自体骨髓间充质干细胞载体复合物修复骨缺损的组织学观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.012

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 891-897.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.012

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

自体骨髓间充质干细胞载体复合物修复骨缺损的组织学观察

韩操_¹，马宁2，李忠义1，王正东3，颜南3，朱世龙4

1沈阳医学院附属中心医院骨科，辽宁省沈阳市 110024；2解放军沈阳军区总医院干部病房一科，辽宁省沈阳市 110016；3沈阳医学院，辽宁省沈阳市 110034；4营口开发区第二人民医院，辽宁省营口市 115009

收稿日期:2015-01-06 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 马宁，硕士，主治医师，解放军沈阳军区总医院干部病房一科，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:韩操，男，1981年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2007年中国医科大学毕业，硕士，主要从事骨组织工程方面的研究。

Autogenous bone marrow mesenchymal stem cells carrier complex for bone defect repair: a histological observation

Han Cao1, Ma Ning2, Li Zhong-yi1, Wang Zheng-dong3, Yan Nan3, Zhu Shi-long4

1Department of Orthopedics, Fengtian Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 2First Cadre Ward, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China; 4Second People’s Hospital of Yingkou Development Zone, Yingkou 115009, Liaoning Province, China

Received:2015-01-06 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Ma Ning, Master, Attending physician, First Cadre Ward, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Han Cao, Master, Department of Orthopedics, Fengtian Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：在骨缺损修复过程中，从修复质量、免疫排斥和疾病传播等多方面来衡量，自体骨都是最佳的选择，但来源有限且取骨区可能产生并发症，给骨缺损的修补及自体骨移植临床应用带来了很大局限。
目的：以含自体骨髓间充质干细胞脱钙骨载体复合支架材料植入骨缺损的同时，向植入处微环境内添加碱性成纤维细胞生长因子等因素，从而达到增强骨修复能力，改进修复效果的目的。
方法：选择3月龄新西兰大耳白兔45只，建立双侧前臂桡骨中下段骨-骨膜缺损模型，然后将实验兔等分为3组：实验组、对照组和空白组，均于左侧髂骨和股骨转子处抽取骨髓，分离培养扩增骨髓间充质干细胞后，与不同材料体外复合，植入兔桡骨干10 mm缺损处。实验组兔缺损处植入骨髓间充质干细胞、脱钙骨、藻酸钙、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C；对照组兔缺损处植入骨髓间充质干细胞、脱钙骨、藻酸钙；空白组兔双侧缺损处均不植入任何材料，自然愈合。
结果与结论：植入后30，60，90 d各组之间组织学检查新骨生成速度、生成量差异均有显著性意义。实验组兔缺损修复部位骨痂和移植物化骨及材料降解明显快于对照组和空白组；但对照组和空白组兔缺损修复部位残存物明显多于实验组。实验组兔骨缺损以多点方式直接成骨，对照组和空白组则从两端以“爬行替代”方式成骨。空白组兔自然愈合后90 d骨缺损均无愈合。说明植入体外培养移植物的同时向该植入微环境添加碱性成纤维细胞生长因子和维生素C等有利骨修复，提高骨损伤的愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 骨缺损, 骨髓间充质干细胞, 脱钙骨, 藻酸钙, 碱性成纤维细胞生长因子, 维生素C, 载体复合物, 微环境

Abstract:

