成骨细胞增殖和钙盐沉积能力：在接骨七厘片药物溶液中的反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：接骨七厘片是促进骨折愈合、临床疗效较好的复方中药，但其作用机制尚不十分清楚。

目的：观察接骨七厘片药物溶液对成骨细胞增殖和钙盐沉积能力的影响。

方法：以体外培养的MC3T3-E1成骨细胞为研究对象。①常规培养24 h更换无血清DMEM培养液，饥饿培养24 h同步化细胞周期，弃去培养液，实验组每孔加入100 μL含接骨七里片药物溶液的DMEM完全培养基，对照组加入DMEM完全培养基，于培养24 h和48 h使用MTS一步法检测细胞增殖活力。②以1×10⁵密度接种MC3T3-E1细胞于96孔板，培养4 h更换成骨诱导培养液，诱导21 d进行茜素红染色观察MC3T3-E1细胞的钙盐沉积能力，对照组细胞不进行成骨诱导。

结果与结论：在培养24 h和48 h，接骨七厘片药物实验组细胞增殖程度均较对照组上调(P < 0.05)；成骨诱导21 d后，茜素红染色发现接骨七厘片药物实验组钙盐结节生成明显多于对照组(P < 0.01)。以上结果表明接骨七厘片药物溶液能够明显促进成骨细胞增殖和钙盐沉积能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨细胞, 接骨七厘片, 骨折, 成骨细胞增殖, 钙盐沉积

Abstract:

BACKGROUND: Jiegu Qili Tablet is a compound Chinese medicine which can promote fracture healing, but its mechanism is still unclear.

OBJECTIVE: To observe the effects of Jiegu Qili Tablet on the proliferation and mineralization of MC-3T3 cells.

METHODS: MC-3T3 cells cultured in vitro were selected. (1) After 24 hours of routine culture, cells were cultured in serum-free DMEM for another 24 hours to synchronize cell cycles. Then, the culture solution was removed, and cells were cultured in DMEM complete medium with (experimental group) or without (control group) Jiegu Qili Tablet solution. At 24 and 48 hours of culture, MTS assay was used to detect the proliferative ability of cells. (2) In the experimental group, MC3T3-E1 cells at a density of 1×10⁵ were inoculated into 96-well plates, and after 4 hours of culture, cells were cultured in an osteogenic induction medium. After 21 days of osteogenic induction, the mineralization of MC3T3-E1 cells was examined using alizarin red S staining. Cells in the control groups were treated without osteogenic induction.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the cell proliferation rate was up-regulated in the experimental group at 24 and 48 hours after culture (P < 0.05), and the number of calcium nodules was also larger in the experimental group at 21 days after osteogenic induction (P < 0.01). These findings indicate that Jiegu Qili Tablet solution can up-regulate the proliferation and mineralization of MC-3T3 cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Osteoblasts, Cell Proliferation, Fracture Healing, Drugs, Chinese Herbal

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2007年3月至2012年5月在辽宁医学院科学实验中心和沈阳市第一人民医院骨科实验室完成。

材料：

实验方法：

药物制备：将接骨七厘片除去糖衣、研细，加水2 mL，振摇3 min，经0.22 μm滤膜滤过除菌制含原生药0.15 g/mL药物溶液。按每毫升完全培养液添加1 μL药物溶液的比例配制药物质量浓度为0.15 g/L的含药培养液。将1.369 2 g茜素红溶于100 mL PBS中，调节pH值到4.1-4.3制成茜素红染色液。

MC3T3-E1细胞的体外培养：MC3T3-E1细胞复苏，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基，置于体积分数为5%CO₂培养箱中37 ℃培养至80%汇合度时经0.25%胰酶消化3 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1∶3比例传代至新的培养瓶中继续培养。

MTS一步法检测细胞增殖活力：常规培养MC3T3-E1细胞至对数生长期，0.25%胰酶消化细胞3 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中和胰酶，吹打成单细胞悬液。应用血球计数板计数细胞，按5 000个细胞/孔密度接种于96孔板，培养24 h细胞贴壁后弃去原培养液，更换无血清DMEM培养液，饥饿培养24 h同步化细胞周期。弃去培养液，实验组每孔加入100 μL含接骨七里片药物溶液的DMEM完全培养基，对照组加入DMEM完全培养基，于培养24 h和48 h进行细胞增殖活力检测：弃原培养液，每孔加入100 μL完全DMEM培养液和20 μL CellTiter 96^®AQueous One Solution Reagent，培养2 h，以495 nm为测定波长测定吸光度值，每组4个复孔。

茜素红染色法检测细胞钙盐沉积能力：MC3T3-E1细胞以1×10⁵密度接种于96孔板，培养4 h细胞贴壁后更换成骨诱导培养液(含β-磷酸甘油10 mmol/L，抗坏血酸盐 50 g/L)，每3 d更换1次培养液，培养21 d诱导培养完成后进行茜素红染色：40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入 40 mmol/L茜素红染色液，室孵育20 min，去离子水漂洗4次，弃去液体，室温晾干后显微镜下观察、计数并拍照记录。

