血小板衍化生长因子DD刺激大鼠肾成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (11): 1688-1693.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.010

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

血小板衍化生长因子DD刺激大鼠肾成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转化

赵佳¹，孙建平¹，高延霞²，唐妮娜¹，牛蒙¹，崔萌¹，韩晓庆¹，隋爱华³

青岛大学附属医院，¹肾病科，³中心实验室，山东省青岛市 266003；²山东大学齐鲁医院(青岛)泌尿内科，山东省青岛市 266035

修回日期:2015-02-17 出版日期:2015-03-12 发布日期:2015-03-12
通讯作者: 孙建平，青岛大学附属医院肾病科，山东省青岛市 266003
作者简介:赵佳，女，1990 年生，山东省聊城市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主要从事肾小管间质纤维化方面的研究。并列第一作者：孙建平，硕士，主任医师，主要从事肾小管间质疾病方面的研究。
基金资助:
青岛市科技计划基础研究项目[11-2-4-2-(12)-jch]

Platelet-derived growth factor-DD induces the proliferation and differentiation of rat renal fibroblasts into myofibroblasts

Zhao Jia¹, Sun Jian-ping¹, Gao Yan-xia², Tang Ni-na¹, Niu Meng¹, Cui Meng¹, Han Xiao-qing¹, Sui Ai-hua³

¹Department of Nephrology, ³Central Laboratory, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; ²Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University, Qingdao 266035, Shandong Province, China

Revised:2015-02-17 Online:2015-03-12 Published:2015-03-12
Contact: Sun Jian-ping, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Zhao Jia, Studying for master’s degree, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Sun Jian-ping, Master, Chief physician, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Zhao Jia and Sun Jian-ping contributed equally to this work.
Supported by:
the Basic Research Project of Qingdao Science and Technology Plan, No. 11-2-4-2-(12)-jch

摘要/Abstract

摘要：

背景：血小板衍化生长因子可诱导肾小球系膜细胞及肾间质多种细胞增殖、迁移、转化及细胞外基质的过表达。

目的：观察血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路激活对大鼠肾成纤维细胞细胞增殖及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。

方法：体外培养正常大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)，按照血小板衍化生长因子DD刺激质量浓度分为对照组、1 μg/L组、10 μg/L组、50 μg/L组、100 μg/L组，然后根据50 μg/L 血小板衍化生长因子DD刺激不同时间分为对照组、12 h组、24 h组、48 h组。CCK8检测不同血小板衍化生长因子DD质量浓度及血小板衍化生长因子DD作用不同时间对NRK-49F增殖的影响；Real-time PCR检测各质量浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白mRNA变化；Western blot检测各浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达变化。

结果与结论：与对照组相比，血小板衍化生长因子DD可明显刺激NRK-49F细胞增殖，呈现剂量依赖性及时间依赖性。血小板衍化生长因子DD可剂量依赖性刺激其相应血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白在mRNA水平及蛋白水平上的表达增加。提示血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路的激活可显著刺激NRK-49F细胞的增殖及向肌成纤维细胞的转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 成纤维细胞, 肾间质纤维化, 大鼠, 肾成纤维细胞, 血小板衍化生长因子DD, 细胞增殖, 肌成纤维细胞, α-平滑肌肌动蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-derived growth factors can induce proliferation, migration, transformation and extracellular matrix expression of glomerular mesangial cells and renal interstitial cells.

OBJECTIVE: To investigate the effect of activation of platelet-derived growth factor-DD/βR signaling pathway on the proliferation and α-smooth muscle actin expression in rat renal fibroblasts.

