结直肠癌组织中DCLK1+/Ki67-肿瘤干细胞样细胞的形态和分布

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：DCLK1是在有丝分裂后的神经元中发现的一种跨膜微管相关蛋白激酶，近些年来发现其可能是肠道肿瘤干细胞的标志物。

目的：观察DCLK1与Ki67在结直肠肿瘤中的表达及其病理学意义，探讨是否可以将DCLK1⁺/Ki67^-作为结直肠癌肿瘤干细胞的标志物。

方法：运用免疫组织化学方法检测150例结直肠癌组织中DCLK1与Ki67的表达，并与正常肠黏膜组织、癌旁组织、腺瘤组织比较。

结果与结论：DCLK1和Ki67在癌组织中的表达率分别为36.7%，34.7%，其数量明显高于正常肠黏膜和腺瘤组织；DCLK1的表达与部位、浸润深度、淋巴结转移有关(P < 0.05)，而Ki67的表达仅与浸润深度有关(P < 0.05)；DCLK1与 Ki67的表达呈负相关(r=-0.460，P=0.000)。结直肠癌组织中DCLK1⁺/Ki67^-细胞数量约为2.01%，主要分布于肠黏膜隐窝的基底部及共壁腺管的共壁处，细胞核大深染且呈圆形或卵圆形，核仁明显，核分裂象少见，细胞质较少。DCLK1⁺/Ki67^-细胞在不同分化程度的腺癌组织中均存在，且分化程度越低，细胞数量越多，故无论从细胞数量和位置，还是细胞形态，都表明DCLK1⁺/Ki67^-细胞符合肿瘤干细胞的特征，可以将DCLK1⁺/Ki67^-作为结直肠癌肿瘤干细胞的标志物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 标志物, DCLK1, Ki67, 结直肠肿瘤

Abstract:

BACKGROUND: DCLK1 is a transmembrane microtubule-associated kinase in neurons after mitotic division, which may be the intestinal cancer stem cell marker.

OBJECTIVE:To observe the expression and pathological significance of DCLK1 and Ki67 in colorectal cancer.

METHODS: Expression of Ki67 and DCLK1 in 150 cases of colorectal cancer tissues was detected by immunohistochemical method in contrast to normal colorectal mucosa, para-carcinoma tissue, and adenoma tissue.

RESULTS AND CONCLUSION: The expression rates of DCLK1 and Ki67 were 36.7% and 34.7% in cancer tissues, respectively, both of which were significantly higher than those in normal colorectal mucosa and adenoma. The expression of DCLK1 was associated with the location, depth of invasion, lymph node metastasis (P < 0.05), while the expression of Ki67 was just associated with the depth of invasion (P < 0.05). There was a negative correlation between the expression of DCLK1 and Ki67 (r=-0.460, P=0.000). The count of DCLK1⁺/Ki67^-cells was about 2.01% in colorectal cancer tissues, and these cells mainly distributed at the bottom of intestinal mucosa base and common duct wall. DCLK1⁺/Ki67^- cells were oval, the nuclei were large and deep-stained with prominent nucleolus, and there was rare nuclear fission and less cytoplasm. From the aspects of cell number, location, and cell morphology, DCLK1⁺/Ki67^- cells are in line with the characteristics of cancer stem cells; therefore, DCLK1⁺/Ki67^-can be used as a cancer stem cell marker of colorectal cancer.

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Key words: Neoplastic Stem Cells, Colorectal Neoplasms, Ki-67 Antigen

中图分类号:

R394.2

王欢，马法库，刘斌，史敏，肖卫玲. 结直肠癌组织中DCLK1⁺/Ki67^-肿瘤干细胞样细胞的形态和分布[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1575-1579.

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图/表（结果） 4

2.1 Ki67在正常肠黏膜组织、癌旁组织及病变组织中的表达 Ki67蛋白表达在细胞核，阳性细胞胞核呈棕黄色。在正常肠黏膜组织和癌旁组织中Ki67阳性细胞数量少，主要位于肠上皮隐窝基底部；在腺瘤组织中Ki67表达量略增加，存在位置不定；在癌组织中Ki67表达量明显增加，但表达强度、数量和位置不一(表1，图1A，C)。Ki67在正常肠黏膜组织、癌旁组织及腺瘤组织中的表达与癌组织中表达差异有显著性意义(P < 0.05)；在正常肠黏膜组织、癌旁组织中的表达与腺瘤组织中表达差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 DCLK1在正常肠黏膜组织、癌旁组织及病变组织中的表达 DCLK1蛋白表达在细胞浆，阳性细胞胞浆呈棕黄色。在正常肠黏膜组织和癌旁组织中DCLK1不表达；在腺瘤组织中少量表达，集中在伴有重度不典型增生的腺瘤组织中，大多位于肠腺管基底部；在癌组织中DCLK1明显表达，主要分布于沿隐窝基底部或共壁腺管处，但各类型之间的表达强度、数量不一(表1，图1B，D)。