BACKGROUND: Autogenous bone is the best choice for the repair of bone defects from the aspects of repair quality, immune rejection and disease transmission, but the limited sources and complications after bone collection bring a big limitation for bone defect repair and clinical application of autogenous bone graft.
OBJECTIVE: To repair the bone defects with demineralized bone carrying autologous bone marrow mesenchymal stem cells and meanwhile to inject basic fibroblast growth factor and other factors into the micro-environment at the implant site, in order to enhance bone repair capacity and improve the repair effect.
METHODS: Forty-five New Zealand white rabbits at an age of 3 months were selected to establish bone defect models (the lower segment of bilateral forearm bone-periosteum), and then, the animals were divided into three groups: experimental, control and blank groups. Bone marrow samples were extracted from the left iliac bone and femoral trochanter. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured and amplified followed by co-cultured with different materials in vitro, and then, the composite scaffolds were implanted to the bone defects of the radial shaft. In the experimental group, bone marrow mesenchymal stem cells, demineralized bone, calcium alginate, basic fibroblast growth factor, vitamin C were implanted; in the control group, bone marrow
mesenchymal stem cells, demineralized bone, calcium alginate were implanted; in the blank group, nothing was implanted.
RESULTS AND CONCLUSION: At 30, 60, 90 days after implantation, there were significant differences in the new bone formation rate and new bone amount between different groups. The bone formation speed and material degradation speed were significantly faster in the experimental group than the control and blank groups, while the amount of remnants at the defect region was larger in the latter two groups. Multi-point bone formation was visible in the experimental group, while “creeping substitution” was found in the control and blank group. At 90 days after implantation, bone defects were not healed in the blank group undergoing natural healing. These findings indicate that co-transplantation of bone graft and basic fibroblast growth factor and vitamin C is beneficial to bone repair and improves bone defect healing.

全文链接：

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Radius, Fibroblast Growth Factor 2

中图分类号:

R394.2

韩操，马宁，李忠义，王正东，颜南，朱世龙. 自体骨髓间充质干细胞载体复合物修复骨缺损的组织学观察[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 891-897.

Han Cao1, Ma Ning2, Li Zhong-yi1, Wang Zheng-dong3, Yan Nan3, Zhu Shi-long4. Autogenous bone marrow mesenchymal stem cells carrier complex for bone defect repair: a histological observation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 891-897.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析所有实验兔均进入结果分析，无脱失。实验流程见图3。

2.2 大体观察结果全部动物均成活，切口无感染，伤口一期愈合。①实验组：植入后30 d，材料表面及缺损区骨痂明显增多，其中2只兔桥接部与两骨断端愈合，周围组织反应明显减轻。60 d时，材料为骨痂包裹，有3只兔桥接部与两骨断端愈合，骨缺损区有大量骨痂，周围未见明显组织反应。90 d时，均达到骨性愈合。②对照组：植入后30 d材料表面和缺损区有少量骨痂形成大部分为纤维连接。且周围组织反应较明显。60 d时，骨痂量增多，但与实验组相比量较少，周围组织反应减轻。90 d时，骨痂量明显增多，周围组织反应不明显。③空白组：植入后90 d缺损区为纤维组织充填，未见骨痂生长。

2.3 桡骨组织形态在实验组和对照组兔桡骨缺损植入脱钙骨载体复合物后，植入后30 d骨缺损区与移植物交界处可见致密结缔组织、透明软骨、类骨质和骨质，并见复合物支架降解残留物，其中实验组残存复合物明显少于对照组，且各时间点的新生骨较对照组多而快。随植入修复时间的延长，60，90 d类骨质和骨质均逐渐增多，并可见密质骨(骨皮质)及含有多少不等骨小梁和骨髓的骨髓腔等结构。空白组骨缺损部位则多为致密纤维结缔组织。

实验组兔修复30 d后，新生骨呈孔大的骨小梁网状明显多于对照组；载体复合物降解残存物空白组最多，实验组最少；60 d时实验组兔新生骨已形成，60 d时骨髓腔内骨小梁多于对照组，特别是90 d密质骨可见较清楚的数层外环骨板，表面可见成骨细胞排列，在内外环骨板间明显可见含血管的哈氏管及环绕呈同心圆状的哈氏板，骨细胞和骨胶纤维均多有规则分布，亦可见较多粗、细不等骨小

梁和骨髓。对照组兔桡骨虽已形成有髓腔的密质骨，但骨小梁明显少于实验组，不成熟骨质较多，哈氏骨板未形成，多见不规则骨细胞。空白组兔骨形成效果明显不如对照组(图4)。即实验组骨缺损以多点方式直接成骨，对照组和空白组则从两端以“爬行替代”方式成骨。