METHODS: Normal rat kidney interstitial fibroblasts (NRK-49F) cultured in vitro were divided into the following groups by platelet-derived growth factor-DD concentrations: control, 1 μg/L, 10 μg/L, 50 μg/L, 100 μg/L. And NRK-49Fs were then divided into four groups according to the stimulation time of 50 μg/L platelet-derived growth factor-DD:control, 12 hours, 24 hours, 48 hours. The cell viability of the NRK-49Fs was assessed by Cell Counting Kit-8 after platelet-derived growth factor-DD administration. The mRNA and protein expression levels of platelet-derived growth factor-βR and α-smooth muscle actin in all groups stimulated by different concentrations of platelet-derived growth factor-DD were determined by RT-PCR and western blot, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Platelet-derived growth factor-DD could facilitate the proliferation rates of the NRK-49Fs at a dose- and time-dependent manner as compared with the control groups. Platelet-derived growth factor-DD could stimulate the mRNA and protein expressions of platelet-derived growth factor-βR and α-smooth muscle actin in a dose-dependent manner. This suggest that the activation of platelet-derived growth facto-DD/βR signaling pathway can obviously promote the proliferation of NRK-49Fs as well as tranformation into myofibroblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Kidney, Fibrosis, Fibroblasts, Phenotype, Receptors, Platelet-Derived Growth Factor

中图分类号:

R318

赵佳，孙建平，高延霞，唐妮娜，牛蒙，崔萌，韩晓庆，隋爱华. 血小板衍化生长因子DD刺激大鼠肾成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1688-1693.

Zhao Jia, Sun Jian-ping, Gao Yan-xia, Tang Ni-na, Niu Meng, Cui Meng, Han Xiao-qing, Sui Ai-hua . Platelet-derived growth factor-DD induces the proliferation and differentiation of rat renal fibroblasts into myofibroblasts [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1688-1693.

图/表（结果） 4

2.1 血小板衍化生长因子DD对NRK-49F增殖的影响 与对照组比较，不同质量浓度的血小板衍化生长因子DD均可明显促进NRK-49F的增殖，差异有显著性意义(P < 0.05)。 1 μg/L时即可促进细胞增殖，50 μg/L时，其促NRK-49F增殖作用最强，50 μg/L组与100 μg/L组比较差异无显著性意义(P > 0.05，表2)。

此外，与对照组相比，血小板衍化生长因子在作用12 h时即有明显促进NRK-49F增殖的作用，随着时间延长，致观察终点(48 h)细胞增殖效应最大，呈现时间依赖性(P < 0.05，表3)。

2.2 不同质量浓度血小板衍化生长因子DD对血小板衍化生长因子β R、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达的影响 血小板衍化生长因子DD主要与血小板衍化生长因子ββR结合，仅少量结合于血小板衍化生长因子αβR与其相应血小板衍化生长因子β R结合后激活信号传导通路，产生生物学效应。α-平滑肌肌动蛋白是活化的肌成纤维细胞的特异性标志，少见于正常肾间质细胞。

与对照组比较，各质量浓度组血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白均高于对照组(P < 0.05)；除50 μg/L组与100 μg/L组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余各处理组间比较血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白表达均不同(P < 0.05)。另外，血小板衍化生长因子DD质量浓度在1 μg/L时即可明显上调血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达，并可剂量依赖性地上调血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达，维持该通路的活化状态，随血小板衍化生长因子DD质量浓度增大，表达量逐渐增多(P < 0.05)，50 μg/L与100 μg/L组比较无明显差异(图1A)。RT-PCR电泳图(图1B)呈现与上述一致的结果，随血小板衍化生长因子DD质量浓度增大，血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达量增加，至血小板衍化生长因子DD 50 μg/L时mRNA表达量最大， 50 μg/L与100 μg/L组比较差异无显著性意义。 2.3 血小板衍化生长因子DD对血小板衍化生长因子β R、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达影响 与对照组相比，血小板衍化生长因子DD可剂量依赖性地上调血小板衍化生长因子R、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达。1 μg/L血小板衍化生长因子DD即可明显上调血小板衍化生长因子βR及 α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达，随血小板衍化生长因子DD质量浓度增大，血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白表达量逐渐增多(图2)，至50 μg/L时血小板衍化生长因子β、α-平滑肌肌动蛋白表达最多，50 μg/L与 100 μg/L组比较无明显差异。