DCLK1在正常肠黏膜组织、癌旁组织及腺瘤组织中的表达与癌组织中表达差异有显著性意义(P < 0.05)；在正常肠黏膜组织、癌旁组织中的表达与腺瘤组织中表达差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 DCLK1和Ki67蛋白的表达与临床病理参数的关系在结直肠癌组织中DCLK1的表达与部位、浸润深度、淋巴结转移有关(P < 0.05)，且伴随浸润深度的增加，其表达增强，而与组织学类型、性别、年龄无关(P > 0.05)。Ki67在癌组织中的表达与浸润深度、组织学类型有关(P < 0.05)，且伴随浸润加深，其表达增强，而与性别、年龄、淋巴结转移无关(P > 0.05)，见表2。

Spearman等级相关分析，DCLK1和Ki67在结直肠癌中的表达呈负相关(r=-0.460，P=0.000)。

2.4 DCLK1⁺/Ki67^-细胞的形态、分布位置及百分比免疫组织化学双重染色结果显示在结直肠癌组织中DCLK1⁺/ Ki67^-细胞胞浆呈紫红色，细胞核呈蓝色，数量约占2.01%，其主要分布于肠黏膜隐窝的基底部及共壁腺管的共壁处。DCLK1⁺/Ki67^-癌细胞卵圆形，细胞核大深染且呈圆形或卵圆形，核仁明显，核分裂象少见，细胞质较少(图2A，B)。

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引言

材料方法

设计：制作组织芯片，利用免疫组化双重染色观察DCLK1和Ki67在结直肠癌组织中的表达以及DCLK1⁺/Ki67^-细胞的形态、分布情况。

时间及地点：实验于2014年9至12月在解放军兰州军区兰州总医院病理科实验室完成。

材料：

组织标本：于2007年3月至2012年9月在解放军兰州军区兰州总医院病理科选取结直肠癌组织标本150份，其中来源于男性91份，女性59份；所选病例患者年龄20-83岁，平均年龄58.4岁。150份结直肠癌组织标本中高分化47份，中分化48份，低分化36份，黏液腺癌19份；腺瘤组织标本34份；癌旁组织和距肿瘤病灶15 cm以上处的正常肠黏膜组织各10份。

主要试剂：兔抗人DCLK1单克隆抗体(1∶200)购自美国Sigma公司，鼠抗人Ki67单克隆抗体、免疫组化双染试剂盒(Dou-SP)购自福州迈新公司。

实验方法：

制作组织芯片：挑选组织保留良好的供者蜡块，制作空白蜡块；将供者蜡块和空白蜡块预热至30-40 ℃备用。用穿刺针打孔，将穿好的组织推入孔内。每个空白蜡块可穿刺47个点(6×8，最后一点不穿便于标记)。将含有组织的一面向下放置于载玻片上，放到65-70 ℃的烤箱里，待蜡块与载玻片之间出现液体石蜡时，迅速移去载玻片，轻轻挤压蜡块四周，自然冷却。具体操作过程详见参考文献[3]。

免疫组织化学双重染色及结果判定：组织芯片1-5号蜡块3 μm连续切片、脱蜡至水，严格按照试剂盒说明书步骤进行：EDTA煮沸法进行抗原修复；过氧化氢阻断内源性氧化物酶活性；加入Ki67抗体室温孵育2 h；DAB显色；加入DCLK1抗体4 ℃过夜；AEC显色；苏木精复染细胞核；水性封固剂封固。PBS代替一抗做阴性对照。结果判定标准：观察5个高倍镜视野，染色强度与背景颜色一致(-)，淡黄色(+)，棕黄色(++)，深褐色(+++)；阳性细胞比例小于10%(-)，11%-25%(+)，26%-50%(++)，51%及以上(+++)。

主要观察指标： ① DCLK1和Ki67在正常组织、腺瘤组织及腺癌组织中的表达。②免疫组化双染DCLK1⁺/Ki67^-细胞数量，并与苏木精-伊红染色的相邻切片对比观察细胞形态分布。

统计学分析：SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料运用χ²检验，等级分组资料用Spearman等级相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，占中国肿瘤死因的第4名，且发病率仍在上升中。发病年龄多在40-60岁之间，由于近年来饮食结构的改变，发病年龄有向年轻化发展的趋势。肠腺瘤与结直肠癌的关系密切，被认为是癌前病变。结直肠从上皮过度增生到结直肠癌的演化机制尚不明确，但大量数据表明这可能与肠道隐窝中干细胞的异常增殖有密切关系。

