激素性股骨头缺血性坏死模型兔股骨组织中间隙连接蛋白Cx43的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.005

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2814-2819.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.005

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激素性股骨头缺血性坏死模型兔股骨组织中间隙连接蛋白Cx43的表达

韦露，罗高斌，李巍，林义才，阮中坚，周志广，薄占东

广西医科大学第一附属医院骨关节外科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2015-02-13 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 薄占东，博士，主任医师，广西医科大学第一附属医院骨关节外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:韦露，男，1989年生，广西壮族自治区南宁市人，壮族，广西医科大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(81460348)；广西教育厅一般项目(2013YB314)

Cx43 expression in the femur of rabbit models of steroid-induced vascular necrosis of the femoral head

Wei Lu, Luo Gao-bin, Li Wei, Lin Yi-cai, Ruan Zhong-jian, Zhou Zhi-guang, Bo Zhan-dong

Department of Bone and Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2015-02-13 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Bo Zhan-dong, M.D., Chief physician, Department of Bone and Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wei Lu, Studying for master’s degree, Department of Bone and Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460348; the General Project of Department of Education of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2013YB314

摘要/Abstract

摘要：

背景：激素性股骨头缺血性坏死的发病机制至今尚未完全阐明，间隙连接蛋白Cx43作为骨组织细胞间的主要间隙连接，通过介导骨细胞间信息、能力的正常传递参与调控骨组织细胞生长、分化，代偿性的骨增加或减少，间隙连接蛋白Cx43与激素性股骨头坏死发生发展的关系国内外尚少见报道。
目的：通过建立兔激素性股骨头坏死模型，初步探讨间隙连接蛋白Cx43在激素性股骨头坏死中的表达变化。
方法：将新西兰大白兔40只随机等分为两组，模型组采用内毒素+激素方法构建激素性股骨头坏死模型，对照组于相同时间点注射等量生理盐水。
结果与结论：建模4周后，苏木精-伊红染色结果显示，模型组股骨头软骨下区骨小梁变细，结构紊乱，空骨陷窝明显增多，脂肪细胞增多，髓腔内造血细胞明显减少；对照组股骨头软骨下区骨小梁排列整齐、很少见空骨陷窝，骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞较少；免疫组织化学检测显示：Cx43蛋白阳性表达于骨小梁边缘成骨细胞及骨小梁内骨细胞胞浆上及骨髓细胞间质。Western blot检测显示，碱性磷酸酶和Cx43蛋白的表达在模型组中低于对照组(P < 0.05)。结果证实，在激素性股骨头坏死兔模型组织中Cx43蛋白表达下降，可能是激素性股骨头坏死发生发展的重要环节。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 骨及关节损伤模型, 股骨头坏死, 激素诱导, 动物模型, 间隙连接蛋白Cx43, 碱性磷酸酶, 免疫组化, 免疫印迹实验, 苏木精-伊红染色, 骨细胞调亡, 发病机制, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The mechanism of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head is still unclear, Cx43 protein as the main gap junction in bone tissue, through transmitting information between osteoblasts, regulates bone cell growth and differentiation, compensatory bone increase or decrease. The relationship between Cx43 protein and steroid-induced avascular necrosis of the femoral head is still rarely reported.
OBJECTIVE: To explore the changes in Cx43 expression in rabbit models of steroid-induced vascular necrosis of the femoral head.
METHODS: Forty New Zealand rabbits were equally and randomly divided into model group and control group. Rabbits in the model group were used to establish models of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head using endotoxin and hormone. Rabbits in the control group were injected with the same volume of physiological saline at the same time points.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after model establishment, hematoxylin-eosin staining results revealed that in the model group, the trabecula became thin and distributed disorderly in the femoral subchondral area. Empty lacuna increased significantly. Adipocytes increased. Hematopoietic cells in medullary cavity apparently diminished. In the control group, trabecula arranged orderly and empty lacuna could be seen. Bone marrow cells were abundant, but adipocytes were less. Immunohistochemical method demonstrated that Cx43 protein expression was observed in osteoblasts of the edge of trabecula, cytoplasm of osteoblasts of trabecula, and bone marrow stromal cells. Western blot assay results showed that alkaline phosphatase and Cx43 protein expression was lower in the model group than in the control group (P < 0.05). Results indicated that Cx43 protein expression decreased in the model rabbits, which may be the key link of the occurrence and development of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Femur Head Necrosis, Hormones, Alkaline Phosphatase

