干细胞与膀胱脱细胞基质构建组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床上重建长段输尿管缺损的方法存在并发症多且创伤大等缺点，因此，需要寻找其他的修复方式。

目的：探讨组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损的可行性。

方法：将兔骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植到兔膀胱脱细胞基质的两面，培养7 d后制作成4 cm长的组织工程管状移植物，仅将膀胱平滑肌细胞种植到兔膀胱脱细胞基质构建组织工程管状移植物作为对照；新西兰兔25只，随机分为实验组20只和对照组5只，将2种组织工程管状移植物移植到兔体内修复输尿管缺损，修复同时利用网膜包裹，分别于术后2，4，8周取实验组标本做苏木精-伊红染色及免疫组化检测。

结果与结论：组织学检查发现实验组尿路上皮层再生呈连续性，术后8周可见组织工程管状移植物管腔内覆盖多层尿路上皮结构及规则的平滑肌束，免疫组化可见uroplakin Ⅲa及CK AE1/AE3阳性，证实了组织工程管状移植物组织内有成熟上皮细胞覆盖，且上皮细胞之间有连接功能。对照组5只动物术后拔除输尿管支架管2周内均死亡，尸检见流出道瘢痕形成，组织工程管状移植物内腔闭锁，同侧肾脏重度积水，未作组织学观察。以上结果表明将骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植于兔膀胱脱细胞基质上构建组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损是可行的，组织工程管状移植物内腔有成熟上皮覆盖，骨髓间充质干细胞能促进尿路上皮再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 膀胱脱细胞基质, 骨髓间充质干细胞, 平滑肌细胞, 输尿管缺损, 尿路上皮再生, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The main way for long-segmental ureteral reconstruction may cause a lot of traumas and complications. Therefore, to seek a new repair method is urgent.

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of a tissue-engineered tubular graft for ureteral reconstruction.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells and smooth muscle cells of rabbits were seeded into the two surfaces of bladder acellular matrix and cultivated for 7 days. Then the graft was used to prepare a 4-cm long tissue-engineered tubular graft, which was regarded as experimental group. Smooth muscle cells seeded onto the bladder acellular matrix was used to construct the tissue-engineered tubular graft as control group. Twenty-five New Zealand rabbits were randomly divided into experimental group (n=20) and control group (n=5), and two kinds of tubular grafts covered with omentum were implanted into the two groups, respectively, for repair of ureteral defects. Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical detection were performed at 2, 4, 8 weeks after implantation.

RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental group, hematoxylin-eosin staining showed epithelial coverage and muscle fibers on the lumen of tissue-engineered tubular grafts at 8 weeks after implantation; immunohistochemistry showed that anti-AE1/AE3 antibody and anti-uroplakin Ⅲa antibody were positive, confirming that there were mature epithelial cells on the lumen of tissue-engineered tubular grafts. In the control group, five rabbits were dead within 2 weeks after removal of ureteral scaffold, and autopsy showed scar formation inside the graft and severe hydronephrosis. These results demonstrate that it is feasible to construct the tissue-engineered tubular graft using bone marrow mesenchymal stem cells and smooth muscle cells into the bladder acellular matrix for ureteral reconstruction. Bone marrow mesenchymal stem cells can potentially promote urothelial regeneration.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Myocytes, Smooth Muscle, Ureteral Diseases

中图分类号:

R394.2

廖文彪，杨嗣星，熊云鹤，宋超，孟令超. 干细胞与膀胱脱细胞基质构建组织工程管状移植物修复长段输尿管缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1570-1574.

Liao Wen-biao, Yang Si-xing, Xiong Yun-he, Song Chao, Meng Ling-chao. Tissue-engineered tubular grafts constructed with stem cells and bladder acellular matrix in long-segmental ureteral reconstruction [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1570-1574.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年5月至2014年11月在武汉大学人民医院中心实验室及动物中心完成。

材料：

实验动物：SPF级雄性新西兰大白兔50只，体质量2.0-2.5 kg，购自武汉大学医学院动物实验中心，其中25只用于膀胱脱细胞基质的制备，其余25只进行动物体内实验。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养和鉴定：从胫骨前端抽取兔10 mL骨髓，洗涤离心后收集表面的单核细胞，加入含胎牛血清和双抗的DMEM培养基。3 d后换液，此后细胞融合至80%后进行传代，每3 d换液1次。选取第4代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，采用流式细胞仪鉴定细胞表面标志CD29、CD44、CD90及CD34的表达。

膀胱平滑肌细胞的培养和鉴定：无菌条件下获取兔膀胱组织，分离出肌层并剪碎，用胶原酶和胰酶消化后离心，PBS反复洗涤，加入DMEM培养基，2 d后换液，此后细胞融合至80%后进行传代，每2 d换液1次。选取第4代膀胱平滑肌细胞，免疫荧光染色鉴定细胞α-SMA表达。

膀胱脱细胞基质的制作：参照文献[11]方法制备兔膀胱脱细胞基质。将制备好的材料冷冻干燥，封装，环氧乙烷消毒，保存备用。

组织工程管状移植物的构建：将细胞总数为1×10⁶的骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞分别种植于膀胱脱细胞基质的两面，在DMEM培养基中培养3 d，将复合物包绕尿管用5-0可吸收线缝合制成组织工程管状移植物，使骨髓间充质干细胞位于管腔内面。用同样的方法制作未种植骨髓间充质干细胞的组织工程管状移植物作为对照组。

