人参皂苷Rg1与神经干细胞共培养的促增殖和保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1580-1584.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.019

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

人参皂苷Rg1与神经干细胞共培养的促增殖和保护作用

孙建忠¹，刘欣伟²，管华鹏¹，张鹏¹，刘琦¹，杨珺¹，郭群峰¹，倪斌¹

¹解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200003； ²解放军沈阳军区总医院骨科，全军重症战创伤救治中心，辽宁省沈阳市 110016

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 倪斌，博士，教授，主任医师，博士生导师，解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200003
作者简介:孙建忠，男，1981年生，山东省鄄城市人，汉族，解放军第二军医大学在读博士，主治医师，主要从事脊柱外科临床及实验研究。
基金资助:
上海市宝山区卫生青年医学人才培养计划项目(bswsyq-2014-A03)

Co-culture of ginsenosides Rg1 and neural stem cells: promoting proliferation role and protective effect

Sun Jian-zhong¹, Liu Xin-wei², Guan Hua-peng¹, Zhang Peng¹, Liu Qi¹, Yang Jun¹, Guo Qun-feng¹, Ni Bin¹

¹Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China; ²Department of Orthopedics, General Hospital of Shenyang Military Region of Chinese PLA, Rescue Center of Severe Wound and Trauma of Chinese PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Ni Bin, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China
About author:Sun Jian-zhong, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China
Supported by:
the Young Medical Talents Cultivation Plan of Baoshan District of Shanghai, No. bswsyq-2014-A03

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明传统中药提取物对大鼠神经干细胞进行干预，能够反映其对神经系统的恢复和保护作用。

目的：探讨人参皂苷Rg1对神经干细胞的增殖和保护作用。

方法：将妊娠19 d左右的SD大鼠进行解剖取出胎鼠，然后分离海马组织提取神经干细胞，与含50 g/L人参皂苷Rg1的DMEM/F12培养基共培养作为人参皂苷Rg1组，正常DMEM/F12培养基培养的神经干细胞作为空白对照组，与含0.64%苯酚的DMEM/F12培养基共培养作为阳性对照组，MTT法检测各组神经干细胞的增殖情况，Western-blot方法检测各组神经干细胞脑源性神经营养因子和转化生长因子β蛋白的表达。

结果与结论：神经干细胞分离初期在镜下为圆形单个细胞，细胞的边缘比较清楚，接种2 d后，细胞贴壁并形成小的细胞球。人参皂苷Rg1组大鼠神经干细胞增殖率显著高于空白对照组(P < 0.05)，阳性对照组神经干细胞增殖率显著低于空白对照组(P < 0.05)。与空白对照组相比，人参皂苷Rg1组大鼠神经干细胞脑源性神经营养因子蛋白表达显著升高，转化生长因子β蛋白表达显著下降，以上结果提示人参皂苷Rg1对大鼠神经干细胞具有一定的促进增殖和保护作用。

1库：

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 人参皂苷Rg1, 培养, 脊髓损伤, 脑源性神经营养因子, 转化生长因子β, 神经保护

Abstract:

BACKGROUND: Chinese herb extracts can restore and protect the nervous system of rats through intervention of neural stem cells.

OBJECTIVE: To explore the role of ginsenosides Rg1 in the proliferation and protection of neural stem cells.

METHOD: Sprague-Dawley rats at pregnant 19 days were dissected to take out fetal rats, and then the hippocampal tissues from fetal rats were isolated to extract neural stem cells. Neural stem cells were co-cultured with DMEM/F12 medium containing 50 g/L ginsenosides Rg1 as intervention group, with DMEM/F12 medium as blank control group, and with DMEM/F12 containing 0.64% phenol as positive control group, respectively. MTT assay was used to detect the proliferation of neural stem cells in each group, and western blot method to detect the protein expression of brain-derived neurotrophic factor and transforming growth factor-β in neural stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Rat neural stem cells were round single cells with clear border at early period after isolation but at 2 days after inoculation, the cells were adherent and aggregated into small cell spheres. Compared with the blank control group, the proliferative rate of neural stem cells was significantly increased in the ginsenosides Rg1 group (P < 0.05), but decreased in the positive control group (P < 0.05). Compared with the blank control group, in the ginsenosides Rg1 group, the expression of brain-derived neurotrophic factor was elevated, and the expression of transforming growth factor-β was reduced, indicating ginsenosides Rg1 has a certain effect to promote the proliferation of neural stem cells as well as to protect the neural stem cells.