中图分类号:

R318

韦露，罗高斌，李巍，林义才，阮中坚，周志广，薄占东. 激素性股骨头缺血性坏死模型兔股骨组织中间隙连接蛋白Cx43的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2814-2819.

Wei Lu, Luo Gao-bin, Li Wei, Lin Yi-cai, Ruan Zhong-jian, Zhou Zhi-guang, Bo Zhan-dong. Cx43 expression in the femur of rabbit models of steroid-induced vascular necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2814-2819.

图/表（结果） 2

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引言

股骨头缺血性坏死是指由于遗传因素与多种环境因素的共同作用，使股骨头发生部分或完全性缺血，导致骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞坏死的病理过程^[1-3]。

目前糖皮质激素作为治疗某些疾病(如类风湿性关节炎、抗磷脂抗体综合征和器官移植后等)的有效手段，已广泛使用于临床，而由此引起的激素性股骨头坏死(steroid- induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)病例大量出现^[4-5]。迄今为止，激素性股骨头坏死的发病机制尚不明确。国内外研究者从分子、基因水平对激素性股骨头坏死发病机理进行深入研究，如脂肪代谢紊乱、血管内凝血、微血管损伤、氧化应激反应和细胞凋亡等学说^[6-8]。其病理最后通路为股骨头局部血液循环障碍，引起股骨头血液供应减少，成骨分化抑制、破骨细胞活跃，导致骨吸收及新骨重建平衡失调，最终引起股骨头坏死、塌陷。

连接蛋白43(connexin 43，Cx43)是骨组织中主要的间隙连接(gap junction)蛋白和半通道(hemichannel)蛋白，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞，均表达Cx43，并在彼此间形成间隙连接，使得骨组织所有细胞形成一个整体网络^[9]。由Cx43形成的间隙连接及半通道实现了骨组织细胞间的直接通讯，对骨组织的正常发育、骨重建过程的建立与平衡起重要作用。而激素性股骨头坏死的病理过程与骨吸收与重建密切相关，这启示Cx43是否通过参与调控骨细胞的分化与调亡参与激素性股骨头坏死的发生发展。

目前关于Cx43与激素性股骨头坏死发生和发展关系的研究国内外尚少见报道。实验通过免疫组织化学原位检测Cx43蛋白在股骨头的表达，Western blot 定量检测其在激素性股骨头坏死及正常股骨头中的表达，探讨其在激素性股骨头缺血性坏死发生发展的作用，为激素性股骨头坏死的研究提供新理论和实验依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2014年3至11月在广西医科大学实验中心完成。

材料：

实验动物：4月龄新西兰大白兔40只，雌雄不限，由广西医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(桂卫)2014-0006，大白兔体质量(2.5±0.18) kg，应用标准饮食饲养。

激素性股骨头坏死模型实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
地塞米松磷酸钠脂针	天津大茂
SABC免疫组织化学试剂盒	武汉博士得
LPS	Sigma公司，美国
DAB显色盒	北京中杉
Cx43 IgG，山羊抗兔碱性磷酸酶，GAPDH多克隆抗体	Abcam，英国
licor红外荧光染料标记的二抗	licor，美国

方法：

分组和激素性股骨头坏死模型兔的建立：将40只兔随机分成2组，模型组与对照组各20只。

模型组：于耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素20 µg/kg^[10]，24 h后重复给药1次；注射完毕后，立即臀肌注射地塞米松磷酸钠脂针(25 mg/kg) 3次，每次间隔24 h。模型组动物从开始注射内毒素开始肌注青霉素4×10⁴ U/kg预防感染，连续5 d^[11-12]。

