牙周膜干细胞与牙周膜细胞甲状旁腺激素受体表达的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1562-1569.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.016

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牙周膜干细胞与牙周膜细胞甲状旁腺激素受体表达的比较

王烟岚，王萧萧，陈天宇，杨凡巧，戴旭彬，欧乾民，戴霜叶，林雪峰

中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室，广东省广州市 510006

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 林雪峰，博士，副教授，中山大学光华口腔医学院?附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室，广东省广州市 510006
作者简介:王烟岚，女，1990年生，福建省宁德市人，汉族，中山大学在读硕士，主要从事牙周膜干细胞方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81171575)

Quantitative comparison of parathyroid hormone 1 receptor between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells

Wang Yan-lan, Wang Xiao-xiao, Chen Tian-yu, Yang Fan-qiao, Dai Xu-bin, Ou Qian-min, Dai Shuang-ye, Lin Xue-feng

Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Lin Xue-feng, M.D., Associate professor, Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Wang Yan-lan, Studying for master’s degree, Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171575

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙周膜干细胞是牙周膜细胞中一类具有自我更新及多向分化潜能的间充质干细胞，经诱导可分化为成骨样细胞或脂肪样细胞。关于牙周膜干细胞是否表达甲状旁腺激素受体以及受体表达量对牙周膜干细胞成骨能力的影响等，目前尚未见相关报道。

目的：检测并比较牙周膜干细胞与牙周膜细胞中甲状旁腺激素受体表达的差异，并探讨甲状旁腺激素受体在成骨过程中的作用机制。

方法：应用免疫磁珠法筛选分离牙周膜干细胞及牙周膜细胞。通过细胞免疫荧光染色、荧光定量PCR等方法检测并比较牙周膜干细胞与牙周膜细胞中甲状旁腺激素受体的表达差异。应用荧光定量PCR、碱性磷酸酶活性检测及矿化能力分析等方法评价甲状旁腺激素受体对两者成骨能力的影响。

结果与结论：应用免疫磁珠法筛选的STRO-1阳性细胞，经细胞免疫荧光染色鉴定STRO-1、CD146、Vimentin等间充质干细胞表面表型均呈阳性，证明为牙周膜干细胞。细胞免疫荧光染色证明，牙周膜干细胞表达甲状旁腺激素受体，其主要分布于细胞膜与胞浆内，与牙周膜细胞及人成骨肉瘤MG63细胞系相似。荧光定量PCR结果表明，牙周膜干细胞甲状旁腺激素受体的表达量约为牙周膜细胞的3.7倍，与MG63细胞相近。经10^-⁷ mol/L甲状旁腺激素处理30 min后，牙周膜干细胞的甲状旁腺激素受体表达量明显增加。经成骨诱导后，牙周膜干细胞的甲状旁腺激素受体表达量、成骨相关基因表达量、碱性磷酸酶活性及矿化能力均高于牙周膜细胞。上述实验结果证明，牙周膜干细胞能表达甲状旁腺激素受体，且主要分布于细胞膜和细胞浆内。牙周膜干细胞甲状旁腺激素受体的表达量明显高于牙周膜细胞，而且甲状旁腺激素受体表达量与细胞的成骨能力相关，说明牙周膜干细胞比牙周膜细胞具有更强的成骨能力，是口腔组织工程学中具有广阔应用前景的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 牙周膜干细胞, 牙周膜细胞, 甲状旁腺激素受体, 成骨分化, 多向分化, 组织工程, 牙周炎, 再生医学, 表面标志物, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human periodontal ligament stem cells are a kind of mesenchymal stem cells that have self-renewal and multidifferentiation potential. Previous studies have showed that human periodontal ligament stem cells can differentiate into osteoblast-like cells or adipocyte-like cells under appropriate induction. Yet few studies have focused on the expression level of parathyroid hormone 1 receptor which will affect the osteogenic potential of Human periodontal ligament stem cells.

OBJECTIVE: To examine the expression level of parathyroid hormone 1 receptor between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells and to discuss the role of parathyroid hormone 1 receptor in osteogenic differentiation.