1库：

全文链接：

Key words: Ginsenosides, Spinal Cord Injuries, Neural Stem Cells, Cell Proliferation, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Transforming Growth Factor beta

中图分类号:

R394.2

孙建忠，刘欣伟，管华鹏，张鹏，刘琦，杨珺，郭群峰，倪斌. 人参皂苷Rg1与神经干细胞共培养的促增殖和保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1580-1584.

Sun Jian-zhong, Liu Xin-wei, Guan Hua-peng, Zhang Peng, Liu Qi, Yang Jun, Guo Qun-feng, Ni Bin. Co-culture of ginsenosides Rg1 and neural stem cells: promoting proliferation role and protective effect[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1580-1584.

图/表（结果） 7

参考文献

[1]All AH, Gharibani P, Gupta S, et al. Early intervention for spinal cord injury with human induced pluripotent stem cells oligodendrocyte progenitors. PLoS One. 2015;10(1): e0116933.
[2]Wu GA, Bogie KM. Effects of conventional and alternating cushion weight-shifting in persons with spinal cord injury. J Rehabil Res Dev. 2014;51(8):1265-1276.
[3]Long Y, Liang F, Gao C, et al. Hyperbaric oxygen therapy reduces apoptosis after spinal cord injury in rats. Int J Clin Exp Med. 2014;7(11):4073-4081.
[4]Didangelos A, Iberl M, Vinsland E, et al. Regulation of IL-10 by chondroitinase ABC promotes a distinct immune response following spinal cord injury. J Neurosci. 2014;34(49):16424- 16432.
[5]Horie N, Hiu T, Nagata I. Stem cell transplantation enhances endogenous brain repair after experimental stroke. Neurol Med Chir (Tokyo). 2015;55(2):107-112.
[6]Song L, Goldman E. Induced pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cell-like cells. J Biomed Res. 2015; 29(1):1-2.
[7]Kong SY, Park MH, Lee M, et al. Kuwanon v inhibits proliferation, promotes cell survival and increases neurogenesis of neural stem cells. PLoS One. 2015;10(2):e0118188.
[8]张蕾,李晓莉.神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养[J]. 中国现代医学杂志,2012,22(20):52-55.
[9]Gao J, Coggeshall RE, Tarasenko YI, et al. Human neural stem cell-derived cholinergic neurons innervate muscle in motoneuron deficient adult rats. Neuroscience. 2005;131(2): 257-262.
[10]Pluchino S, Cusimano M, Bacigaluppi M, et al. Remodelling the injured CNS through the establishment of atypical ectopic perivascular neural stem cell niches. Arch Ital Biol. 2010; 148(2):173-183.
[11]刘萍,涂彧. 表皮生长因子在新生大鼠神经干细胞培养中的作用[J].苏州大学学报:医学版,2010,30(2):310-312.
[12]Kan EM, Ling EA, Lu J. Stem cell therapy for spinal cord injury. Curr Med Chem. 2010;17(36):4492-4510.
[13]Tarasenko YI, Gao J, Nie L, et al. Human fetal neural stem cells grafted into contusion-injured rat spinal cords improve behavior. J Neurosci Res. 2007;85(1):47-57.
[14]Du C, Yang D, Zhang P, et al. Single neural progenitor cells derived from EGFP expressing mice is useful after spinal cord injury in mice. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2007;35(4):405-414.
[15]Gao J, Coggeshall RE, Tarasenko YI, et al. Human neural stem cell-derived cholinergic neurons innervate muscle in motoneuron deficient adult rats. Neuroscience. 2005;131(2): 257-262.
[16]Vishwakarma SK, Bardia A, Tiwari SK, et al. Current concept in neural regeneration research: NSCs isolation, characterization and transplantation in various neurodegenerative diseases and stroke: A review. J Adv Res. 2014;5(3):277-294.
[17]Lee N, Park JW, Kim HJ, et al. Monitoring the differentiation and migration patterns of neural cells derived from human embryonic stem cells using a microfluidic culture system. Mol Cells. 2014;37(6):497-502.
[18]Walker TL, Kempermann G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. 2014;(84): e51225.
[19]Mengarelli I, Barberi T. Derivation of multiple cranial tissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stem cells. Stem Cells Transl Med. 2013;2(2): 94-106.
[20]Pfaltzgraff ER, Mundell NA, Labosky PA. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. J Vis Exp. 2012;(64):e4134.
[21]Clarke L, Ballios BG, van der Kooy D. Generation and clonal isolation of retinal stem cells from human embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 2012;36(1):1951-1959.
[22]Nefzger CM, Su CT, Fabb SA, et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 2012;30(7):1349-1361.
[23]Wang D, Liang J, Zhang J, et al. Mild hypothermia combined with a scaffold of NgR-silenced neural stem cells/Schwann cells to treat spinal cord injury. Neural Regen Res. 2014;9(24): 2189-2196.
[24]Mannoji C, Koda M, Kamiya K, et al. Transplantation of human bone marrow stromal cell-derived neuroregenrative cells promotes functional recovery after spinal cord injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2014;74(4):479-488.
[25]Wang D, Zhang J. Effects of hypothermia combined with neural stem cell transplantation on recovery of neurological function in rats with spinal cord injury. Mol Med Rep. 2015; 11(3):1759-1767.
[26]Dong Y, Yang L, Yang L, et al. Transplantation of neurotrophin-3-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for the repair of spinal cord injury. Neural Regen Res. 2014;9(16):1520-1524.
[27]Yuan N, Tian W, Sun L, et al. Neural stem cell transplantation in a double-layer collagen membrane with unequal pore sizes for spinal cord injury repair. Neural Regen Res. 2014;9(10): 1014-1019.
[28]Najafzadeh N, Nobakht M, Pourheydar B, et al. Rat hair follicle stem cells differentiate and promote recovery following spinal cord injury. Neural Regen Res. 2013;8(36):3365-3372.
[29]Soejino A, Wihandani DM, Kuswardhani RA. Clinical applications of stem cell therapy for regenerating the heart. Acta Med Indones. 2010;42(4):243-257.
[30]Kelm JM, Breitbach M, Fischer G, et al. 3D microtissue formation of undifferentiated bone marrow mesenchymal stem cells leads to elevated apoptosis. Tissue Eng Part A. 2012;18(7-8):692-702.
[31]Zhu H, Li F, Yu WJ, et al. Effect of hypoxia/reoxygenation on cell viability and expression and secretion of neurotrophic factors (NTFs) in primary cultured schwann cells. Anat Rec (Hoboken). 2010;293(5):865-870.
[32]Li C, Chen X, Qiao S, et al. Melatonin lowers edema after spinal cord injury. Neural Regen Res. 2014;9(24):2205-2210.
[33]Lukovic D, Valdés-Sanchez L, Sanchez-Vera I, et al. Brief report: astrogliosis promotes functional recovery of completely transected spinal cord following transplantation of hESC-derived oligodendrocyte and motoneuron progenitors. Stem Cells. 2014;32(2):594-599.