对照组：与模型组相同时间点于耳缘静脉和臀肌注射等量生理盐水。

取材：所有动物建模4周后，体积分数3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉麻醉，手术切取双侧股骨头，将标本分装放入-80 ℃冰箱保存备用。

组织学观察：各组兔股骨头冠状面切开，体积分数1%中性甲醛固定，体积分数5%EDTA脱钙，系列乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片，片厚5 μm，苏木精-伊红常规染色。光学显微镜下观察股骨头骨小梁结构、骨细胞和骨髓脂肪细胞形态变化。
Cx43免疫组织化学染色：将两组股骨头标本用10 g/L多聚甲醛溶液固定，体积分数5%EDTA脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片；体积分数20%H₂O₂蒸馏水室温5-10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；切片浸入 0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，高压锅加热至沸腾后PBS洗涤一两次，进行抗原修复；体积分数5%BSA 37 ℃封闭 15 min；滴加稀释的一抗兔抗山羊Cx43 IgG(1∶200)，4 ℃过夜，PBS洗3次；滴加辣根过氧化物酶偶联的兔抗山羊二抗IgG1(1∶10 000) 37 ℃ 20 min；PBS洗3次；滴加试剂SABC，37 ℃ 15 min，PBS 3次；DAB显色，苏木精复染、脱水、透明和封固。光学显微镜下观察，以棕黄色染色为阳性，不着色者为阴性。

Western blot检测Cx43、碱性磷酸酶蛋白的表达：碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要标志，是骨代谢的重要蛋白质，其活性高低可反映成骨细胞成骨能力^[13]。按常规方法提取股骨头总蛋白，用BCA法将样本总蛋白质量浓度为 5 g/L。加入适当比例的5×SDS上样缓冲液，95 ℃变性 10 min；制备10%的分离胶(SDS-PAGE)及5%的浓缩胶(SDS-PAGE)，电泳 80 V 30 min，120 V 60 min；转膜 (250 mA，60 min)；取出PVDF膜，室温下封闭1.5 h；TBST洗膜2次，每次5 min；孵育兔抗山羊Cx43多克隆抗体 (1∶1 000，Abcam，英国)、山羊抗兔碱性磷酸酶多克隆抗体(1∶1 500，Abcam，英国)、羊抗兔GAPDH多克隆抗体( 1∶1 000，Abcam)4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。室温密封孵育licor红外荧光染料标记的二抗(1∶15 000) 1 h, 密封洗膜3次，每次10 min。采用Odyssey红外荧光成像系统进行扫膜，并用Odyssey系统软件进行条带灰度的数据采集，将Cx43/GAPDH，碱性磷酸酶/GAPDH的比值作为蛋白表达水平的参数，对Cx43和碱性磷酸酶进行相对定量分析。

主要观察指标：各组Cx43免疫组织化学染色结果，各组Cx43和碱性磷酸酶蛋白的表达。

统计学分析：应用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计学处理，计量结果以x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用两样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

激素性股骨头缺血性坏死的其发病机制至今尚未完全阐明，而细胞凋亡依然是研究的热点、难点^[14]。近年来国内外实验研究表明在激素作用下，骨细胞、成骨细胞、软骨细胞存在凋亡，而细胞凋亡受到多因素的调节^[15-17]。Moraes等^[18]认为激素能与骨细胞、成骨细胞及破骨细胞表面的骨细胞/成骨细胞特异性类固醇脱氢酶受体结合，引起构象变化，把激素转化为无活性代谢产物。暴淑英等^[19]发现，激素性骨坏死Bcl-2蛋白的表达较对照组明显减少，而Bcl-2蛋白能阻断细胞凋亡信号传递系统从而抑制细胞凋亡。由此认为大剂量激素可能通过抑制Bcl-2蛋白表达引起股骨头坏死。Kogianni等^[20]研究显示地塞米松通过上调Fas蛋白在骨细胞胞膜上的定位，Fas的配体FasL与Fas结合后会引发Caspase级联反应从而调节骨细胞凋亡。大量的研究表明糖皮质激素可通过多条信号通路对骨组织细胞进行调控，诱导骨细胞和成骨细胞凋亡，导致负重区骨小梁碎裂，发生微骨折，股骨头塌陷、最终引起股骨头坏死。而骨组织细胞间的信号调控依赖于细胞间的间隙连接。