METHODS: By using magnetic-bead cell sorting, we separated and identified the human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells. We examined and compared the mRNA expression level of parathyroid hormone 1 receptor in human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells by Real-Time PCR. Osteoblastic differentiation was examined through in vitro matrix mineralization by alizarin red staining and alkaline phosphatase assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Positive immunomagetic sorted cells were positive for STRO-1, CD146, Vimentin, indicating that they were periodontal ligament stem cells. Parathyroid hormone 1 receptor was expressed in human periodontal ligament stem cells and mainly located in cell membrane and cytoplasm which were similar to human periodontal ligament cells and MG63 cells. The expression of parathyroid hormone 1 receptor in human periodontal ligament stem cells was 3.7 times higher than that in human periodontal ligament cells, which was similar to that in MG63 cells. After osteogenic induction, human periodontal ligament stem cells showed a higher expression of parathyroid hormone 1 receptor and osteoblast-related genes as well as the activity of osteoblast alkaline phosphatase and mineralization compared to human periodontal ligament cells. Our data showed that parathyroid hormone 1 receptor was higher in human periodontal ligament stem cells than human periodontal ligament cells and the expression was related with osteogenic differentiation, suggesting that human periodontal ligament stem cells display a higher potency of osteogenic differentiation and act as seed cells with a vast application prospect in oral tissue engineering.

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Key words: Stem Cells, Periodontal Ligament, Receptors, Parathyroid Hormone

中图分类号:

R394.2

王烟岚，王萧萧，陈天宇，杨凡巧，戴旭彬，欧乾民，戴霜叶，林雪峰. 牙周膜干细胞与牙周膜细胞甲状旁腺激素受体表达的比较[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1562-1569.

Wang Yan-lan, Wang Xiao-xiao, Chen Tian-yu, Yang Fan-qiao, Dai Xu-bin, Ou Qian-min, Dai Shuang-ye, Lin Xue-feng . Quantitative comparison of parathyroid hormone 1 receptor between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1562-1569.

图/表（结果） 6

2.1 牙周膜干细胞表面分子的鉴定采用免疫磁珠法筛选的STRO-1阳性细胞均表达早期间充质干细胞表面标志物STRO-1(图1A)和血管周围细胞标志分子CD146(图1C)，而筛选所得STRO-1阴性细胞则均呈现阴性(图1B，D)。此外，筛选所得STRO-1阳性细胞及阴性细胞的Vimentin染色均呈阳性(图1E)，但Cytokeratin染色均呈阴性(图1F)，证明所有细胞来源于间充质组织，而没有上皮细胞的污染。PBS对照组染色呈阴性(图1G)。上述结果表明筛选方法具有可靠性。

2.2 PTH1R在牙周膜干细胞、牙周膜细胞及MG63细胞中分布的比较倒置荧光显微镜下观察，PTH1R在牙周膜干细胞、牙周膜细胞及MG63细胞均有表达，主要分布在细胞膜和细胞浆内，在细胞核内有少量表达(图2A-C)。在同等染色及拍摄条件下，牙周膜干细胞上的荧光强度与MG63细胞相近，明显强于牙周膜细胞(图2D-F)。经过 30 min大剂量甲状旁腺激素(1-34)处理后，各组细胞内PTH1R荧光强度都有增加，其中牙周膜干细胞和MG63细胞荧光强度增加更为明显(图2G-I)。实验结果表明，牙周膜干细胞表达PTH1R，其表达量及对甲状旁腺激素(1-34)的敏感性都明显高于牙周膜细胞。

2.3 PTH1R在牙周膜干细胞、牙周膜细胞及MG63细胞基因表达量的比较荧光定量PCR结果显示，牙周膜干细胞PTH1R mRNA的表达量是牙周膜细胞的3.7倍，与MG63细胞相近。经过10^-⁷ mol/L甲状旁腺激素(1-34)处理30 min后，牙周膜干细胞与MG63细胞中PTH1R mRNA表达量明显高于未处理组(P < 0.05)，而牙周膜细胞在同样处理条件下未发生明显变化(P > 0.05，图3)。实验结果表明，牙周膜干细胞的PTH1R表达量及对甲状旁腺激素(1-34)的敏感性均明显高于牙周膜细胞。

2.4 牙周膜干细胞与牙周膜细胞成骨诱导后PTH1R及Runx2表达量的比较荧光定量PCR结果显示，牙周膜干细胞及牙周膜细胞中PTH1R和Runx2 mRNA的表达量在成骨诱导8 d后都明显高于非诱导组(P < 0.05)。成骨诱导组与非诱导组牙周膜干细胞PTH1R和Runx2 mRNA的表达明显高于牙周膜细胞(P < 0.05)(图4 A，B)。实验结果表明，成骨诱导可以促进牙周膜干细胞、牙周膜细胞中PTH1R和Runx2的表达。

