physician, Department of Pathology, First People’s Hospital of Jining, Jining 272000, Shandong Province, China
Supported by:
the Youth Foundation of Jining Medical College, No. 20090511; the Natural Science Foundation of Shandong Province of China, No. ZR2014CQ042

摘要/Abstract

摘要：

背景：破坏颈椎后方稳定结构会导致黄韧带退变加速，颈椎前方不稳是否会导致后方相应黄韧带及邻近节段黄韧带退变加速还不清楚。
目的：观察颈椎不稳动物模型中黄韧带的组织病理学变化及对转化生长因子β1表达的影响。
方法：将36只新西兰大白兔随机等分为实验组及对照组。实验组通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸C4/5髓核组织建立兔颈椎不稳动物模型，对照组不做任何处理。
结果与结论：与对照组相比，实验组兔C3/4，C4/5，C5/6黄韧带中纤维排列紊乱，玻璃样变性，黄韧带中转化生长因子β1阳性染色面积增加，其中以C4/5最为显著；4，8及12周时2组大白兔C3/4，C4/5，C5/6黄韧带中转化生长因子β1的阳性面积接近。说明颈椎前方不稳会诱发后方黄韧带退变加速，其中以损伤节段黄韧带退变最为严重。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织移植动物模型, 颈椎不稳, 临近节段, 颈椎退变, 黄韧带, 动物模型, 转化生长因子β1, 组织病理学, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Destroying posterior stable structure of cervical vertebra may facilitate the ligamentum flavum regeneration. Whether anterior cervical instability can induce the regeneration in posterior and adjacent ligamentum flavum remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the changes of transforming growth factor-β1 expression and histopathology in the ligamentum flavum of cervical instability animal models. METHODS: Thirty-six New Zealand white rabbits were randomly divided into control group and experimental group, with 18 rabbits in each group. In the experimental group, cervical instability animal models were established made through destroying annulus fibrosus by anterior puncture and absorbing nucleus pulposus in C4/5. And no intervention was given to the control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, fibers in the C3/4, 4/5, 5/6 ligamentum flavum arranged disorderly and the glass like degeneration was found in the experimental group. The expression of transforming growth factor-β1 in ligamentum flavum was increased, especially in C4/5, in the experimental group. At 4, 8, 12 weeks, transforming growth factor-β1 expression in the C3/4, 4/5, 5/6 ligamentum flavum segments was similar between the two groups. Experimental findings indicate that, anterior cervical instability can induce the regeneration in posterior ligamentum flavum, especially in the injured segment.

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Key words: Transforming Growth Factor-β1, Cervical Vertebrae, Ligamentum Flavum, Intervertebral Disk Degeneration

中图分类号:

R318

卜宪敏，吴彬，徐芳芳，孟纯阳，王海滨. C4/5椎间不稳模型动物病理学变化及黄韧带转化生长因子β1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2891-2895.

Bu Xian-min, Wu Bin, Xu Fang-fang, Meng Chun-yang, Wang Hai-bin. Histopathology changes and transforming growth factor-bata1 expression in the ligamentum flavum of C4/5 cervical instability animal models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2891-2895.

图/表（结果） 1

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2014年12月在济宁市第一人民医院病理科及济宁医学院中心实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级健康3月龄新西兰大白兔36只，雌雄不限，体质量(2 500±250) g，由山东农业科学院畜牧兽医研究所提供，许可证号：SCXK(鲁)20120013。标准啮齿类动物饲料喂养，清洁饮水。室温保持在(24±2) ℃，模拟太阳光照，保持每天12 h光照和黑暗的交替。实验符合动物伦理学的要求。

颈椎不稳动物模型研究所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胰蛋白酶	美国Sigma公司
转化生长因子β1试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
DAB显色剂ZLI-9032	北京中杉金桥生物技术有限公司
BX51光学显微镜，奥林巴斯M88医学图像处理系统	日本奥林帕斯公司

方法：

C_4/5椎间不稳动物模型建立^[3-4]：36只新西兰大白兔随机分为2组，每组18只动物，实验组通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸C_4/5髓核组织建立颈椎不稳动物模型。体积分数10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，动物取仰卧位，以C₅为中心取前路纵切口长约3 cm，逐层切开，钝性分离，显露C_4/5椎间盘，针刺法破坏纤维环并抽吸髓核组织，彻底止血后缝合深筋膜及皮肤，术中注意观察呼吸、心率的变化，术后分笼喂养，肌注青霉素1周，40×10⁴ U/d，对照组动物不作处理。术后让动物自由活动颈部(图1)。