引言

材料方法

设计：细胞水平观察实验。

时间及地点：实验于2014年7至11月在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：妊娠19 d左右的SD大鼠，由解放军第二军医大学动物实验中心提供，生产许可证SCXK(沪) X2012-0024，实验得到解放军第二军医大学长海医院实验动物伦理委员会批准。

药物：人参皂苷Rg1粉末购自国药试剂有限公司(主要成分为人参皂苷Rg1单体，其化学式为C₄₂H₇₂O₁₄，相对分子质量为801.01)，用生理盐水将人参皂苷Rg1粉末溶解成1 mg/L的溶液。

实验方法：

大鼠海马组织神经干细胞的分离提取：将大鼠脱颈处死，乙醇消毒，然后在无菌环境下用剪刀将大鼠的腹部剪开，剪下子宫，放入培养皿中用无菌的PBS冲洗2次，除去子宫外壁和胎鼠的胎盘，将胎鼠从胎盘上剥离开，用预冷的PBS将胎鼠进行冲洗，在无菌环境中用体视显微镜对胎鼠海马组织进行分离，分离海马组织后，用预冷的Hank’s液对海马组织进行漂洗，然后将海马组织浸泡在适量的DMEM/F12培养基内，用无菌眼科剪将海马组织剪成泥状，用5 mL移液器进行反复吹打，吹打后将培养基和海马的混悬液用200目的细胞筛进行过滤，将滤液收集到离心管内，以1 000 r/min的速度进行离心，离心后弃上清，用配置好的DMEM/F12培养基将细胞吹打分散后转移到培养皿中进行培养，每3 d换液1次，每6 d将细胞吹打分散后进行传代^[8-11]。

神经干细胞的鉴定：将细胞培养至第2代时，进行重悬，然后在培养皿内放入无菌的盖玻片进行培养，待1 d后细胞贴壁取出盖玻片收获细胞，用40 g/L多聚甲醛对细胞进行固定，然后进行Nestin免疫荧光染色鉴定^[12-15]。