2.5 牙周膜干细胞与牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性和茜素红染色结果比较成骨诱导8 d后，牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性明显高于牙周膜细胞(P < 0.05)(图5)。成骨诱导培养21 d后，茜素红染色可观察到细胞紧密生长并出现大小不一的红色矿化结节。牙周膜干细胞形成的矿化结节面积和密度都较大，而牙周膜细胞生成的矿化结节分散且单个结节的面积较小(图6A，B)。茜素红半定量结果显示，牙周膜干细胞矿化结节形成量明显高于牙周膜细胞(P < 0.05)(图6C)。说明牙周膜干细胞的成骨分化能力明显高于牙周膜细胞。

参考文献

[1]Park JY, Jeon SH, Choung PH. Efficacy of periodontal stem cell transplantation in the treatment of advanced periodontitis. Cell Transplant. 2011;20(2):271-285.
[2]Yip I, Ma L, Mattheos N, et al. Defect healing with various bone substitutes. Clin Oral Implants Res. 2014. [Epub ahead of print]
[3]Goyal L. Clinical effectiveness of combining platelet rich fibrin with alloplastic bone substitute for the management of combined endodontic periodontal lesion. Restor Dent Endod. 2014;39(1):51-55.
[4]Bartold PM, McCulloch CA, Narayanan AS, et al. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontol 2000. 2000; 24:253-269.
[5]Maeda H, Tomokiyo A, Fujii S, et al. Promise of periodontal ligament stem cells in regeneration of periodontium. Stem Cell Res Ther. 2011;2(4):33.
[6]Ge S, Zhao N, Wang L, et al. Bone repair by periodontal ligament stem cellseeded nanohydroxyapatite-chitosan scaffold. Int J Nanomedicine. 2012;7:5405-5414.
[7]Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet. 2004;364(9429):149-155.
[8]Jin SH, Lee JE, Yun JH, et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells from gingival connective tissue. J Periodontal Res. 2014. [Epub ahead of print]
[9]Ding G, Liu Y, Wang W, et al. Allogeneic periodontal ligament stem cell therapy for periodontitis in swine. Stem Cells. 2010; 28(10):1829-1838.
[10]Fawzy El-Sayed KM, Dörfer C, Fändrich F, et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013;130:89-103.
[11]Cupp ME, Nayak SK, Adem AS, et al. Parathyroid hormone (PTH) and PTH-related peptide domains contributing to activation of different PTH receptor-mediated signaling pathways. J Pharmacol Exp Ther. 2013;345(3):404-418.
[12]Neer RM, Arnaud CD, Zanchetta JR, et al. Effect of parathyroid hormone (1-34) on fractures and bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. N Engl J Med. 2001;344(19):1434-1441.
[13]Abuduwali N, Lossdörfer S, Winter J, et al. Functional characterization of the parathyroid hormone 1 receptor in human periodontal ligament cells. Clin Oral Investig. 2014; 18(2):461-470.
[14]Ahlström M, Pekkinen M, Lamberg-Allardt C. Dexamethasone downregulates the expression of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in mesenchymal stem cells. Steroids. 2009; 74(2):277-282.
[15]Wada N, Menicanin D, Shi S, et al. Immunomodulatory properties of human periodontal ligament stem cells. J Cell Physiol. 2009;219(3):667-676.
[16]Vasconcelos DF, Marques MR, Benatti BB, et al. Intermittent parathyroid hormone administration improves periodontal healing in rats. J Periodontol. 2014;85(5):721-728.
[17]Watson PH, Fraher LJ, Hendy GN, et al. Nuclear localization of the type 1 PTH/PTHrP receptor in rat tissues. J Bone Miner Res. 2000;15(6):1033-1044.
[18]Lupp A, Klenk C, Röcken C, et al. Immunohistochemical identification of the PTHR1 parathyroid hormone receptor in normal and neoplastic human tissues. Eur J Endocrinol. 2010; 162(5):979-986.
[19]Jong YJ, Sergin I, Purgert CA, et al. Location-dependent signaling of the group 1 metabotropic glutamate receptor mGlu5. Mol Pharmacol. 2014;86(6):774-785.
[20]O'Malley KL, Jong YJ, Gonchar Y, et al. Activation of metabotropic glutamate receptor mGlu5 on nuclear membranes mediates intranuclear Ca2+ changes in heterologous cell types and neurons. J Biol Chem. 2003; 278(30):28210-28219.