主要观察指标：①接骨七厘片对MC3T3-E1细胞增殖的影响。②接骨七厘片对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响。

统计学分析：所有数据采用GraphPad Prism 6.0统计学软件处理，用t 检验比较两个独立样本组间均数，用方差分析进行多组的组间比较。P < 0.05为差异有显著性意义，P > 0.05为差异无显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

中医理论认为，骨骼的生长和功能均依赖气血的推动和滋养，骨折后筋脉势必同时受伤，脉络受伤，气血离经妄行，致血瘀气滞，血不活则瘀不去，瘀积不散则为肿、为痛。气血不通则不能充养筋骨，致使骨不能接，故骨折复位后治宜活血散瘀、接骨续筋，为骨折断端及早生长接续创造条件。

历代中医验方中，常用的几味中药为当归、乳香、没药、大黄、骨碎补、自然铜、血竭。目前常用的骨伤科中成药均以此为组方基础。接骨七厘片也是在此基础上作适

当改进，主要由乳香、当归、血竭、没药、大黄、自然铜、骨碎补、土鳖虫等组成，是骨伤科理想用药。接骨七厘片依据患者的临床症状进行立法选药，取用通行血脉、改善血行、消散瘀血、强骨续筋等药物组成纯中药复方制剂，方中当归能补血、活血、止痛，土鳖虫破血、逐瘀、续筋接骨、化瘀生新，乳香、没药相须为用，活血祛瘀、行气止痛，瘀去络通，血竭有抗真菌、止血作用，大黄能清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经。骨碎补、自然铜有强骨、接骨、续骨之功效。诸药合用，共奏活血化瘀、止痛强骨之效，临床用于骨伤后止痛、化瘀、消肿，加速骨折修复重建过程，为早期功能锻炼提供了条件，达到有效的治疗目的^[8]。

现代药理学也表明，诸味中药合用，有助于骨折部位骨基质钙盐的沉积，有利于骨痂形成，同时还能促进骨生长因子及生长激素的分泌，有效促进骨折端的愈合^[9-12]。龙涛^[13]应用接骨七厘片治疗四肢骨折患者120例，随机分为对照组和治疗组各60例，其中对照组患者采用口服三七片治疗；治疗组患者采用口服接骨七厘片治疗，0.3 g/片，5片/次，2次/d，15 d为1个疗程。结果治疗组治愈率为53.3%，有效率为95.0%，均高于对照组(治愈率为15.0%，有效率为70.0%)，差异有显著性意义(P < 0.05)；治疗组患者无论是在肿胀、疼痛程度改善还是骨折愈合时间方面都明显优于对照组，而且未见不良反应发生，说明接骨七厘片在治疗四肢骨折方面临床疗效显著，而且安全性高。李遐方^[14]对胫腓骨延迟愈合患者给予口服接骨七厘片，2周为1个疗程，连续使用3个疗程，结果表明接骨七厘片促进胫腓骨下段延迟愈合具有良好的疗效。罗毅文等^[15]运用接骨七厘片对150例骨折患者进行了临床观察研究，结果表明接骨七厘片具有抗炎、镇痛、改变局部血循环及氧供给和促进骨折愈合的作用。

骨折愈合是一个复杂的病理生理过程，有多种生长因子参与并发挥着重要的作用，大量的研究表明，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、骨形态发生蛋白、转化生长因子等是促进血管内生以及骨合成代谢的重要耦联因子^[16-27]。

李恒等^[28]采用三点弯曲方法造成大鼠右胫骨中段闭合性骨折后，采用完全随机法分为3组：阿胶强骨口服液组、接骨七厘片组、生理盐水组，在灌胃药物后采用免疫组织化学方法检测大鼠右胫骨骨痂区血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2表达明显增加，说明阿胶强骨口服液和接骨七厘片在骨愈合早中期可通过调节血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2的表达，促进前成骨细胞和成软骨细胞的有丝分裂、血管内生以及骨的合成代谢达到促骨折愈合的作用。

张继东等^[29]研究表明壮筋续骨汤可能通过降低内源性骨形态发生蛋白7和胰岛素样生长因子1降解，增强其活性，发挥促进骨折愈合的作用。黄有荣等^[30]研究表明外用白脉软膏对骨折模型动物骨伤愈合过程具有明显的促进作用，其促进骨折愈合作用与调节骨痂处骨形态发生蛋白2及碱性成纤维细胞生长因子水平有关。王琴等^[31]研究表明愈骨胶囊能使骨痂生长、塑形提前，促进骨折愈合，可能与提高骨痂组织内血管内皮生长因子、转化生长因子β表达，完善骨痂内微血管重建有关。