植入后30，60，90 d三组兔组织学评分和骨陷窝计数差异有显著性意义(P < 0.05；表1，2)。

参考文献

[1] 郭宜姣,李文华.骨缺损修复生物工程研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(8):988-993.
[2] 张志宏,刘志礼,高志增,等.骨修复替代材料修复骨缺损的选择与应用[J].中国组织工程研究,2012,52(16):9836-9843.
[3] Riggenbach MD, Jones GL, Bishop JY. Open reduction and internal fixation of clavicular nonunions with allograft bone substitute. Int J Shoulder Surg. 2011;5(3):61-67.
[4] Kajdaniuk D, Marek B, Foltyn W, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - part 2: in endocrinology and oncology. Endokrynol Pol. 2011;62(5):456-464.
[5] 曾宪利,杨春露.修复临界节段性骨缺损：组织工程骨支架形态及对种子细胞负载有效性的影响[J].中国组织工程研究,2014, 18(29):4717-4723.
[6] 师彬,杨武斌,王平.骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞的研究现状[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(19):228-231.
[7] 陈佳滨,李强,茹嘉,等.腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察[J].中国骨质疏松杂志, 2014,20(8):869-874.
[8] 徐斌,周亮,王英明,等.同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养：与同腔软骨性状的对比[J].中国组织工程研究, 2014,18(8):1165-1171.
[9] Bai Y, Yin G, Huang Z, et al. Localized delivery of growth factors for angiogenesis and bone formation in tissue engineering. Int Immunopharmacol. 2013;16(2):214-223.
[10] Bai Y, Yin G, Huang Z, et al. Localized delivery of growth factors for angiogenesis and bone formation in tissue engineering. Int Immunopharmacol. 2013;16(2):214-223.
[11] 谭志军,陈艳,张翠萍,等.微小RNA调控骨髓间充质干细胞分化的研究进展[J].中华实验外科杂志,2014,31(6):1389-1390.
[12] 邢承忠,洪晶,顾绍峰,等.兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[J].中国医科大学学报,2008,37(1):4-6.
[13] 李进,郑冬,杨述华.同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程载体的实验研究[J].华中科技大学学报(医学版),2005,34(4):465-468.
[14] 雷鸣,刘世清,刘宇兰,等.藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2008, 12(19): 3659-3662.
[15] 李东亚,郑欣,邱旭升,等.新西兰兔桡骨骨缺损动物模型的制作[J].中华实验外科杂志,2013,30(9):2012.
[16] Zhang M, Wang GL, Zhang HF, et al. Repair of segmental long bone defect in a rabbit radius nonunion model: comparison of cylindrical porous titanium and hydroxyapatite scaffolds. Artif Organs. 2014;38(6):493-502.
[17] 张屹,陈建常,史振满.异种骨支架及其衍生材料治疗骨缺损的研究现状与进展[J].中国矫形外科杂志,2014,22(14):1277-1279.
[18] 黄旋平,谢庆条,江献芳,等.慢病毒载体介导的基因治疗在骨缺损修复中的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2014,22(14): 1284-1287.
[19] Lyons FG, Gleeson JP, Partap S, et al. Novel microhydroxyapatite particles in a collagen scaffold: a bioactive bone void filler? Clin Orthop Relat Res. 2014;472(4): 1318-1328.
[20] Tyndall A. Application of autologous stem cell transplantation in various adult and pediatric rheumatic diseases. Pediatr Res. 2012;71(4 Pt 2):433-438.
[21] Huang LF, Li R, Liu WG, et al. Dynamic culture of a thermosensitive collagen hydrogel as an extracellular matrix improves the construction of tissue-engineered peripheral nerve. Neural Regen Res. 2014;9(14):1371-1378.
[22] 代志鹏,许伟华,杨述华,等.人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究[J].中国矫形外科杂志,2014,22(15): 1402-1407.
[23] 杨武斌,王平,师彬.骨髓间充质干细胞的成骨性诱导[J].中华中医药学刊,2014,32(9):2158-2160.
[24] Chen WC, Yao CL, Wei YH, et al. Evaluating osteochondral defect repair potential of autologous rabbit bone marrow cells on type II collagen scaffold. Cytotechnology. 2011;63(1): 13-23.
[25] Getgood AM, Kew SJ, Brooks R, et al. Evaluation of early-stage osteochondral defect repair using a biphasic scaffold based on a collagen-glycosaminoglycan biopolymer in a caprine model. Knee. 2012;19(4):422-430.
[26] McBane JE, Sharifpoor S, Cai K, et al. Biodegradation and in vivo biocompatibility of a degradable, polar/hydrophobic/ionic polyurethane for tissue engineering applications. Biomaterials. 2011;32(26):6034-6044.
[27] 马立坤,叶鹏,邓江,等.丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价[J].西部医学,2014,26(8): 975-977.
[28] 耿海霞,封伟,钱君荣,等.羟基磷灰石-凝胶支架复合成骨细胞修复兔颅骨缺损的组织学评价[J].临床口腔医学杂志,2014,30(9): 519-521.
[29] 胡金龙.组织工程学技术治疗骨缺损的最新研究进展[J].中国矫形外科杂志,2013,21(2):150-153.
[30] 孙翊夫,康明阳,候婷婷,等.BMP-2和VEGF在大鼠骨缺损修复过程中的表达和意义[J].临床和实验医学杂志,2014,13(6): 432-435.
[31] 郑军,汤伟忠,齐新生.新型双相钙磷陶瓷复合骨形态发生蛋白及碱性成纤维细胞生长因子修复兔骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(42):7791-7794.