[21]Pickard BW, Hodsman AB, Fraher LJ, et al. Type 1 parathyroid hormone receptor (PTH1R) nuclear trafficking: association of PTH1R with importin alpha1 and beta. Endocrinology. 2006;147(7):3326-3332.
[22]Guo Y, Li Z, Ding R, et al. Parathyroid hormone induces epithelial-to-mesenchymal transition via the Wnt/β-catenin signaling pathway in human renal proximal tubular cells. Int J Clin Exp Pathol. 2014;7(9):5978-5987.
[23]Kraus D, Jäger A, Abuduwali N, et al. Intermittent PTH(1-34) signals through protein kinase A to regulate osteoprotegerin production in human periodontal ligament cells in vitro. Clin Oral Investig. 2012;16(2):611-618.
[24]Wolf M, Jäger A, Abuduwali N, et al. Continuous PTH modulates alkaline phosphatase activity in human PDL cells via protein kinase C dependent pathways in vitro. Ann Anat. 2013;195(5):455-460.
[25]Alokail MS, Peddie MJ. Quantitative comparison of PTH1R in breast cancer MCF7 and osteosarcoma SaOS-2 cell lines. Cell Biochem Funct. 2008;26(4):522-533.
[26]Gentili C, Morelli S, de Boland AR. Characterization of PTH/PTHrP receptor in rat duodenum: effects of ageing. J Cell Biochem. 2003;88(6):1157-1167.
[27]Zhou S, Bueno EM, Kim SW, et al. Effects of age on parathyroid hormone signaling in human marrow stromal cells. Aging Cell. 2011;10(5):780-788.
[28]Swarthout JT, D'Alonzo RC, Selvamurugan N, et al. Parathyroid hormone-dependent signaling pathways regulating genes in bone cells. Gene. 2002;282(1-2):1-17.
[29]Luck MD, Carter PH, Gardella TJ. The (1-14) fragment of parathyroid hormone (PTH) activates intact and amino-terminally truncated PTH-1 receptors. Mol Endocrinol. 1999;13(5):670-680.
[30]Blind E, Raue F, Knappe V, et al. Cyclic AMP formation in rat bone and kidney cells is stimulated equally by parathyroid hormone-related protein (PTHrP) 1-34 and PTH 1-34. Exp Clin Endocrinol. 1993;101(3):150-155.
[31]Potetinova Z, Barbier JR, Suen T, et al. C-terminal analogues of parathyroid hormone: effect of C-terminus function on helical structure, stability, and bioactivity. Biochemistry. 2006;45(37):11113-11121.
[32]Pioszak AA, Xu HE. Molecular recognition of parathyroid hormone by its G protein-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(13):5034-5039.
[33]Datta NS, Abou-Samra AB. PTH and PTHrP signaling in osteoblasts. Cell Signal. 2009;21(8):1245-1254.
[34]Esbrit P, Alcaraz MJ. Current perspectives on parathyroid hormone (PTH) and PTH-related protein (PTHrP) as bone anabolic therapies. Biochem Pharmacol. 2013;85(10): 1417-1423.
[35]Sidiropoulou-Chatzigiannis S, Kourtidou M, Tsalikis L.The effect of osteoporosis on periodontal status, alveolar bone and orthodontic tooth movement. A literature review. J Int Acad Periodontol. 2007;9(3):77-84.
[36]Qiu T, Xian L, Crane J, et al. PTH receptor signaling in osteoblasts regulates endochondral vascularization in maintenance of postnatal growth plate. J Bone Miner Res. 2015;30(2):309-317.
[37]Haramoto N, Kawane T, Horiuchi N. Upregulation of PTH receptor mRNA expression by dexamethasone in UMR-106 osteoblast-like cells. Oral Dis. 2007;13(1):23-31.
[38]Cochran DL, Jones A, Heijl L, et al. Periodontal regeneration with a combination of enamel matrix proteins and autogenous bone grafting.J Periodontol. 2003;74(9):1269-1281.
[39]Gao Y, Zhao G, Li D, et al. Isolation and multiple differentiation potential assessment of human gingival mesenchymal stem cells. Int J Mol Sci. 2014;15(11):20982-20996.
[40]Han J, Menicanin D, Marino V, et al. Assessment of the regenerative potential of allogeneic periodontal ligament stem cells in a rodent periodontal defect model. J Periodontal Res. 2014;49(3):333-345.
[41]Trubiani O, Orsini G, Zini N, et al. Regenerative potential of human periodontal ligament derived stem cells on three-dimensional biomaterials: a morphological report. J Biomed Mater Res A. 2008;87(4):986-993.