输尿管缺损模型制备：实验兔麻醉满意后取平卧位，常规消毒铺巾，取左侧腹部纵行切口，依次切开皮肤、腹外斜肌腱膜、腹内斜肌、腹横肌，将肠管推向腹侧，显露左侧输尿管，在距离肾盂输尿管连接部约4 cm处切除4 cm长输尿管，制作输尿管缺损模型。

利用组织工程管状移植物修复输尿管缺损：25只实验兔随机分为2组，实验组20只，对照组5只。实验组造模后放置输尿管支架管，再用6-0可吸收线将组织工程管状移植物和输尿管断端吻合，利用网膜包裹吻合后的组织工程管状移植物，对侧输尿管保持完好。对照组将未种植骨髓间充质干细胞的组织工程管状移植物和输尿管断端吻合，其他步骤与实验组相同。术后2周后拔出输尿管支架管。

组织学及免疫组化检测：实验组分别于移植后2，4，8周(每个时间点5只)取组织工程管状移植物标本，切成 3 μm大小后以石蜡包埋，按常规方法行苏木精-伊红染色。移植后8周组织工程输尿管标本切片分别在抗细胞角蛋白单克隆抗体(CK AE1/AE3)和抗uroplakin Ⅲa抗体中孵化，然后加入相应种属二抗观察。

主要观察指标：输尿管缺损经组织工程管状移植物修复后上皮层和肌层的再生情况。

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讨论

随着输尿管镜在临床上的广泛应用，术中输尿管损伤时常发生，严重时会导致输尿管全程撕脱；侵袭性的输尿管肿瘤在切除输尿管后也会导致输尿管缺损。临床上，长段输尿管缺损后的修复手术较复杂，常需利用结肠或膀胱肌瓣，甚至肾移植，但这些手术并发症多，且要损害其他器官；若患者肠管或膀胱有疾患，则无法作为代替物修复输尿管缺损，因此，需要寻找其他的修复方式。组织工程技术能提供一种新的修复输尿管的方法。

尿路上皮层是尿路组织中重要的结构，起着防止尿外渗及抗感染的作用。Shalhav等^[12]利用管状的脱细胞基质重建6只大动物的输尿管，术后8周发现4只输尿管闭锁，另外2只在术后12周内闭锁，分析其原因可能是移植物缺乏功能性的尿路上皮层，随着尿液的浸泡，脱细胞基质逐渐沉积所致。但尿路上皮细胞增殖慢，来源有限，且尿路上皮癌患者细胞的安全性不确定。因此，需要寻找其他更为安全的种子细胞。

有研究表明，骨髓间充质干细胞能促进膀胱再生，另一些研究表明，骨髓间充质干细胞能分化成上皮细胞。Alescio等^[13]报道支气管间充质细胞能分化成肺上皮细胞；Harris等^[14]研究发现骨髓间充质干细胞能以一种相互融合的方式向上皮细胞分化。Anumanthan等^[15]报道骨髓间充质干细胞能直接向尿路上皮分化；Tian等^[16]报道将骨髓间充质干细胞与尿路上皮细胞共培养，骨髓间充质干细胞能表达尿路上皮细胞相关蛋白。本研究也显示骨髓间充质干细胞能促进成熟的尿路上皮层再生^[17]。

组织工程另一个重要的因素是支架材料。合成材料有较好的机械强度，被广泛用作组织工程支架，但其表面缺少生物活性因子，易导致并发症的发生^[18-22]。膀胱脱细胞基质和小肠黏膜下层是应用到泌尿系组织工程最多的天然材料。膀胱脱细胞基质表面至少有10种生物活性因子，为细胞的迁移、增殖、分化提供了良好的微环境^[23-24]；同时，膀胱脱细胞基质所具有的机械特性能够支持上皮细胞的生长^[24-25]；与小肠黏膜下层相比，膀胱脱细胞基质能更好地适应及促进尿路上皮细胞的生长、增殖，在进行尿道重建时，膀胱脱细胞基质也显示出更好的生物相容性^[26]，这些都说明膀胱脱细胞基质是下尿路重建中很好的支架材料。

因此，课题组设计将骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植于膀胱脱细胞基质上构建组织工程管状移植物，修复长段输尿管过程中保证组织工程管状移植物内腔覆盖上皮，防止尿外渗。

对照组5只兔术后拔除输尿管支架管2周内均死亡，尸检见流出道瘢痕形成，组织工程管状移植物内腔闭锁，同侧肾脏重度积水，原因可能是输尿管内腔可能缺少尿路上皮层的保护，尿液流入到支架内导致组织炎性反应，钙盐沉着并发生狭窄所致。

<验成功将骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞种植于膀胱脱细胞基质上构建组织工程管状移植物，用其修复长段输尿管缺损后，组织工程管状移植物内腔有成熟上皮覆盖，骨髓间充质干细胞能促进尿路上皮再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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