引言

创伤、炎症、肿瘤及人工关节翻修手术等导致的骨缺损是目前骨科临床的常见病和难治病，传统的治疗方法是通过骨移植进行修复，包括自体骨、异体骨、异种骨和人工骨材料^[1-2]。随着组织工程学的迅速发展，通过对种子细胞进行基因修饰、构建复合支架材料及促进组织工程骨早期血管化等方法，使应用组织工程技术治疗骨缺损成为目前研究的热点并逐渐在临床上广泛开展。理想的骨组织工程修复材料应该具备以下特点^[3-5]：①良好的生物相容性、组织相容性，对宿主无或少有不良反应。②生物可吸收性好，能够在较短时间内促进成骨细胞生长或分化，在体外培养体系中具有较强的增殖传代能力。③植入机体后能适应受区环境，生物毒性小，免疫活性低，致瘤性低。④成本较低，修复手段简单。由于单一材料的自身缺陷和不足，近年来，很多复合材料开始混合应用，以便弥补各自材料的不足，并具有与自体骨缺损的修复能力，在此基础上添加各种生物因子或细胞因子，促进骨再生和骨愈合^[6]。

组织工程研究使用种子细胞与可降解支架材料或自体骨符合材料联合构建出具有生物活性的骨移植修复材料，许多学者将几种材料按一定比例复合后用于骨修复，复合材料不但能保证足够的强度而且能有效地结合种子细胞和生长因子，有利于组织工程骨的构建。陈佳滨等^[7]用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2及增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓基质干细胞，种植脱钙骨支架体外构建组织工程骨，骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均黏附率较高，扫描电镜见转染细胞生长良好，伸出丝状突起，相互连接，说明转染后的细胞种植于脱钙骨支架材料后生长状况良好，组织工程骨构建成功。徐斌等^[8]发现骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨，关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。人骨髓间充质干细胞作为最实现性的细胞源，将在软骨组织工程的研究及应用中发挥重要的作用，理想的支架材料在种子细胞修复软骨缺损中起到事半功倍的作用^[9-10]。虽然骨髓间充质干细胞复合现有支架材料仍存在许多问题，但骨髓间充质千细胞复合自体脱钙骨基质，成软骨诱导促进软骨缺损的修复，因其良好的稳定性与免疫学性能，值得临床推广。

虽然很多实验研究不断取得成果，但在提高骨缺损修复效果上依然有缺陷，作者拟采用体外培养扩增的新西兰大耳白兔骨髓间充质干细胞作为细胞来源，脱钙骨-藻酸钙复合支架作为细胞载体，并在细胞复合材料基础上填加碱性成纤维细胞生长因子和维生素C，对兔桡骨进行骨缺损修复，观察其修复效果，为提高骨修复效果研究提供一个新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年3月在中国医科大学及沈阳医学院附属中心医院手外科完成。