引言

牙周炎是造成人牙齿缺失的最主要原因，世界范围内重度牙周炎的发病率高达10%-15%^[1]。牙周炎所造成的牙周组织破坏是不可逆的，目前牙周组织的修复主要依赖于外源性替代物的植入，但外源性替代物的稳定性及远期临床疗效尚未明确^[2-3]。组织工程技术的出现为牙周组织的再生提供了新的方法，受到了广泛关注^[4-5]。Ge等^[6]将具有再生分化能力的干细胞进行体外三维培养，移植至骨缺损区域，从而达到修复骨缺损的目的。牙周膜干细胞(human periodontal stem ligament cells，hPDLSCs)在牙周膜细胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)中占3%-27%，是牙周膜中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞群，能分化形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜样组织，在维持牙周组织健康中发挥重要作用^[7-8]。牙周膜干细胞具有未分化间充质干细胞的特点，表达STRO-1这一间充质干细胞表面标志物。有学者在猪的实验性牙周炎模型中，将异源性人牙周膜干细胞移植到牙槽骨缺损区，可促使牙周组织修复再生，从而为以牙周膜干细胞为种子细胞的组织工程技术治愈牙周炎提供了理论依据^[9-10]。

甲状旁腺激素受体(parathyroid hormone 1 receptor，PTH1R)主要分布于骨骼及肾脏组织中，为经典的甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的受体，属于G蛋白偶联受体超家族的成员。PTH1R与G蛋白偶联，经腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷-蛋白激酶A以及磷酸酯酶C-胞浆钙离子-蛋白激酶C信号传导通路促进骨形成^[11]。作为美国食品药品监督管理局批准的治疗骨质疏松的药物，甲状旁腺激素可通过与间充质细胞以及成骨细胞的PTH1R结合，根据用药量和作用时间的不同调节骨形成^[12]。有学者对成骨肉瘤细胞进行了短时间大剂量的甲状旁腺激素刺激，发现可提高成骨肉瘤细胞PTH1R的表达量^[13]。另有研究结果显示，成骨诱导液中的地塞米松同样可促进间充质干细胞表达PTH1R^[14]。由此可见，PTH1R在细胞成骨分化过程中发挥重要的作用，并受多种激素调控。

近期研究表明，牙周膜干细胞不仅能够维持正常生理情况下牙周膜内环境的稳定，同时在牙周炎疾病组织的修复与再生过程中也发挥着重要的作用^[15]。与牙周膜干细胞相似，全身间断使用甲状旁腺激素可以促进大鼠牙周组织的愈合^[16]。Abuduwali等^[13]在牙周膜细胞中发现了PTH1R的表达，然而牙周膜干细胞上PTH1R的表达情况、牙周膜干细胞与牙周膜细胞上PTH1R表达量的比较，以及PTH1R对这两种细胞成骨分化的影响等问题，目前尚无报道。本研究采用免疫磁珠法筛选和分离牙周膜干细胞，通过细胞免疫荧光染色、荧光定量PCR等检测方法回答以上问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞水平和分子水平观察。

时间及地点：实验于2014年1至10月在中山大学口腔医学研究所完成。

材料：中山大学附属口腔医院外科门诊就诊的15-18岁健康青少年因正畸需求拔除的无龋坏、牙周健康的前磨牙，通过原代分离培养获得牙周膜干细胞和牙周膜细胞。在患者本人或家长同意情况下收集实验样本并告之实验用途。

MG63细胞系购自上海博谷生物有限公司，是一类具有人成骨细胞表型特征的低分化恶性肿瘤细胞，表达PTH1R。实验过程中所需引物均为自行设计，由Invitrogen(广州)合成。