在正常骨组织中，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞，均表达Cx43蛋白，并在彼此间形成间隙连接, 使得骨组织所有细胞形成一个整体网络，通过感应骨组织的微小损伤和机械应力来完成修复反应，包括代偿性的骨增加或减少。其构成的细胞间隙连接通道可在细胞间介导低分子质量的离子或小分子物质如：cAMP，Ca²⁺，IP₃及siRNA、前列腺素E2，一氧化氮、ATP等产物通过，并与细胞骨架因子、酶(激酶及磷酸酶)等相互作用，对控制细胞生长、分化等方面起着重要作用^[21-22]。

Chung等^[23]敲除小鼠成骨细胞Cx43基因后,发现成骨细胞的间隙连接信号通讯降低，骨生成受限，并伴随骨量减少。Bivi等^[24]实验结果亦发现Cx43蛋白缺失可引起骨组织中细胞与细胞之间的连接信号降低，同时伴有骨吸收增加，骨量丢失。Siller-Jackson等^[25]实验发现骨组织细胞通过Cx43半通道释放PGE2，进而激活PI3K/Akt与cAMP-PKA信号通路，调控Cx43转录，使Cx43的表达量增加。Niger等研究显示MAPK/ERK及PKC信号通路位于Cx43下游，Cx43高表达，可激活MAPK/ERK及PKC，促进成骨细胞分化相关基因的转录。反之，则抑制MAPK/ ERK及PKC信号通路，成骨相关基因的转录减少^[26-27]。也有研究认为和Wnt经典信号通路相关，促进β-catenin的累积，激活成骨分化，增加骨的矿化^[28]。Wnt经典信号通路的激活，又可以促进Cx43的表达^[29]。已有研究表明Cx43蛋白可通过调节多条信号通路对骨组织细胞的分化及凋亡进行调节，Cx43蛋白与骨组织细胞的生长、分化、凋亡具有密切关系^[30-49]。

Kitase等^[50]进一步研究发现，骨细胞Cx43半通道释放PGE2还可以通过β-catenin和PKA通路抑制由糖皮质激素诱导的骨细胞、成骨细胞凋亡，提示实验激素导致的股骨头坏死可能与Cx43蛋白相关联，而相关研究在国内外未见有文献报道。

实验免疫组织化学结果提示Cx43蛋白主要表达与成骨细胞和骨细胞胞浆中，同时亦表达与骨髓间质中，而在模型组中骨细胞、成骨细胞Cx43蛋白表达明显减少，这可能由激素诱导骨细胞、成骨细胞凋亡，导致细胞量减少所致。Western blot结果进一步发现模型组中Cx43蛋白的表达低于对照组。同时，激素性股骨头坏死中碱性磷酸酶表达明显低于正常组，说明在模型组织中成骨细胞活性及分化能力降低。结合原有研究结果，实验认为在激素性股骨头坏死模型中：Cx43表达下降、成骨细胞分化能力减弱、股骨头坏死3者之间密切相关，糖皮质激素通过诱导成骨细胞及骨细胞凋亡，Cx43间隙连接受到抑制，破坏骨细胞间信息、能力的正常传递网络，导致股骨头骨量减少，可能最后导致股骨头坏死和塌陷。

综上所述，Cx43蛋白表达下降及Cx43蛋白功能抑制可能参与激素性股骨头坏死的病理过程。由此实验推论：在股骨头坏死进程中是否可通过调控Cx43基因及其相关下游信号通路，提高Cx43蛋白表达，从而起到延迟或阻断骨量丢失。因此，对其机制进行进一步的研究将对激素性股骨头坏死发疾病机制起重要作用。

激素性股骨头缺血性坏死模型兔股骨组织中间隙连接蛋白Cx43的表达

Cx43 expression in the femur of rabbit models of steroid-induced vascular necrosis of the femoral head

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