材料：

兔桡骨缺损修复使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
L-DMEM培养基、胎牛血清	GIBCO公司
L-谷氨酰胺，α-MEM培养基，胰蛋白酶	美国Lonza公司
Ficoll淋巴细胞分离液	天津灏洋公司
藻酸钠	Sigma公司
氯化钙	天津勤达威化工有限公司
维生素C	郑州万瑞达化工产品有限公司
碱性成纤维细胞生长因子	珠海东大公司
NIKE-2000倒置显微镜	日本NIKE公司
LGJ-18冷冻干燥机	北京四环公司
LeicA Q 500IW图像分析仪	德国徕卡公司
WHY-2数显往返水恒温振荡器	江苏大地公司
KDC-40低速离心	科大公司
MCO-15AC孵箱	日本SANYO公司
JT-Z4型垂直层流式净化工作台	苏州文良科学仪器有限公司
倒置相差显微镜	O1ympus公司

动物：清洁级新西兰大耳白兔45只，兔龄3个月，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，购于中国医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(辽)2003-0009。饲养环境温度维持在(20±2) ℃，分笼饲养，标准饲料，自由摄水，12 h交替照明。实验经过中国医科大学动物伦理学委员会的批准，实验符合动物伦理学的要求。

方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定：新西兰大耳白兔称质量后用氯胺酮(2 mL/kg)肌肉注射麻醉，左侧髂后上棘和股骨转子部位皮肤用体积分数75%乙醇消毒，穿刺针旋转刺入髓腔，接5 mL注射器(注射器内预留肝素钠2 000 U)，抽取骨髓液5 mL。缓慢吸出骨髓液混入含肝素的无血清MEM培养基中，1 200 r/min离心8 min，弃上清，无血清培养基培养，吹打混匀。向细胞团加入70%的Percoll分离液，密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min，取含有骨髓间充质干细胞的单核细胞层^[11]，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM中，吹打成单细胞悬液，计数有核细胞，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板中，37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中培养，24 h后，更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞。待培养的细胞相互汇合到90%生长面积时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。通过CD29，CD34，CD44抗原的免疫化学鉴定细胞为骨髓间充质干细胞^[12]。

自体脱钙骨的制备：无菌条件下，取动物双侧桡骨，新鲜骨用双蒸水洗净，氯仿/乙醇(1∶1，体积分数)脱脂4 h，蒸馏水浸洗30 min，脱钙48 h，蒸馏水浸泡2 h，再用氯仿/乙醇脱脂4 h，蒸馏水浸洗30 min(上述处理均在 4 ℃进行)，蒸馏水冲洗3次，蒸馏水多次冲洗至pH为7.0左右为止，用细针在骨表面刺些小孔，抗生素浸泡处理，制备成1 cm长的骨块，冻干后分装密封，用环氧乙烷消毒灭菌备用^[13]。

骨髓间充质干细胞与脱钙骨载体复合物的制备：0.25%胰蛋白酶消化第3代的骨髓间充质干细胞，离心收集后用无血清的MEM配成含2×10¹¹ L^-¹骨髓间充质干细胞的细胞悬液100 μL，将中等黏度的藻酸钠溶液0.1 mL加入到自制的模具中^[14]，加入骨髓间充质干细胞混匀，放入自制的脱钙骨，然后加入过量的CaCl₂，边加入边搅拌，然后静置10 min，将复合物挤入六孔培养板中，吸出过量的CaCl₂，用0.15 mol/L的NaCl清洗两三次(图1)。

动物骨缺损模型的制备与修复：将新西兰大耳白兔称质量后用氯胺酮(2 mL/kg)肌肉注射麻醉。并于耳缘静脉处留置静滴麻药(250 mL生理盐水+氯胺酮2-4 mg/kg)。将兔稳妥固定在手术台上，双侧前肢剪毛并术区消毒，铺巾麻醉后取前肢桡骨中段切口，长2.5 cm左右。逐层切开后，暴露桡骨中段，切开骨膜后，以桡骨中段处曲度最大处为标记，游标卡尺测量长度，断端尽量平整，在距离腕关节 2 cm处用直径为1 mm的钻头在桡骨上转一小孔，然后在距离此点1 cm处同样转一小孔，不平整者以小咬骨钳修整，制成骨-骨膜缺损模型(图2)^[15-16]。