自从1997年Bonnet和Dick^[4]第一次分离出CD34⁺/CD38^-白血病细胞亚群，人们对于肿瘤干细胞的研究热情越来越高涨。正常的干细胞以非对称的方式分裂产生两个子细胞，其中一个是新的干细胞而另外一个是祖细胞，它们拥有分化和增殖成为成熟细胞的能力。肿瘤中细胞生长的失控是干细胞自我更新调控机制异常的结果，其可以来源于基因突变等表观遗传改变的正常干细胞和/或祖细胞，这些细胞突变后可形成特异性的肿瘤组织；也可以来源于体细胞的突变，使其获得自我增殖和更新的干细胞特性^[5-7]。这些突变而来的肿瘤干细胞可以形成新的肿瘤，但数量极少，不足全部肿瘤细胞数量的1%^[8-9]。若肿瘤组织出现了转移和/或远处播散，其肿瘤干细胞数量会有所增加，故有学者认为癌症可能是一种干细胞调控性疾病而并非单纯的增生信号增强^[10]。这就意味着传统的化学治疗只能消灭大多数没有分化能力的肿瘤细胞，而不能清除肿瘤干细胞。Ki67是细胞增殖指数，DCLK1是近来研究热门的肿瘤干细胞标志蛋白之一。本实验旨在检测Ki67和DCLK1在不同病理状态下肠道组织中的表达情况及其与临床病理学参数、患者预后的关系。

目前比较公认的结直肠癌肿瘤干细胞标志物有Ki67^[11]、CD44^[12]、LGR-5^[13]、MSI-1等^[14]。Ki67是一种与细胞增殖相关的核抗原，是临床上公认的判断肿瘤细胞增殖指数的抗原之一，其蛋白存在于细胞周期中的所有活跃阶段，包括G₁期，S期，G₂期和有丝分裂期，但G₀期休眠细胞不存在这种蛋白^[15-16]。本实验结果显示Ki67在正常肠黏膜有少量表达，此外，还发现Ki67在结直肠癌组织中的高表达与浸润深度、组织学类型相关，且伴随浸润程度的加深，其表达量增强，但在性别、年龄、淋巴结转移方面差异无显著性意义，这与韩军平等^[17]的实验结果不大一致，其认为Ki67的表达与浸润深度和淋巴结转移有关，出现这一情况的原因可能是：①选取的样本数量差距较大，韩军平等^[17]研究样本量仅59例。②均是制作组织芯片进行实验，可观察的视野较局限。

DCLK1是一种跨膜微管相关蛋白样激酶，其结合在Doublecortin蛋白的微管蛋白部分，主要参与骨架的形成、调节细胞运动、细胞分化以及细胞周期^[18]。DCLK1蛋白在多种恶性肿瘤中表达^[19-22]，如胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等，相关数据表明DCLK1可能为结直肠癌CSC标志蛋白。采用免疫组化染色发现DCLK1在大肠腺瘤的表达率为67.6%，而在结直肠癌组织的表达率为63.3%。这一发现表明，DCLK1的上调可能是大肠癌发生前的早期改变，另外，有近40%的腺瘤伴不典型增生组织中强阳性表达DCLK1，进一步证实DCLK1对结直肠癌的早期发现和早期预防方面具有重要意义。同时实验结果显示，在结直肠癌组织中DCLK1的表达与浸润深度、淋巴结转移相关，且伴随浸润深度的增加，其表达增强，与Gagliardi等^[18]研究结果一致，提示DCLK1可能参与了结直肠癌的发生、发展及转移过程，进一步研究其与结直肠肿瘤的关系有利于了解肿瘤的发生、发展及转移机制，对临床治疗和预后提供了新的方向。除此之外，外的发现DCLK1的表达与肿瘤的部位相关，这在以前的研究中从未出现，可能是所在位置的结构和功能的不同所导致。

本研究结果显示在结直肠癌组织中Ki67⁺细胞数量约占65%，这说明大部分癌细胞处于增殖状态，而剩下的小部分癌细胞处于G₀期，但是并不是所有处于G₀期的细胞都是肿瘤干细胞，这就说明Ki67不能单独作为肿瘤干细胞的标志物。在同一癌组织中，DCLK1⁺细胞数量明显少于Ki67⁺细胞数，同时DCLK1⁺细胞大部分不表达Ki67，DCLK1⁺/ Ki67^-细胞数占Ki67^-细胞数量不足30%；将连续切片苏木精-伊红染色后观察到少部分DCLK1⁺/Ki67^-细胞呈核大浆少的原始细胞形态；DCLK1⁺/Ki67^-细胞多位于腺腔的基底部或隐窝处，在不同分化程度的腺癌组织中均存在，且分化程度越低，细胞数量越多。故无论从细胞数量和位置，还是细胞形态，都表明DCLK1⁺/Ki67^-细胞符合肿瘤干细胞的特征。因此可以将DCLK1⁺/Ki67^-作为结直肠癌肿瘤干细胞的标志物。

通常情况下，临床常规治疗(放射和化学治疗)可以消灭大部分肿瘤细胞，但肿瘤干细胞仍然存在，其具有的自我复制和抗药性等特性是肿瘤复发和远处转移的主要原因^[23-25]，所以分离和鉴定肿瘤干细胞对研究和治疗恶性肿瘤具有重要意义，也是之后实验的研究重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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