C_3/4，C_4/5，C_5/6黄韧带组织标本处理：建模后4，8，12周3个时间点处死动物，每次空气栓塞法处死实验组及对照组各6只动物，紧贴上下软骨终板切取C_3/4，C_4/5，C_5/6黄韧带组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，体积分数10%EDTA中脱钙72 h，流水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋备用。石蜡包埋后进行连续切片备用，片厚5 μm。

苏木精-伊红染色：石蜡切片脱蜡至水。苏木精染色 8 min。自来水冲洗3 min。体积分数1%盐酸乙醇分色10- 15 s。浸水复蓝15 min。伊红复染8 min。梯度乙醇脱水。二甲苯透明。中性树脂封固，光镜观察。

免疫组化法检测转化生长因子β1表达：阳性颗粒呈棕黄色。医学图像处理系统观察免疫组化标记的切片，每张图片随机选择10个视野，image pro plus图像分析软件分析转化生长因子β1表达的阳性面积，取平均值。

主要观察指标：C_3/4，C_4/5，C_5/6黄韧带的组织学形态及转化生长因子β1表达的变化。

统计学分析：所有数据均用x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计分析软件进行统计处理，数据进行重复测量的单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，检验水准采取α=0.05。

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讨论

黄韧带位于上下椎板之间，是脊柱后柱的重要组成部分，其主要作用为限制脊柱过度前屈，同椎间盘、椎间韧带、关节突关节等一起维持脊柱的稳定。黄韧带是椎管后外侧臂的主要组成部分，保护椎管内脊髓及马尾神经，随着年龄的增长，黄韧带弹性下降，出现增生、肥厚、钙化、骨化等退行性病变，临床主要表现为椎管狭窄及脊髓病变^[5-9]。已有研究表明，颈椎后柱结构遭到破坏后颈椎不稳会导致黄韧带退变加速，黄韧带中转化生长因子β1及骨形态发生蛋白2基因表达增加^[10-12]，但是颈椎前方不稳，椎间高度降低是否也会影响到后方相应及相邻黄韧带的组织病理学变化及转化生长因子β1表达的变化，国内外文献鲜见报道。本实验发现颈椎前方单节段椎间高度降低，椎间不稳定也可以加速后方黄韧带的退变，表现在病理组织学变化及转化生长因子β1表达增加，下面从黄韧带退变的生物力学、组织病理学、生物化学方面展开讨论。

3.1 黄韧带退变的生物力学黄韧带位于上下椎板之间，是脊柱椎管内的维持脊柱稳定性的一个韧带组织结构，属于脊柱后柱的支持结构之一。颈椎的稳定平衡主要由2部分来维持：一是静力性平衡，包括椎体、椎间盘、椎弓及其相连的韧带结构。二是动力性平衡，主要为颈部肌肉的调节与控制^[13]。上述任何一个环节遭受破坏，均可能引起或诱发颈椎正常构及平衡功能的丧失，从而导致颈椎不稳。兔是爬行动物，颈椎纤维环主要承受张应力、剪力和扭转应力，只有在蹲伏抬头时才承受部分压应力。本组实验中兔颈椎结构的破坏、前方的不稳定，破坏了原有的平衡，导致邻近节段的纤维环呈现高度的应变状态。实验通过前路穿刺的办法，使前方椎间盘高度降低，诱发不稳，对于爬行动物兔子来说，会导致后方的黄韧带收到牵拉，脊柱有3条长韧带(棘上韧带、前纵韧带和后纵韧带)和2条短韧带(黄韧带和棘间韧带)，通过竖脊肌群和韧带结构对抗前屈力矩，维持脊柱稳定性和传递拉伸载荷。Chazal等^[14]研究发现，韧带附着于脊柱生理弯曲凸侧的力量较凹侧明显增强，而兔为爬行动物，颈椎基本上是直立的，因此在作者建立的动物模型中，位于后方的黄韧带组织承受更大的应力，加速的黄韧带的退变。不同节段黄韧带所受张力矩不同，在本实验中，C_4/5段黄韧带与其他节段黄韧带相比，处于更高张力矩状态，按照张应力牵拉成骨的理论^[15]，更易于发生退变和骨化。作者制作的C_4/5不稳模型，对应C_4/5段黄韧带承受更大的力学刺激，所以退变最为明显，随着时间的推移，退变不断加重，在建模后12周时黄韧带退变最为明显，变现为纤维变得粗糙，排列紊乱，玻璃样变性及色素沉着，纤维之间形成裂隙。