动物分组及组织工程材料的植入：藻酸钠溶液(0.1 mL)中混有碱性成纤维细胞生长因子和维生素C，其浓度分别为20 mg/L和10 mmol/L。将造模成功的动物等分为3组：实验组、对照组和空白组，各15只。生理盐水冲洗骨屑，将预制的复合材料植入到骨缺损处，不做内固定，分层缝合伤口，不给予外固定。实验组兔桡骨缺损处植入骨髓间充质干细胞/脱钙骨/藻酸钙/碱性成纤维细胞生长因子/维生素C复合物。对照组兔缺损处植入骨髓间充质干细胞/脱钙骨/藻酸钙复合物。空白组兔自然愈合不植入任何材料。植入后肌注80×10⁴ U青霉素肌注。

取材：于植入后30，60，90 d。每组各处死5只动物，将组织工程化骨或生物衍生骨材料连同周围组织、两端桥接部5 mm宿主骨一起取下，进行不同指标标本的制备。

大体观察：了解动物植入后进食、切口愈合情况，并于植入后30，60及90 d分别取出骨修复标本，观察复合物表面变化，周围组织反应，骨痂形成，骨缺损的修复情况。

组织学观察：将兔织工程化骨或生物衍生骨材料，各切成3段(远近端各一段和移植物段)，用甲醛固定、石蜡包埋、连续切片(厚7 μm)，常规苏木精-伊红染色，中性树胶封固。倒置显微镜观察。每份标本随机抽取4张切片，根据改良Nilsson骨缺损组织形态学评分标准随机进行评分^[4]：最大得分为12分，分数越高，愈合越好。采用倒置相差显微镜观察不同时间点骨片上吸收陷窝的变化，并对同一位置的吸收陷窝进行摄影，进行图像分析。分别于不同时间点每组各取3张照片，计算骨片上吸收陷窝的数量。

主要观察指标：植入后桡骨形态以及桡骨解剖组织学形态。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包(美国SPSS公司)对所有数据进行配对t 检验，实验数据以x(_)±s表示， P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

临床上对于骨缺损的治疗从截肢，自体骨、异体骨移植，到目前的生物活性材料、骨组织工程、基因工程治疗，依然没有能够彻底进行骨缺损修复的方法，这也一直是医学界关注和研究的热点。究其原因一方面是因为各种方法的技术水平还不完善如手术时间和方法掌握，生物活性材料的制作等，另一方面是因为骨缺损的局部反应较复杂如骨髓损伤较重，血运较差，断端存在的硬化反应等以及传统治疗后的并发症较多如免疫排斥较重，成骨作用不良，骨折不愈合，神经损伤长期引发的疼痛等，这些原因都在不同程度的制约骨缺损研究的前进^[17-18]。只有从骨的修复与生长机制出发，联合应用多种方法，相互补其不足，从中找到突破点，才能完善骨缺损修复，缩短治疗时间，提高患者的生活质量。

骨组织工程的研究主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子和组织工程骨的构建等研究^[19]。种子细胞是骨组织工程研究最基本的问题，其中骨髓骨髓间充质干细胞作为组织工程骨的种子细胞，不但具有广阔的临床应用前景，而且也是当前最为理想的种子细胞。骨髓间充质干细胞作为种子细胞有很多优点：来源方便、取材简单、增殖分化能力强，同种异体骨髓内干细胞移植不发生或只发生程度很轻微的免疫排斥反应，因此适应临床应用的需要^[20-21]。骨髓间充质干细胞的成骨分化及可以增殖分化为成骨细胞是其目前应用于骨缺损修复细胞来源的关键。杨述华等^[22]发现从人骨髓中高效分离和扩增骨髓间充质干细胞，生物学性状稳定，具有成骨分化潜能，为骨组织工程提供理想的种子细胞，同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。杨武斌等^[23]证实全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用，所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。基于骨髓间充质干细胞的特性以及多向分化潜能，体外可诱导分化为成骨细胞，采用组织工程学技术可在体外构建骨组织工程支架。