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照细胞学实验

时间及地点：实验于2014年4至10月在青岛大学附属医院中心实验室完成。

实验方法：

NRK-49F细胞的培养：用含体积分数10%FBS的1640培养基培养细胞，待细胞生长至90%融合，即弃去培养液，用PBS(不含钙，镁离子)洗一两次。然后加入1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA)于培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，细胞开始皱缩，细胞之间的间隙开始变大后立即吸出消化液，用含体积分数10%FBS的1640培养基终止消化，按照1∶2或1∶3进行传代。取生长良好的第3-8代细胞进行实验。

血小板衍化生长因子DD对NRK-49F增殖的浓度效应：取生长良好的3-8代细胞，消化后用含体积分数10%FBS的培养基重悬细胞，接种于96孔培养板上，每孔100 μL，数量约1×10⁴/孔，37 ℃，体积分数5%CO₂恒温箱培养，待细胞贴壁24 h后弃掉板中培养基，每孔加入含体积分数0.1%FBS的培养基100 μL至恒温箱中同步12 h，使细胞进入静止期。12 h后换用新的含体积分数10%FBS的培养基，按照血小板衍化生长因子DD终浓度分组，分别是对照组、1 μg/L组、10 μg/L组、50 μg/L组、100 μg/L组，每组设置5个复孔，同时设置空白调零孔(只含有培养液、CCK-8溶液)，刺激24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育4 h后于酶标仪上检测每孔450 nm处吸光度值，按下式将A值转换为增殖率：增殖率/(%)=[(实验-空白)-(对照-空白)]/[(对照-空白)]×100%。

血小板衍化生长因子DD对NRK-49F细胞增殖的时间效应：如血小板衍化生长因子DD对NRK-49F增殖的浓度效应研究所述重悬、接种细胞并同步化后，换用新的含体积分数10%FBS培养基并加入血小板衍化生长因子DD干预，每孔终浓度均为50 μg/L，按照不同干预时间分为对照组，12 h组、24 h组、48 h组，每组5个复孔，不同组分别培养上述时间后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育4 h后检测每孔450 nm处吸光度值，同样方法计算细胞增殖率。

RT-PCR检测不同质量浓度血小板衍化生长因子DD干预后血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白mRNA的表达：实验用对数生长期的3-8代细胞，将细胞重悬于含体积分数10%FBS的培养基中，取2 mL细胞悬液于6孔板中(数量约1×10⁵/孔)，按照上述方法同步化，按照血小板衍化生长因子DD质量浓度分为对照组、1 μg/L组、10 μg/L组、50 μg/L组、100 μg/L组。加入不同质量浓度血小板衍化生长因子DD干预24 h后按照RNAiso Reagent说明书提取总RNA，分光光度计测定总RNA浓度和纯度，A(260 nm)/ A处于1.8-2.0之间符合要求。cDNA的合成采用20 μL反转录反应体系，根据GenBank资料设计引物(见表1)。 (280 nm)

用制备的标准品作为模板，确定最佳反应体系和反应条件，以GAPDH作为内参物，进行SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR扩增，总反应体系为20 μL，其中包含SYBR Premix Ex Taq酶10 μL，cDNA2 μL，上、下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s扩增40个循环。

每0.2 ℃读板1次，绘制熔解曲线和扩增曲线，收集数据，结果根据2-^△△^Ct值反映出此基因在不同样本中的相对表达水平。另外取扩增产物5 μL，在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察。

??Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)_实验组-(Ct目的基因- Ct管家基因)_对照组。

Westernblot检测不同质量浓度血小板衍化生长因子DD对血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达：血小板衍化生长因子DD干预与分组同RT-PCR检测，干预24 h后提取总蛋白，蛋白提取过程于冰上操作。BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样量为50 μg，逐步进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳结束后转至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2 h；一抗4 ℃过夜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1.5 h，加入ECL发光剂1 mL显像，实验重复3次。