实验方法：

原代牙周膜细胞分离培养：收集健康的离体前磨牙，保存于含有抗生素的α-MEM培养液中。用刀片刮取牙根中部1/3牙周膜组织，剪成约1 mm³组织块，采用酶组织块联合法分离牙周膜细胞，在体积分数为5% CO₂、37 ℃下培养。每两三天换液1次，待细胞生长达80%汇合时用胰酶消化进行传代培养。

免疫磁珠法(magnetic-bead cell sorting，MACS)筛选牙周膜干细胞：按照磁珠试剂盒说明书方法筛选STRO-1阳性的牙周膜干细胞。取25 μL磁珠加到2 mL EP管中，用 1 mL含0.1%BSA、2 mmol/L EDTA的PBS洗涤磁珠3次，置于磁力架上1 min，去除上清。将清洗过的磁珠重悬于 1 mL含0.1%BSA/2 mmol/L EDTA 的PBS中，置4 ℃备用。用0.25%Trypsin/0.02%EDTA将牙周膜细胞消化得到单细胞悬液，离心后将细胞重悬于1 mL含1%BSA的PBS中(2.5×10⁶个)，加入10 μL小鼠抗人STRO-1抗体，4 ℃旋转式孵育1 h。离心后去除上清，用含0.1%BSA、2 mmol/L EDTA的PBS洗细胞。将结合了抗体的细胞重悬于洗过的磁珠溶液中，4 ℃孵育45 min。将细胞置于磁力架上，吸除上清，洗细胞4次，去除没有与磁珠结合的细胞。最后，将结合在磁珠上的细胞重悬在含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养，每两三天更换新鲜培养液。结合在磁珠上的细胞即是牙周膜干细胞，不与磁珠结合的细胞为牙周膜细胞。

牙周膜干细胞表面分子的鉴定：选用小鼠抗STRO-1、CD146、Cytokeratin、Vimentin为特异性抗体，应用细胞免疫荧光染色方法对牙周膜干细胞进行鉴定。取第4代牙周膜干细胞(1×10⁴个)分别接种于直径15 mm NEST玻底培养皿内。待细胞生长覆盖率达50%时，用40 g/L多聚甲醛室温固定细胞10 min，PBS清洗3次，每次5 min。用含5% BSA的PBS室温封闭2 h，阻断非特异性结合。分别滴加用含1%BSA的PBS稀释的一抗(小鼠抗STRO-1为1︰100；小鼠抗CD146为1︰100；小鼠抗Cytokeratin为1︰100；小鼠抗Vimentin为1︰200)，以PBS代替一抗作为染色的阴性对照，4 ℃孵育过夜。次日弃去一抗，PBS洗细胞3次，每次5 min。滴加用含1%BSA的PBS稀释的荧光二抗(羊抗小鼠IgM或猴抗小鼠IgG，1︰250稀释)，室温孵育45 min。PBS清洗3次后，用DAPI染色细胞核后封固。激光共聚焦显微镜下观察结果并拍照。

细胞免疫荧光染色定位PTH1R：取第4代(1×10⁴个)牙周膜干细胞、牙周膜细胞及MG63细胞接种于直径15 mm NEST玻底培养皿。待细胞生长至50%左右融合时，实验组细胞以终浓度为10^-⁷ mol/L的甲状旁腺激素处理30 min，对照组不做任何处理。甲状旁腺激素处理结束后，用40 g/L多聚甲醛室温固定细胞，进行细胞免疫荧光染色，方法同上。一抗为1︰50稀释的小鼠抗PTH1R，二抗为1︰250稀释的猴抗小鼠IgG(H+L)，DAPI细胞核染色后封固。激光共聚焦显微镜下观察结果和拍照。实验组与对照组图像在同等拍摄条件下进行。