在骨修复支架材料领域，主要使用成骨细胞以及与细胞相关因子等构建的体系^[24-25]，主要材料有可降解高分子材料，包括聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸和聚乳酸的共聚物等；陶瓷类材料，包括多孔羟基磷灰石、磷酸三钙等；复合材料以及生物衍生材料^[26]。马立坤等^[27]发现兔骨髓间充质干细胞在丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架材料上黏附、生长良好，分裂增殖活跃，细胞毒性分级均为0级，细胞增殖活力随着时间增加，细胞在支架增殖速度增快，扫描电镜观察发现细胞培养7 d后生长良好，分裂正常，与支架材料黏附紧密，支架材料对细胞无毒性，具有很好的细胞相容性。耿海霞等^[28]将羟基磷灰石/凝胶支架复合物与成骨细胞联合培养，制备兔颅顶骨骨缺损模型，发现随着时间的推移，羟基磷灰石/凝胶支架组复合成骨细胞逐步出现降解并有新生骨小梁产生，材料密度降低。认为羟基磷灰石/凝胶支架复合成骨细胞在兔颅骨缺损中可取得较好的修复效果。

生长因子是一种多肽类物质，具有传递信息、调节功能，在细胞因子参与下能刺激或抑制细胞分裂、分化及基因传达，各种种子细胞需在适当的生长因子等因素的调控和参与下才能获得良好的生物活性，骨髓基质中含有多种生长因子，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、类胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ、血小板衍生生长因子、碱性和酸性成纤维生长因子等^[29]，可调节骨髓间充质干细胞分裂增殖和分化并改变细胞产物的合成而作用于骨形成过程。孙翊夫等^[30]验证发现骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子在骨缺损断端和周围区域表达较缺损中心多，持续添加外源性骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子有助于骨缺损的修复。郑军等^[31]实验验证复合骨形态发生蛋白及碱性成纤维细胞生长因子的新型双相钙磷陶瓷(1∶1)促进骨缺损修复的作用，认为双相钙磷陶瓷复合骨形态发生蛋白及碱性成纤维细胞生长因子在体内有较强的成骨活性，可以促进骨缺损的修复，碱性成纤维细胞生长因子与骨形态发生蛋白合用可以加快新骨的形成。

本实验采用上述骨组织工程修复支架材料，一方面通过动物实验体外培养获取理想的骨种子细胞，并制备脱钙骨复合物，添加藻酸钠及细胞因子碱性成纤维细胞生长因子和维生素C，拟改善此复合物植入骨缺损局部微环境内的有利于修复骨缺损的因素，提高骨修复效果。实验制备大鼠桡骨缺损，实验组兔缺损处植入骨髓间充质干细胞、脱钙骨、藻酸钙、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C；对照组兔缺损处植入骨髓间充质干细胞、脱钙骨、藻酸钙；空白组兔不植入任何材料，通过组织学评价缺损处的修复效果，结果表明3组虽然实验条件不同但是骨缺损修复均经纤维组织、软骨组织和类骨质逐渐形成骨质和骨密质，成骨细胞均有不同程度的增加，实验组与对照组兔骨缺损均植入骨髓间充质干细胞混合脱钙骨载体复合物，但实验组新生骨增殖快于对照组，骨缺损周围的修复效果较好，可能由于实验组兔骨缺损微环境内填加外源性碱性成纤维细胞生长因子和维生素C所致，因此表明体外载体复合物植入骨缺损的同时改善或增加该微环境内的有利于骨修复的因素可能是提高骨修复的一个重要因素。但由于观察时间有限，不能确定其远期效果，且尚未真正的应用于临床，实际上无论是体外培养还是植入体内的复合物都在体液调节下为骨损伤修复创造条件，不过是体内的体液调节更为复杂而已，体外培养无论取得如何完善的种子细胞复合物抑或是培养成功的骨组织，植入体内能否获得骨修复成功，主要与植入局部的微环境条件有关，为此本实验试图用含自体骨髓间充质干细胞-脱钙骨-藻酸钙复合支架材料植入骨缺损的同时，向植入处微环境内填加碱性成纤维细胞生长因子和维生素C，通过免疫组织细胞学观察效果明显。

由于种子细胞与生物材料的良好年度是进行组织构建的首要条件，种子细胞在生物材料上分布不均，易导致体内体外构建的组织形式不良而失败。因此作者认为，支架材料与种子细胞的研究应该协调一致，除了满足支架材料的基本要求外，其降解速率与新骨形成应协调一致，今后应致力于构建带有三维血管系统的组织工程骨为新生组织提供充足营养。

自体骨髓间充质干细胞载体复合物修复骨缺损的组织学观察

Autogenous bone marrow mesenchymal stem cells carrier complex for bone defect repair: a histological observation

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.