神经干细胞增殖能力测定：将传代至第2代的神经干细胞以10⁵个/孔的密度转移到96孔板，与含50 g/L人参皂苷Rg1的DMEM/F12培养基进行共培养，以苯酚作为阳性对照，以用DMEM/F12培养基培养的神经干细胞作为空白对照组。培养3 d后加入MTT避光孵育4 h，弃上清液，然后加入二甲基亚砜，放入酶标仪内振荡5 min，进行细胞增殖能力检测。细胞增殖率=实验组细胞吸光度/空白对照组细胞吸光度×100%。

神经干细胞脑源性神经营养因子和转化生长因子β蛋白水平表达测定：将传代至第2代的神经干细胞培养3 d，加入含50 g/L人参皂苷Rg1的DMEM/F12培养基进行共培养作为人参皂苷Rg1干预组，以DMEM/F12培养基培养的神经干细胞作为空白对照组。共培养至第3天用Hank’s液洗3次，然后机械吹打神经干细胞，将神经干细胞悬液转移到离心管内，以1 000 r/min的速度进行离心，离心后弃上清，在细胞中加入裂解液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，以12 000 r/min的速度离心，用蛋白测定试剂盒测定细胞蛋白浓度，进行垂直电泳、湿转印，转印后加入一抗以 1∶1 000的浓度孵育过夜，二抗孵育2 h，然后加入显影液和定影液，放入化学凝胶成像系统进行拍照灰度值分析。

主要观察指标： ①神经干细胞的形态、鉴定。②人参皂苷Rg1干预后神经干细胞增殖能力变化。③人参皂苷Rg1干预后神经干细胞脑源性营养因子和转化生长因子β的蛋白表达水平。

统计学分析：采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，所有实验数据用x(_)±s表示，组间采用单因素方差分析，组间采用配对t 检验进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

神经干细胞的分离培养是目前已经比较成熟的细胞技术，主要是根据其表面上的抗原特异性进行标记鉴定^[16-17]。相关研究表明，神经干细胞的提取可来自脊髓、海马和大脑皮质等部位，神经干细胞的分离提取对环境的要求非常严格，必须在无菌的环境中对细胞进行分离提取^[18]。分离出的神经干细胞为原代细胞，在体外环境下原代细胞之间会产生相互影响进而产生一些促细胞生长的活性物质，如果细胞集中的密度过低细胞间的相互作用会很小，对细胞的成活率影响也就非常大，在一定的范围内增加细胞的密度会使细胞的增长速度增加，促进细胞的增长^[19-22]。

目前神经干细胞在脊髓损伤后的应用比较多，脊髓是机体重要的神经组织，是神经传导的重要部位，脊髓损伤后神经元受到损伤，导致神经传导受阻，会产生一系列的继发性损伤，严重者会危及生命^[23-25]。神经干细胞具有高分化性，当脊髓损伤后给予神经干细胞治疗，会使其向神经元分化，对神经元的修复再生具有非常大的治疗作用，对脊髓损伤的治疗和恢复具有非常重要的意义^[26-28]。

脑源性神经营养因子和转化生长因子β两个基因是脊髓损伤过程中比较关键的基因，首先转化生长因子β能够诱导胶质瘢痕的产生，转化生长因子β/Smads的信号通路在瘢痕增长和组织纤维化的过程中具有重要意义，参与肝脏组织纤维化、肾脏组织纤维化、肺脏组织纤维化、腹膜纤维化和瘢痕纤维化等，在脊髓组织的损伤过程中也具有非常重要的意义。近年来广大科学研究者将转化生长因子β信号通路联系到脊髓损伤后一些角质细胞瘢痕化相关领域上面。研究发现脊髓损伤大鼠脊髓内的星形胶质细胞的转化生长因子β呈现出高表达的状态^[29-30]。而脑源性神经营养因子属于神经性营养因子，在脊髓损伤后由胶质细胞大量分泌，起到保护神经的作用，在脊髓损伤恢复的过程中起到非常重要的作用^[31-33]。

本实验通过对神经干细胞的分离提取鉴定，成功的得到了原代神经干细胞。细胞增殖实验结果表明，人参皂苷Rg1组细胞增殖率显著大于空白对照和阳性对照组，说明人参皂苷Rg1具有促进神经干细胞生长增殖的作用。通过Western-blot方法检测大鼠神经干细胞的脑源性神经营养因子和转化生长因子β蛋白表达，结果表明人参皂苷Rg1组神经干细胞的脑源性神经营养因子蛋白表达量显著高于空白对照组，而转化生长因子β蛋白表达量显著低于空白对照组，说明人参皂苷Rg1对大鼠神经干细胞具有营养保护作用。

1库：

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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[1]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[4]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[5]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.