荧光定量PCR检测PTH1R mRNA的表达水平：第4代牙周膜干细胞、牙周膜细胞及MG63细胞分别接种于6孔板中，待细胞生长至80%左右融合时，实验组细胞以终浓度10^-⁷ mol/L的甲状旁腺激素(1-34)处理30 min，对照组未做任何处理。甲状旁腺激素(1-34)处理结束后，每孔加入1 mL Trizol，提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书，各组均以1 μg总RNA为模板，反应体积为20 μL，采用随机引物法将RNA反转录为cDNA。使用Light Cycler 480 SYBR Green I Master进行荧光定量PCR。引物设计见表1，扩增条件为95 ℃变性10 min，然后45个循环为95 ℃变性10 s、61 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s。反应产物应用Light Cycler 480 Software Version 1.5软件进行定量分析。为消除样品量的差异，引入内参基因GAPDH进行校正。记录目的基因的Ct值(基本循环数)，根据内参基因GAPDH的循环数计算出?Ct(基本循环与内参循环数差值)，依据2^-^??Ct相对定量法：??Ct=(Ct_目的基因-Ct_内参基因)实验组-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)对照组，计算出目的基因的相对量。以上实验重复3次。

细胞成骨诱导分化和荧光定量PCR检测PTH1R及成骨相关基因的表达量：取第4代牙周膜干细胞和牙周膜细胞接种于12孔培养板内，待细胞达到70%-80%融合时，更换成骨诱导液进行成骨诱导。实验分为2组：①非诱导组：加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基。②诱导组：加入成骨诱导液(体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，含10^-⁷ mol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)。每2 d更换新鲜培养液或成骨诱导液，培养至第8天收取RNA。每孔加入1 mL Trizol，提取总RNA。采用随机引物法将RNA反转录为cDNA，荧光定量PCR方法同上。PTH1R和Runx2 引物设计见表1。以上实验重复3次。

碱性磷酸酶活性定量检测：取第4代牙周膜干细胞和牙周膜细胞接种于48孔板，在成骨诱导8 d后，弃去培养液，PBS清洗后，加入100 μL细胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100)，37 ℃孵育10 min。取50 μL样品与50 μL pNPP (1 g/L)混合，37 ℃振荡15 min后，加入25 μL 3 mol/L NaOH终止反应。选择 405 nm波长的酶标仪检测吸光度值，用BCA法测定蛋白浓度。每组设3个复孔。

茜素红染色及定量：取第4代牙周膜干细胞和牙周膜细胞接种于12孔培养板内，待细胞达到70%-80%融合时，成骨诱导21 d。用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，双蒸水洗细胞2次，每次5 min。加入40 mmol/L茜素红染液(pH 4.1) 0.5 mL覆盖细胞，37 ℃染色20 min。双蒸水洗细胞4次，每次5 min，倒置荧光显微镜下观察结果并拍照。拍照后去除残留的双蒸水，加入400 μL 10%冰醋酸，室温振荡 30 min，收集细胞及上清，转移至1.5 mL EP管中。剧烈振荡30 s后，加入250 μL矿物油覆盖样品，加热至85 ℃ 10 min，冰上冷却5 min。取250 μL上清至新的1.5 mL EP管，加入100 μL 10%氨水充分中和后，选择405 nm波长的酶标仪检测吸光度值。

主要观察指标： ①细胞免疫荧光染色定位PTH1R在细胞中的位置。②荧光定量PCR检测并比较两种细胞诱导前后目的基因的表达量。③成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性。④成骨诱导后矿化结节形成情况。

统计学分析：应用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本研究通过细胞免疫荧光染色法首次明确了PTH1R在牙周膜干细胞中主要位于细胞膜与细胞浆内，在细胞核内较少，与牙周膜细胞及MG63细胞无明显差异^[17]。PTH1R在不同的细胞中分布的位置有所不同，在成骨细胞和骨细胞的胞浆及细胞膜上呈不连续分布，与牙周膜干细胞中PTH1R的分布具有相似性^[18]。PTH1R是一种经典的G蛋白偶联受体，在细胞核内的位置参与决定了G蛋白偶联受体的功能。核膜上的G蛋白偶联受体可以通过调节细胞内钙离子浓度间接介导基因调控，例如代谢型谷氨酸受体。并且细胞内不同位置的代谢型谷氨酸受体可以调控不同的信号通路^[19-20]。核质内的G蛋白偶联受体则可以直接参与基因调控。Pickard等^[21]在成骨细胞系中发现PTH1R主要位于核质而非核膜上，并且其表达与细胞周期相关，在G₀/G₁、S、G₂期及分裂末期出现，可能与DNA及其他转录活动相关，这提示PTH1R可能通过进入核内直接调控基因转录。不同位置的同一受体可以启动不同的信号通路，而PTH1R被激活后，可以启动包括PKA、PKC及Wnt在内的多条信号通路^[22-24]。作者推测不同位置PTH1R可能与不同的信号通路相关，这将是课题组下一步的研究方向。