3.2 黄韧带退变的组织病理学黄韧带主要由含有大量弹性纤维的致密结缔组织组成，平行排列成柬，并以细小的分支连接成网，其间有胶原纤维和成纤维细胞。黄韧带受到的牵拉应力异常增高，其弹力纤维会变性或断裂，而长期的损伤及修复过程必然使黄韧带肥厚纤维化，最终将导致黄韧带钙化，在作者建立的模型中，前方椎间高度降低，诱发邻近节段的受力及活动范围改变，而且兔子为爬行动物，大部分时间处于低头姿势，前方承受的为压应力，后方为张应力，而在兔子颈椎后伸的时候，对黄韧带的刺激又变为压应力，反复微小机械应力对黄韧带退变、骨化的启动起一定作用。Hijioka等^[16]研究表明微小外伤的累积可以诱导黄韧带背侧毛细血管增生并向毛细血管很少的硬脊膜侧延伸，正在生长的毛细血管内皮细胞间缺乏特殊的连接复合体，管壁的渗透性增高，结合有钙的大分子物质易穿过内皮细胞间隙进入血管周围的结缔组织中，引发钙盐结晶的形成。Okuda等^[17]也认为反复微小创伤可诱导血管形成。骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1表达增加，加速了黄韧带的退变，退变肥厚的黄韧带弹力纤维减少，胶原纤维代偿性增多，纤维排列紊乱，并出现较明显的变性及钙化，在本实验发现，C_4/5黄韧带退变最为明显，表现为黄韧带明显肥厚，弹性降低，在12周时部分区域出现微小的骨化，可能与其受到的应力刺激最多、最大有关。

3.3 黄韧带退变后的生物化学变化转化生长因子β1属转化生长因子β超家族，由Derynck于1978年从小鼠肉瘤病毒转化的3T3细胞无血清培养液中分离得到的^[18-20]，转化生长因子β1是一种调节细胞生长与分化的超家族分子，几乎参与了哺乳动物所有细胞的病理生理过程，尤其在细胞外基质的产生及调控方面意义重大^[21-22]，一些具有成骨作用的激素和生长因子的代谢异常可能与韧带退变骨化的发生有关。局部的生长因子对于脊柱韧带骨化的发生、发展起着十分重要的作用，这些生长因子中以转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2最为重要，有研究发现，转化生长因子β1通过刺激成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原的分泌来促进韧带的增生与肥厚，但转化生长因子β1自身并没有诱导异位骨化的能力^[23]，作为启动因素骨形态发生蛋白2可能通过诱导间充质前体细胞的分化来参与韧带骨化的发生，而转化生长因子β1在骨形成过程的后期协助和推动骨的形成^[24-25]。正常情况下在颈椎黄韧带中少量表达转化生长因子β1^[26]，当颈椎不稳黄韧带受到牵拉刺激后表达增加，本实验证实了这一点，而且在受刺激最为明显的C_4/5节段黄韧带表达增加尤其明显，而在相邻的C_3/4及C_5/6节段，由于受到的刺激较少，转化生长因子β1的表达略有增加，而且本实验还发现，随着时间的推移，转化生长因子β1的表达不是持续增加，而是稳定在一个较高的水平，转化生长因子β1表达增加可能为黄韧带退变、骨化的首要因素。黄韧带退变的发生过程极其复杂，是否还有其他细胞因子参与及细胞因子之间的相互作用及反馈调节仍需进一步的研究。

综上所述，脊柱稳定结构对维持脊柱的正常形态和生理功能意义重大^[27-30]，本实验破坏了颈椎前方椎间高度，导致了后方的黄韧带的受力不均，导致黄韧带退变加速，

形态学表现为黄韧带纤维层次结构不清，玻璃样变性，后期出现纤维骨化，在生物化学方面表现为转化生长因子β1表达增加，其中以相应节段的C_4/5段黄韧带最为明显，C_3/4和C_5/6黄韧带也有退变发生，但是黄韧带退变的机制较为复杂，其具体机制仍不明确，是否还有其他诱发因素及细胞因子的参与，需要尽一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

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