冯伟等^[32]应用RT-PCR方法观察常用接骨单味中药含药血清对体外培养成骨细胞成骨相关基因的表达。结果显示单味中药在促进成骨细胞中cbfa1的表达以自然铜为最，其下依次为续断、当归、乳香、没药和地鳖虫，而骨碎补并没有促进cbfa1的表达；在促进成骨细胞骨形态发生蛋白2的表达中以续断和骨碎补为最，依次为当归、自然铜和没药，但是地鳖虫和乳香并没有促进骨形态发生蛋白2表达的功能；在促进胰岛素样生长因子的表达中，以乳香为最，依次当归、自然铜、续断，而骨碎补、地鳖虫和没药，却没有上调胰岛素样生长因子的表达，表明单味接骨中药可影响成骨相关基因的表达，但不同药物作用的基因靶点不同。

根据组织学研究，骨愈合的主要生物学演变过程包括以下几个自然分期^[33-35]：①骨损伤早期：局部幸存细胞被激活，它们能很好地担负起全身和局部的信使作用，传递创伤刺激，提高骨折后局部细胞反应，从而促进骨折愈合。②血肿形成期：骨折后的出血填充在骨折的两断端及周围组织间，形成血肿，其中的纤维素网有如支架一样，使新生毛细血管及增生的纤维母细胞容易长入血肿内，使血肿逐渐吸收和机化。③肉芽组织形成期：在局部介质作用下，原始细胞开始增殖分化形成新生毛细血管、纤维母细胞、支持细胞和其他细胞等，所有这些细胞、细胞间质和血管共同构成肉芽组织长入血肿内，使血肿逐渐吸收和机化。④骨痂形成期：随着细胞的进一步增殖、分化，在肉芽组织内开始生成新软骨细胞和成骨细胞，并合成基质，1周后便开始钙化，几周后出现骨折端骨痂。⑤骨重建和塑型期。在骨折愈合的整个过程中，以上各个时期是互相交叉重叠、连续不断的过程。接骨七厘片药理特性在早期为活血化瘀和消炎止痛，在中期能够加速骨折愈合，而后期主要能够增强骨痂强度的作用^[36-37]。动物实验证实接骨七厘片可刺激骨折局部毛细血管网形成，增加成骨细胞数目，使骨折愈合时间提前，并使骨痂质量提高，抗折力增强，能促进骨折愈合。方中药物与药物之间的协同作用，增强了骨断端细胞修复和局部骨细胞代谢，促进新的毛细血管在骨断端的滋生和沟通，有利于骨痂的形成和骨细胞再生，故可缩短骨折愈合时间。研究表明局部的血液供应是影响骨折愈合的最根本因素，一切影响血液供应的因素都会影响骨折愈合，而血管的形成在骨折愈合中起着重要的新生作用，也是支持成骨细胞成骨所必需。

陈玲等^[38]实验数据证明，接骨七厘片可显著降低全血黏度及血浆黏度，改善血液流变性，使骨折部位的血供得到明显改善，而骨折处毛细血管再生活跃，可使局部血容量增加，血液供应丰富，加速血肿吸收、机化、促使纤维组织增生，纤维骨痂形成加快，成骨细胞再生活跃，可缩短纤维骨痂转变为骨性骨痂的过程。经组织学切片检查，也从新生肉芽组织、骨愈合性质、骨痂形成量及骨髓出现情况等方面证实了上述的观点。

有研究表明接骨七厘片能够在动物水平促进血液循环加速钙离子的吸收和沉积^[39]，增大骨小梁密度，促进骨痂形成的速度和质量^[40-41]。MC3T3-E1细胞呈成纤维细胞样，有多个亚克隆，可以作为体外研究成骨细胞分化的良好模型。周铜水等^[42]实验证明，骨碎补主要成分柚皮苷具有促进大鼠实验性骨损伤愈合作用。宋钦兰^[43]实验证明，骨碎补水煎液(0.02 g/L)具有体外增强MC3T3-E1细胞增殖作用。

本文以体外培养的MC3T3-E1细胞为研究对象，从细胞水平通过观察接骨七厘片药液对成骨细胞增殖和矿化能力的直接作用，对其促进骨折愈合可能的作用机制进行了初步探索。实验使用了比传统细胞增殖研究方法MTT效果更为稳定、方法更为简便的MTS一步法细胞活力检测试剂来研究细胞增殖情况。研究结果显示，接骨七厘片药物处理实验组细胞在24 h和48 h的495 nm吸光度值均显著大于对照组。MC3T3-E1细胞经成骨诱导培养液诱导21 d后，经茜素红染色可见细胞基质中形成形态、大小不一的矿化结节。接骨七厘片药物处理细胞的矿化结节数量明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

MC3T3-E1细胞在复苏时需要注意的问题：取出冷冻管后，须立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 min内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。在解冻之后，应直接放入含有 10-15 mL新鲜培养基的培养瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除二甲基亚砜即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

根据上述结果，作者推断促进成骨细胞增殖和矿化能力可能是接骨七厘片在临床上促进骨折愈合作用的两条途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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