实验应用荧光定量PCR从基因水平对PTH1R表达进行检测。结果显示大剂量甲状旁腺激素(1-34)短时间作用前后，牙周膜干细胞与MG63细胞的PTH1R表达量明显升高，而牙周膜细胞则无明显变化。提示牙周膜干细胞中的PTH1R对甲状旁腺激素(1-34)的敏感性更高，可能与其结合能力也更高。Abuduwali等^[13]发现，牙周膜细胞中的PTH1R对甲状旁腺激素(1-34)的结合能力和敏感性都低于MG63细胞。PTH1R与甲状旁腺激素的结合能力和细胞的种类相关，与年龄无关^[25-26]。细胞上PTH1R 的数量与年龄呈负相关^[27]。当不同的甲状旁腺激素片段与PTH1R结合后，可导致PTH1R活化程度发生变化，从而引起不同的信号传导和活化后级联反应^[11^，^28]。作为B类G蛋白偶联受体，PTH1R具有3个保守的二硫键N-末端胞外域(ECD)和7个跨膜螺旋的C末端结构域^[29]。本研究中使用的甲状旁腺激素(1-34)片段几乎拥有全部甲状旁腺激素片段的功能^[30]。甲状旁腺激素的N末端的片段即甲状旁腺激素(1-14)残基可以与PTH1R的跨膜区域低亲和力地结合，但可以激活受体。而C末端片段即甲状旁腺激素(15-34)可以和受体的N端胞外结构域高亲和力、特异性的结合^[31-32]。因此，甲状旁腺激素(1-34)与PTH1R结合的亲和力是由其N端胞外结构决定的^[31]。另外有研究发现，甲状旁腺激素作用时间和剂量的不同可以导致促进成骨和抑制成骨两方面的作用，而其中的机制仍有待研究^[33-34]。原发性甲状旁腺功能亢进患者牙槽骨改建明显，甲状旁腺激素(1-34)的全身用药可以预防因牙周炎引起的牙槽骨骨丧失^[35]。这些研究都表明甲状旁腺激素(1-34)在预防和治疗牙槽骨丧失方面的广阔应用前景，因此对PTH1R的研究显得尤为重要。

甲状旁腺激素主要通过激活PTH1R后启动信号通路发挥生物学效应，影响骨的形成与改建^[36]。牙周膜干细胞的PTH1R表达量明显高于牙周膜细胞，与MG63细胞相近。而且牙周膜干细胞比牙周膜细胞具有更强的矿化能力，提示牙周膜干细胞具有与成骨细胞相类似的特性。同时，牙周膜干细胞中PTH1R的表达量在成骨诱导后升高。研究表明，地塞米松在促进骨髓间充质干细胞成骨分化的同时提高了PTH1R的表达量，说明成骨诱导液促进牙周膜干细胞表达PTH1R可能正是由地塞米松介导^[14^，^37]。采用牙周膜干细胞作为种子细胞进行牙周组织工程重建，可以恢复完整的牙周组织结构，实现真正意义上牙周组织的再生与重建^[38-40]。另外，牙周膜干细胞在生物支架上有很强的增殖分化能力，在成骨诱导下可以分化为成骨细胞，表明牙周膜干细胞作为骨组织再生学的种子细胞的优越性^[41]。本研究发现牙周膜干细胞比牙周膜细胞具有更强大的成骨能力，更加符合组织工程学种子细胞的要求。但是如何简便高效地获取大量牙周膜干细胞仍有待研究。

本研究首次鉴定了PTH1R在牙周膜干细胞中的表达，证实牙周膜干细胞上PTH1R的表达量以及对甲状旁腺激素(1-34)的敏感性都明显高于牙周膜细胞。成骨诱导促进牙周膜干细胞成骨分化的同时提高了PTH1R的表达量。牙周膜干细胞比牙周膜细胞有更强的成骨分化能力，并且这种能力与PTH1R的表达量呈正相关，提示PTH1R可以作为检验细胞成骨能力的一项指标。牙周膜干细胞可以作为种子细胞参与牙槽骨组织再生，治疗牙周炎。

牙周膜干细胞与牙周膜细胞甲状旁腺激素受体表达的比较

Quantitative comparison of parathyroid hormone 1 receptor between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.