主要观察指标：①血小板衍化生长因子DD刺激正常大鼠肾成纤维细胞增殖的浓度效应及时间效应。②不同质量浓度血小板衍化生长因子DD对该细胞血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白在mRNA及蛋白水平上表达的影响。

统计学分析：实验数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间均数比较用方差分析，两两比较应用LSD-t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

肾间质纤维化是以肾小管萎缩或扩张，肾间质炎性细胞浸润，肌成纤维细胞形成与积聚以及细胞外基质在肾间质中过度沉积为特征的不可逆的发展过程^[7]，被认为是比肾小球硬化更能引起肾脏功能不断恶化的驱动力量^[8]。肌成纤维细胞是肾间质中过度积聚的细胞外基质的主要来源^[5^，^9]。阐明肌成纤维细胞的活化机制并以此为靶目标实施干预，是目前阻遏肾间质纤维化的重要研究内容。

血小板衍化生长因子家族是强有力的促有丝分裂剂，属于细胞生长因子范畴，包括血小板衍化生长因子AA、AB、BB、CC、DD 5种亚型及血小板衍化生长因子α、β两种受体^[6^，^10]。血小板衍化生长因子最先在血小板α颗粒中发现，血小板衍化生长因子DD是较晚发现的一种亚型，其主要与血小板衍化生长因子ββ受体结合，也可少量结合于血小板衍化生长因子αβ受体。

在人类正常肾脏中，血小板衍化生长因子DD主要由系膜细胞、血管平滑肌细胞、小管上皮细胞等表达，当组织受到损伤后，这些细胞可过量表达血小板衍化生长因子DD并通过自分泌或者旁分泌形式发挥作用，与相应合成增多的受体相结合后，通过激活下游信号通路，导致肾间质纤维化的发生、发展^[11-12]。

本课题前期研究发现，在建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型3 d后大鼠肾脏中，血小板衍化生长因子DD即可过表达于肾间质，尤以萎缩、膨胀的肾小管周围显著，并随梗阻时间延长表达增多^[11]，证实在肾间质纤维化早期即有血小板衍化生长因子DD参与，随着肾纤维化程度的加重，其作用更加显著。

Ostendorf等^[12]提出血小板衍化生长因子DD可以促进肾小球系膜细胞增殖。本实验通过细胞培养发现，NRK-49F在受到不同质量浓度血小板衍化生长因子DD刺激后，呈现浓度依赖性的细胞增殖表现，另外给予血小板衍化生长因子DD干预12 h后，NRK-49F即呈现明显增殖，并呈现时间依赖性，致观察终点48 h时，细胞增殖率最大。说明血小板衍化生长因子DD在肾间质纤维化早期即可发挥促进NRK-49F增殖的作用，并随肾间质纤维化时间延长，细胞数量不断增加。

血小板衍化生长因子βR正常情况下仅少量表达于系膜细胞、间质细胞、肾小球上皮细胞等，血小板衍化生长因子DD与血小板衍化生长因子ββR结合后，主要通过PI3-K、Ras-MAPK、PLC、JAK-STAT等信号通路发挥生物学效应。

本实验发现应用1 μg/L血小板衍化生长因子DD刺激细胞，即出现血小板衍化生长因子βR mRNA水平及蛋白水平的明显提高，随着血小板衍化生长因子DD干预质量浓度增大，血小板衍化生长因子βR表达增强。说明血小板衍化生长因子DD可上调血小板衍化生长因子βR表达并与之结合，进而通过血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号转导通路的激活促进NRK-49F的增殖与活化。

生理状态下，肾固有成纤维细胞主要存在于肾间质中并维持间质及邻近组织的动态平衡(细胞增殖、细胞外基质分泌等)，多种因素可刺激固有成纤维细胞活化，使之转变为肌成纤维细胞^[13]。活化的肌成纤维细胞可侵入肾小球及肾小管周围区域，获得更强的细胞增殖和分泌细胞外基质的能力，成为肾间质纤维化过程中细胞外基质的主要来源，因兼具平滑肌细胞的特性而具有收缩性^[14]。

α-平滑肌肌动蛋白是肌成纤维细胞的特异性标志物，被认为是判断肾间质纤维化的发生、发展和多种慢性肾脏病预后的重要指标。与固有成纤维细胞相比，肌成纤维细胞除了细胞外基质表达增加、细胞外基质降解酶合成减少之外，最显著的差异在于其表达α-平滑肌肌动蛋白明显高于固有成纤维细胞^[15-16]。另外，一些IgA肾病、糖尿病肾病、肾移植后排斥、新月体肾炎的研究证实肌成纤维细胞的出现、持续存在、数量以及α-平滑肌肌动蛋白的表达量直接影响肾间质纤维化的程度，并呈现正相关。α-平滑肌肌动蛋白表达越多，肾功能下降的速度越快，预后越差^[17]。

对经典单侧输尿管梗阻模型(UUO)肾间质纤维化初始阶段固有成纤维细胞的归宿研究发现，UUO模型建立后第1天大鼠肾脏固有成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白，随着时间延长，逐渐获得肌成纤维细胞表型，细胞增殖分裂速度明显增加。

本实验通过体外研究发现，α-平滑肌肌动蛋白在mRNA及蛋白表达水平上均随血小板衍化生长因子DD刺激质量浓度的增大而不断增加，在1 μg/L水平即可出现明显统计学差异，提示血小板衍化生长因子DD可剂量依赖性的刺激固有成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，加速了肾间质纤维化的发展。因其肾脏病早期即可明显增加，早前即有人提出可以将α-平滑肌肌动蛋白作为监测慢性肾脏疾病发生的重要指标^[18]。

通过本实验可以明确的是在肾间质纤维化发生、发展过程中，NRK-49F血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路是一条重要的促纤维化途径，因而通过阻断这一转导途径，可降低固有成纤维细胞的增殖、向肌成纤维细胞的转化，减少细胞外基质的沉积，从而延缓肾间质纤维化的发展。

Boor等^[19]首次发现应用血小板衍化生长因子DD特异性抗体CR002可显著降低血小板衍化生长因子DD所致NRK-49F增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质表达，但CR002对血小板衍化生长因子BB无明显拮抗作用。然而，CR002虽可下调大鼠血小板衍化生长因子DD的表达，但对于血小板衍化生长因子β受体无明显抑制作用。

另外，早期的一项研究表明，曲匹地尔作为一种非特异性的血小板衍化生长因子拮抗药物，使得肾毒性肾炎的兔子模型或者缺血再灌注的大鼠模型的肾脏损伤更为严重，表现出明显的肾毒副作用^[20]。一些血小板衍化生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂疗效也并非理想，几乎所有的酪氨酸激酶拮抗剂仅仅是相对地对于血小板衍化生长因子信号通路的拮抗有一定疗效，例如像伊马替尼这类药物主要还是发挥拮抗c-Abl激酶的作用，而对于酪氨酸激酶的抑制作用相对较弱^[20]，就其所带来的的心肌毒性以及其作为多靶点酪氨酸激酶拮抗剂潜在的肾毒性来说，这些副反应确实阻碍了该类药物在临床治疗肾纤维化中的广泛应用^[21]。

因此，寻找更为有效且靶向作用强的血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路阻断剂成为当下研究的难题。本课题前期研究已证实丹参酮ⅡA磺酸钠与依那普利治疗可抑制大鼠肾组织中血小板衍化生长因子DD表达，并使对肾脏具有保护作用的血红素加氧酶1表达量上调，从而抑制肾纤维化的进展^[22]，另有研究表明丹参酮ⅡA磺酸钠可抑制肾间质纤维化来源的成纤维细胞的体外增殖^[23]，提示或许在中医中药领域也可以获得更为有效的延缓肾间质纤维化发展的治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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